兒童良性癲癇伴中央顳區(qū)棘波放電患者的GRIN2A突變篩查及遺傳特征分析

劉曉蓉， 黃 丹， 賴錦星， 余 璐， 孫 輝， 江孝建， 汪 潔， 廖衛(wèi)平， 黎冰梅

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兒童良性癲癇伴中央顳區(qū)棘波放電患者的GRIN2A突變篩查及遺傳特征分析

劉曉蓉， 黃 丹， 賴錦星， 余 璐， 孫 輝， 江孝建， 汪 潔， 廖衛(wèi)平， 黎冰梅

目的 對兒童良性癲癇伴中央顳區(qū)棘波放電(BECTS)患者進行GRIN2A基因突變篩查，分析其在BECTS患者中的致病性和遺傳特征。 方法 收集2012年6月～2014年12月期間我院診斷的BECTS患者，采用PCR擴增和一代測序方法篩查GRIN2A基因突變。結果 在收集的53例BECTS患者中，發(fā)現(xiàn)4例存在GRIN2A雜合突變，其中1例患者同時具有2個GRIN2A基因突變位點。突變包括4個錯義突變(c.2627T>C，p.I876T；c.1341T>A，p.N447K；c.4322C>A，p.T1441N；c.1271C>T，p.P424L)和1個剪切位點突變(c.415-38C>T)，且均為未見報道的新突變位點。除c.1271C>T為新生突變、c.1341T>A未能驗證突變來源外，其余3個突變均為遺傳性突變。突變率為7.5%，外顯率為75%。經(jīng)保守性分析，發(fā)生錯義突變的氨基酸變化位點均為高度保守。結論 GRIN2A可能是BECTS的致病基因。GRIN2A突變存在不完全外顯，臨床進行遺傳咨詢時應引起高度重視。

伴中央顳區(qū)棘波的兒童良性癲癇； GRIN2A； 基因型； 表型

兒童良性癲癇伴中央顳區(qū)棘波放電 (benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes，BECTS)，又稱Rolandic癲癇，是一種常見的兒童遺傳性局灶性癲癇，占兒童癲癇的15%～24%[1]。

近年來研究表明：在包括BECTS在內(nèi)的中央顳區(qū)棘波放電癲癇譜系患者中，存在離子型N-甲基D-天門冬氨酸受體2A基因(glutamate receptor，ionotropic，N-methyl D-aspartate 2A，GRIN2A)基因突變，而后者很可能是BECTS的致病基因[2～4]。 目前尚未見有關中國BECTS患者GRIN2A基因突變的研究報道。本研究中，我們首次對中國漢族BECTS患者進行GRIN2A基因突變篩查，分析其突變及遺傳特點，以探討GRIN2A在BECTS中致病性。

1 研究對象和方法

1.1 研究對象 收集2012年6月～2014年12月期間在廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院癲癇?？凭驮\的中國漢族BECTS患者。根據(jù)Tsai的描述[5]和ILAE-1989有關癲癇和癲癇綜合征分類[6]進行BECTS的診斷，具體標準為：(1)起病年齡為2～14歲。(2)癲癇發(fā)作類型為部分性發(fā)作(包括單純部分性和復雜部分性發(fā)作)，或繼發(fā)全身強直陣攣發(fā)作，發(fā)作與睡眠關系密切，多于入睡后不久和清晨將醒時發(fā)作。(3)體格檢查無明顯神經(jīng)系統(tǒng)局灶性體征。(4)腦電圖背景活動正常，單側或雙側中央-中顳區(qū)局限性棘波或尖波放電，睡眠期放電增多。(5)影像學檢查未見與癲癇相關的結構性損害。(6)抗癲癇藥物治療有效，預后好。

1.2 GRIN2A基因突變篩查 在獲得患者或監(jiān)護人知情同意后用EDTA抗凝管采集患者靜脈血4 ml，采用美國基因技術有限公司提供的QuickGene-610L及QuickGene mini80基因組DNA快速提取試劑盒抽提DNA。根據(jù)Ensemble檢索(http：//asia.ensembl.org)的基因序列設計GRIN2A基因外顯子PCR引物設計(見表1)。用PCR方法對GRIN2A基因全部外顯子擴增。而后用AppliedBiosystems-3730XL測序分析儀測序，并使用Vector_NTI_v8.0生物學軟件進行數(shù)據(jù)分析，確定有無基因變異。同時以100個健康體檢的正常人做對照，以確定所發(fā)現(xiàn)的基因變異是否為基因突變。

2 結 果

共收集53例BECTS患者，其中男性35例，女性18例。經(jīng)過基因篩查，發(fā)現(xiàn)4例患者存在5個GRIN2A基因的雜合突變(見圖1)，突變率為7.5%(4/53)。突變位點包括4個錯義突變(c.1271C>T，p.P424L，c.1341T>A，p.N447K；c.2627T>C，p.I876T；c.4322C>A，p.T1441N)和1個剪切突變(c.415-38C>T)。其中c.4322C>A和c.1271C>T 為同一患者中具有的兩個突變位點。在4個錯義突變中，c.1271C>T(p.P424L)和c.1341T>A(p.N447K)位于GRIN2A蛋白的N末端，而c.2627T>C(p.I876T)和c.4322C>A(p.T1441N)位于GRIN2A的C 末端。經(jīng)查詢?nèi)祟惢蛲蛔償?shù)據(jù)庫(http//www.Hgmd.cfac.uk/ac/index.php)，上述突變點均為國內(nèi)外首次報道新突變。且在100例正常對照中未發(fā)現(xiàn)上述變異。經(jīng)氨基酸的蛋白保守性分析表明：I876、N447、T1441、P424氨基酸區(qū)域均為保守(見圖2)。

表1 GRIN2A 基因PCR擴增引物(轉錄本號：NM_000833.4)

表2 具有GRIN2A基因突變的BECTS患者的臨床特征

SPS：simple partial seizure，單純部分性發(fā)作；GTCS：generalized tonic-clonic seizure，全面性強直陣攣發(fā)作；sGTCS，：secondary generalized tonic-clonic seizure，繼發(fā)性全面性強直陣攣發(fā)作；BECTS：benign childhood epilepsy with central-temporal spike，良性兒童癲癇伴中央顳區(qū)棘波放電；FS：febrile seizure，熱性驚厥；ADHD：attention-deficit hyperactivity disorder，注意力缺陷多動癥；+：陽性；-：陰性

具有GRIN2A突變患者的臨床特征(見表2)。4例患者均為男性。平均起病年齡為6.42歲(2歲3個月～10歲)，4例患者均有強直-陣攣發(fā)作。除具有雙突變的患者(P3)有輕度的智能障礙外，其余患者的智力均正常。在4例患者中，3例患者曾被診斷為注意力缺陷多動障礙。僅1例患者(P4)有熱性驚厥和BECTS家族史，其余3例患者在臨床上均表現(xiàn)為散發(fā)(見圖2)。3例患者(P1～P3)表現(xiàn)為雙側中央-中顳局灶性癲癇樣放電，僅1例(P4)為單側放電。2例患者腦電圖表現(xiàn)為慢波睡眠期電持續(xù)狀態(tài)。另2例患者除局限性癲癇樣放電外還表現(xiàn)為清醒期和睡眠期陣發(fā)性彌漫性高幅delta活動。4例患者對抗癲癇藥物反應較好，丙戊酸、拉莫三嗪和左乙拉西坦治療均有效，所有患者均有半年以上無發(fā)作。

從突變來源來看，5個突變位點中，除c.1341T>A(p.N447K)因父母未能抽血而未能驗證突變來源，以及c.1271C>T (p.P424L)為新生突變外，其余3個突變均為遺傳性突變(見圖3)。突變外顯率為75%。

圖1 BECTS患者GRIN2A基因測序圖(WT：野生型；MT：突變型)，箭頭所指處為突變

圖2 GRIN2A的I876T、N447K、T1441和P424L突變位點同源性比較

m/+表示雜合突變，+/+表示不攜帶GRIN2A基因突變。箭頭所示為先證者。BECTS：良性兒童癲癇伴中央顳區(qū)棘波；FS：熱性驚厥

3 討 論

盡管BECTS是兒童期最常見的遺傳性局灶性癲癇，但臨床以散發(fā)病例多見，故對其致病基因的定位和致病機制的研究較為困難。近年來研究發(fā)現(xiàn)部分BECTS中存在GRIN2A基因突變[4]。但目前尚未見中國BECTS癲癇患者中GRIN2A基因突變的報道。本研究通過對中國漢族BECTS患者的GRIN2A基因篩查，首次發(fā)現(xiàn)患者中存在GRIN2A基因突變，且突變位點均為文獻中未見報道新突變。

GRIN2A基因位于16p13.2，是N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptors，NMDAR)的NR2A亞基的編碼基因。NMDAR是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與突觸功能調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)門控離子通道[7]，該受體的功能對神經(jīng)元的興奮性有重要影響。而NR2A亞基是NMDAR的調(diào)節(jié)亞基，廣泛分布與大腦皮質(zhì)及海馬[8]，故可能與癲癇發(fā)作有密切關系。目前研究表明GRIN2A基因突變導致的癲癇綜合征包括：BECTS、不典型良性部分性癲癇、癲癇伴慢波睡眠期持續(xù)放電、Landau-Kleffner綜合征、Lennox-Gastaut綜合征[9]、早發(fā)型癲癇性腦病[10]和不能分類的癲癇伴神經(jīng)發(fā)育異常[4，9，11]。但GRIN2A在不同表型中突變率不同，表型嚴重的患者中的突變率高，表型輕的患者中突變率低，如在嚴重的Landau-Kleffner 綜合征/ 癲癇伴慢波睡眠期持續(xù)放電中突變率為17.6%，在癥狀相對輕的BECTS患者中突變率只有4.9%[4，11]。在本研究中，BECTS患者的突變率為7.5%，與文獻中報道基本一致。本研究中所發(fā)現(xiàn)的4個錯義突變經(jīng)過保守性分析均為高度保守，且正常對照中未發(fā)現(xiàn)這些基因變異，說明其具有致病性。而且從發(fā)育學上來看，GRIN2A在兒童期達到表達高峰，其表達時間與BECTS的起病時間相吻合，說明GRIN2A很可能是BECTS的致病基因。

從突變形式看，本研究中，除1例為剪切位點突變外，其余4例突變均為錯義突變，這與文獻中報道的一致(錯義突變?yōu)橹?，?6.9%)[4]。正常的NMDARs在靜息狀態(tài)下，需甘氨酸與必需亞基NR1、谷氨酸與調(diào)節(jié)NR2同時結合才能解除Mg2+的阻斷、導致Ca2+內(nèi)流而激活NMDAR。既往功能學研究發(fā)現(xiàn)：GRIN2A錯義突變可導致Mg2+阻滯作用下降、Ca2+的通透性增加，NMDAR通道開放的平均時間延長，從而使NMDAR功能增強[4]。本研究中所發(fā)現(xiàn)的4個錯義突變，分別位于NR2A的N末端和C末端，可能通過干擾谷氨酸與NR2A的結合、Mg2+的阻斷作用減弱等機制，導致NMDAR受體功能增強，從而使神經(jīng)元興奮性增加，導致癲癇的發(fā)生。不同突變對NMDAR功能的影響機制和程度還需進一步經(jīng)功能學研究來證實。

既往研究中發(fā)現(xiàn)GRIN2A突變以遺傳性突變?yōu)橹鳎律蛔儍H占19.7%[2～4，11]。本研究中，有類似遺傳規(guī)律，除c.1271C>T為新生突變外，其余3個可驗證來源的突變均為遺傳性突變。而GRIN2A的外顯率為75%，與文獻中GRIN2A的80%的外顯率相近[2]。在我們既往有關SCN1A[5]和PRRT2[12]基因的研究中發(fā)現(xiàn)，突變的不完全外顯性可能與其相對較低的致病性有關。因此，GRIN2A錯義突變的致病性很可能相對較低，這也是GRIN2A突變在人群中等位基因頻率相對較高的原因。另外，GRIN2A突變的不完全外顯現(xiàn)象也是臨床上BECTS散發(fā)病例較多的原因，對于這一現(xiàn)象的認識對正確地指導臨床遺傳咨詢有重要意義。值得注意的是：本研究中發(fā)現(xiàn)了1例復合突變的患者，患者同時具有c.4322C>A 和c.1271C>T兩個突變，因此不除外隱性遺傳的可能性。這一現(xiàn)象與我們以往有關PRRT2的研究中發(fā)現(xiàn)的復合突變相似[12]。突變c.4322C>A來自母親，但其母親并未表現(xiàn)出癥狀，而c.1271C>T為新生突變，很可能后者致病性相對較強。與其他具有單一突變的患者不同，該患者具有輕度智力障礙，故兩個突變對NMDAR的影響可能具有疊加作用。

本研究中，3例具有GRIN2A突變的患者有注意力缺陷多動障礙，說明突變不但可引起癲癇，而且對其他高級神經(jīng)系統(tǒng)活動，如注意力、智力等都有影響。3例具有GRIN2A基因突變的患者表現(xiàn)為雙側中央-顳區(qū)癲癇樣放電，且2例患者的EEG除局灶性放電外，還表現(xiàn)為陣發(fā)性彌漫性慢活動，這與NR2A在雙側大腦半球皮質(zhì)以及海馬分布較多有關。而從胚胎發(fā)育學的角度來看，尚無證據(jù)表明雙側大腦半球GRIN2A的含量和分布具有差異性，而本研究中1例患者僅表現(xiàn)為單側中央-中顳放電，其機制不明。對于該患者來說，除進行遺傳學方面的病因分析外，還應注意有無局灶性結構性異常的可能性，如局限性皮質(zhì)發(fā)育不良等。

綜上所述，GRIN2A可能是BECTS常見的致病基因，其不但可引起癲癇，而且影響患者的認知功能和精神行為。臨床對BECTS的患者應進行GRIN2A基因突變篩查，以明確其病因。GRIN2A突變存在不完全外顯現(xiàn)象，在進行遺傳咨詢時應引起高度重視。

致謝：感謝參與患者和患者家屬對本研究的無私奉獻和支持。

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GRIN2A Mutations and Genetic Features in Benign Childhood Epilepsy with Centrotemporal Spikes

LIUXiaorong，HUANGDan，LAIJinxing，etal.

(InstituteofNeuroscienceandtheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversityandKeyLaboratoryofNeurogeneticsandChannelopathiesofGuangdongProvinceandtheMinistryofEducationofChina，Guangzhou510260，China)

Objective To screen GRIN2A mutations in Chinese Han patients with benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes (BECTS) and analyze the features of GRIN2A mutations. Methods Patients with BECTS were recruited. GRIN2A mutations were screened by PCR and direct sequencing. Results Fifty-three patients with BECTS were recruited. Five new heterozygous mutations in GRIN2A were identified in 4 patients with BECTS，including 4 missense mutations (c.2627T>C，p.I876T；c.1341T>A，p.N447K；c.4322C>A，p.T1441N；c.1271C>T，p.P424L) and 1 splicing site mutation (c.415-38C>T). Among the patients with GRIN2A mutations，one of the patients had two mutations (c.4322C>A and c.1271C>T). Except for c.1271C>T was a de novo mutation and c.1341T>A was not available for inherited analysis，other mutations were inherited. The rate of incomplete penetrance was 75%. Conclusion GRIN2A is a causative gene for BECTS. Screening of GRIN2A mutation is highly recommended in the patients with BECTS. Incomplete penetrance should be paid attention in the area of genetic counselling.

Benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes； GRIN2A； Genotype； Phenotype

1003-2754(2016)01-0022-05

2015-11-10；

2015-12-22

廣東省教育廳高等學?？萍紕?chuàng)新項目(No.2012KJCX009)；廣州市科信局科技計劃項目(No.2014J4100062、No.201508020011)；國家自然科學基金項目(No.81571273)

[廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣州醫(yī)科大學神經(jīng)科學研究所(廣東省重點實驗室，神經(jīng)遺傳與離子通道病省部共建教育部重點實驗室)廣東 廣州 510260]

劉曉蓉，E-mail：happyxiaorongo@163.com

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