運(yùn)動(dòng)或電針預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損及層粘連蛋白表達(dá)的影響

唐強(qiáng)，阮野，李宏玉，葉濤，吳孝軍，田源，朱路文

運(yùn)動(dòng)或電針預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損及層粘連蛋白表達(dá)的影響

唐強(qiáng)1，阮野2，李宏玉2，葉濤2，吳孝軍2，田源2，朱路文1

目的探討運(yùn)動(dòng)預(yù)處理與電針預(yù)處理對(duì)局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響及其可能機(jī)制。方法24只雄性Sprague-Dawley大鼠隨機(jī)分為模型組(n=6)、假手術(shù)組(n=6)、運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組(n=6)和電針預(yù)處理組(n=6)。模型組、假手術(shù)組不行任何處理；運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組行跑臺(tái)訓(xùn)練2周，電針預(yù)處理組行電針預(yù)處理2周。采用改良線栓法制作大鼠局灶性腦梗死模型，假手術(shù)組行相同血管結(jié)扎，不造成梗死。24 h后采用改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NSS)對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)定，Western blotting檢測(cè)腦缺血區(qū)層粘連蛋白的表達(dá)。結(jié)果假手術(shù)組未見神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，預(yù)處理組NSS評(píng)分低于模型組(P<0.05)，兩預(yù)處理組間無顯著性差異(P>

局灶性腦梗死；預(yù)處理；運(yùn)動(dòng)；電針；神經(jīng)功能；層粘連蛋白；大鼠

[本文著錄格式]唐強(qiáng)，阮野，李宏玉，等.運(yùn)動(dòng)或電針預(yù)處理對(duì)腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損及層粘連蛋白表達(dá)的影響[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2017,23(3):288-291.

CITED AS:Tang Q,Ruan Y,Li HY,et al.Effects of exercise or electroacupuncture preconditioning on neurological deficits and expression of laminin in rats with cerebral infarction[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(3):288-291.

腦血管疾病已成為我國(guó)乃至世界范圍最常見致死疾病之一，具有低治愈率和高致殘率的特點(diǎn)[1-2]。腦梗死發(fā)作約占全部腦血管疾病發(fā)病的60%~80%，是腦血管疾病的重要組成部分，我國(guó)每10萬人口有約110人曾經(jīng)歷此病[2]。既往研究多集中于腦梗死后神經(jīng)功能的康復(fù)方面，而如何有效預(yù)防腦梗死，減少發(fā)病后神經(jīng)功能缺損，探討有效的防治措施是目前臨床醫(yī)學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的重要課題。

近年來有針對(duì)腦梗死的多種預(yù)處理研究，主要集中于缺血預(yù)處理、短暫高溫預(yù)處理、皮質(zhì)擴(kuò)散抑制、運(yùn)動(dòng)預(yù)處理等幾個(gè)主要方法。但前三種方法都對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象造成不同程度創(chuàng)傷，臨床應(yīng)用不便。運(yùn)動(dòng)作為一種低傷高效的預(yù)處理方法無疑在各種方法中更有顯著的優(yōu)勢(shì)[3]。

針刺已成為現(xiàn)代臨床針對(duì)腦梗死疾病的重要治療手段，電針作為現(xiàn)代針刺技術(shù)的改進(jìn)，對(duì)腦梗死的預(yù)防和治療作用已經(jīng)得到諸多臨床與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4-5]。

層粘連蛋白(laminin,LN)主要存在于基膜結(jié)構(gòu)中，是基膜特有的非膠原糖蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，主要對(duì)基膜的組裝起作用，并在細(xì)胞表面形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，使基膜和細(xì)胞緊密結(jié)合。基膜是血腦屏障的主要組成部分之一，LN的改變直接關(guān)系到血腦屏障通透性的改變[6-7]。LN還具有諸如促進(jìn)成年動(dòng)物受損神經(jīng)修復(fù)和再生等作用。

本研究觀察不同預(yù)處理方法對(duì)腦梗死后大鼠神經(jīng)功能缺損情況及LN表達(dá)的影響，對(duì)兩種方法在單一時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行比較，并探討預(yù)處理對(duì)腦梗死疾病產(chǎn)生影響的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

成年雄性清潔級(jí)Sprague-Dawley大鼠24只，體質(zhì)量(220±30)g，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)SYXK(黑)2010007。分為模型組(n= 6)、運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組(n=6)、電針預(yù)處理組(n=6)和假手術(shù)組(n=6)。

1.2試劑與儀器

LN多克隆抗體：SANTA CRUZ公司。TEMED：AMRESCO公司。PVDF膜：MILLIPORE公司。預(yù)染蛋白Marker：索萊寶公司。β-action抗體、羊抗兔IgG-HRP二抗：博奧森公司。

PAC 1000型電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽：Bio-RAD公司。超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司。超低溫高速離心機(jī)：江蘇南京溫諾儀器設(shè)備有限公司。微量移液器：上海佳安分析儀器廠。華佗牌0.5寸一次性針灸針：蘇州醫(yī)療用品有限公司。

1.3造模及干預(yù)方法

模型組大鼠參照改良Longa線栓法[8]建立永久性大腦中動(dòng)脈梗死(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。大鼠2%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔注射麻醉，頸正中切口，于右側(cè)胸鎖乳突肌與二腹肌前頭之間暴露頸總、頸外及頸內(nèi)動(dòng)脈，將用石蠟包被過頭端的魚線由頸總動(dòng)脈送入頸內(nèi)動(dòng)脈，直達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處，阻斷其血流供應(yīng)，結(jié)扎縫合。大鼠蘇醒后觀察其行為變化，以提尾測(cè)試出現(xiàn)肢體向一側(cè)卷曲，行走測(cè)試出現(xiàn)向患側(cè)轉(zhuǎn)圈為造模成功。

假手術(shù)組暴露分離頸部各動(dòng)脈，行與模型組相同的血管結(jié)扎后即進(jìn)行縫合，不插入魚線。

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組造模前進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練3 d，每天30 min，坡度0°，第1天8 m/min，第2天12 m/min，第3天15 m/min。淘汰無法配合跑臺(tái)訓(xùn)練的大鼠并補(bǔ)入。正式訓(xùn)練每天30 min，坡度0°，速度15 m/min，訓(xùn)練6 d休息1 d，共2周。MCAO造模方法同模型組。

電針預(yù)處理組造模前行電針預(yù)處理2周，每次電針間隔24 h，6 d休息1 d。大鼠2%戊巴比妥鈉3 ml/kg腹腔注射麻醉，放置于恒溫手術(shù)臺(tái)面上，溫度37~ 39℃。一次性無菌針灸針于兩耳連線中點(diǎn)處進(jìn)針，向鼻尖方向平刺約5 mm，針尖抵達(dá)帽狀腱膜下層，使用SD2-Ⅴ型電子針療儀，兩電極分別置于針柄和大鼠右耳根部，疏密波，頻率2/15 Hz，強(qiáng)度以右耳出現(xiàn)輕微震顫為度，確認(rèn)刺激達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后持續(xù)30 min。預(yù)處理過程中需保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安靜、溫暖。電針完畢后放回籠中待其自動(dòng)蘇醒。期間注意大鼠生命體征。兩周后行MCAO造模，方法同模型組。

1.4神經(jīng)功能評(píng)定

所有大鼠于MCAO術(shù)后24 h，采用改進(jìn)的14分制神經(jīng)功能缺損評(píng)分(Neurological Severity Scores, NSS)[9]進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)定。

1.5Western blotting

所有大鼠于神經(jīng)功能評(píng)定后麻醉處死，從頸椎處剪斷皮膚、肌肉及頸髓，剪開頭部皮膚暴露顱骨，止血鉗剝離顱骨，剔除硬腦膜，期間避免劃傷腦組織。將腦與顱底組織慢慢分離取下，液氮保存。

取出腦組織，放入預(yù)冷研缽充分短時(shí)研磨，加入蛋白裂解液5 ml/g至研缽沖洗研磨好的組織，充分混勻后將懸液放入EP管中，加1%PMSF 17.4 mg/ml、0.2%Leupeptin 1 mg/ml、0.1%Pepstatin A 5 mg/ml，冰浴20 min，確保裂解充分；14,000 r/min 4℃離心20 min，收集上清，BCA蛋白定量試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)定量檢測(cè)各標(biāo)本總蛋白。

將測(cè)定好濃度的細(xì)胞裂解液(含蛋白40 μg)與4×sample buffer混勻，置100℃水中5 min，500 r/min離心3~5 s，室溫冷卻，將蛋白Marker和樣品依次加到凝膠上樣孔中，空余的上樣孔用1×sample buffer補(bǔ)齊。行SDS-PAGE電泳，先將電壓調(diào)至恒壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示的前沿離開濃縮膠后，再調(diào)整電壓至恒壓120 V，直至藍(lán)色前沿跑出，結(jié)束電泳。預(yù)先將PVDF膜在甲醇中浸泡5~10 min，使之激活。濕法將凝膠轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)夾中，使膠位于陰極，PVDF膜位于陽極，膠和膜的兩側(cè)分別放置3~4層濾紙和海綿，緊密固定之后置于電轉(zhuǎn)槽中，注入transfer buffer，冰上以200 mA轉(zhuǎn)膜2 h。將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入雜交袋中，加入3%BSA-TBST封閉液，封好口，翻轉(zhuǎn)儀上平緩翻轉(zhuǎn)，37℃封閉2 h。將LN一抗(1∶1000)用3% BSA-TBST封閉液稀釋，將PVDF膜與抗體稀釋液置于雜交袋中，4℃翻轉(zhuǎn)孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜3~4次，每次10~15 min。3%BSA-TBST封閉液稀釋羊抗兔IgG-HRP二抗(1∶2000)，將PVDF膜與抗體稀釋液置于雜交袋中，37℃翻轉(zhuǎn)孵育1.5 h。TBST洗滌PVDF膜3~4次，每次10~15 min。按照ECL增強(qiáng)發(fā)光液試劑盒說明書配制曝光液(現(xiàn)用現(xiàn)配)，向PVDF膜上滴加ECL增強(qiáng)發(fā)光液顯色曝光。內(nèi)參β-action稀釋比1∶1000，檢測(cè)過程同LN一抗。檢測(cè)結(jié)果采用Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。每組條帶分別進(jìn)行3次分析，以模型組灰度為1，得到其余3組的蛋白表達(dá)相對(duì)灰度。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以(±s)表示。采用單因素方差分析比較組間差異，兩兩比較采用LSD t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1神經(jīng)功能評(píng)定

假手術(shù)組NSS評(píng)分為0。模型組NSS評(píng)分升高(P<0.05)；兩預(yù)處理組NSS評(píng)分均低于模型組(P< 0.05)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組評(píng)分較電針預(yù)處理組略低，但無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2Western blotting

假手術(shù)組LN表達(dá)最高，模型組LN表達(dá)降低(P< 0.05)，兩預(yù)處理組表達(dá)較模型組升高(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理組LN表達(dá)較電針預(yù)處理組略高，但無顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表1。

圖1 各組大鼠LN表達(dá)

表1 各組大鼠NSS評(píng)分及LN表達(dá)

3 討論

運(yùn)動(dòng)預(yù)處理作為缺血缺氧性腦病預(yù)處理形式中的重要一員，因其安全性、可操作性及顯著效果而被接受，在研究中受到廣泛關(guān)注。既往研究中[10-12]，腦梗死大鼠術(shù)前行運(yùn)動(dòng)預(yù)處理3周，可觀察到腦內(nèi)受損微血管的完整性和腦血流供應(yīng)障礙得到改善。這種腦保護(hù)作用與其誘導(dǎo)腦缺血耐受，降低腦缺血后炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡相關(guān)[13-14]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，這種抗炎、抗凋亡作用是通過調(diào)控Toll樣受體4/核轉(zhuǎn)錄因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor-κB,TLR4/NF-κB)信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。此外，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理的腦保護(hù)機(jī)制還與抑制谷氨酸的過度激活、促進(jìn)腦血管生成及神經(jīng)再生等有關(guān)[17]。

電針為大眾普遍接受的治療腦梗死疾病的重要手段，其作為預(yù)處理方法具備很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。既往研究證實(shí)[18-23]，電針預(yù)處理能通過調(diào)控NF-κB、Wnt/β-catenin及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)等信號(hào)通路，起到縮小腦梗死面積、阻止半暗帶神經(jīng)元凋亡、促進(jìn)病灶周圍水腫吸收、抑制炎癥反應(yīng)和增強(qiáng)自噬的作用，為電針預(yù)處理的科學(xué)性和可行性奠定理論基礎(chǔ)。

本研究顯示，經(jīng)運(yùn)動(dòng)或電針預(yù)處理的大鼠，神經(jīng)功能缺損程度均較未經(jīng)預(yù)處理的大鼠輕，與既往研究結(jié)果一致。表明采用這兩種預(yù)處理方法2周均能在一定程度上抑制缺血缺氧環(huán)境對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

血腦屏障由基膜、毛細(xì)血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)及膠質(zhì)膜共同構(gòu)成，具有防止有害物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)，維持內(nèi)環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定的作用，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生理狀態(tài)具有重要意義。血腦屏障在腦缺血環(huán)境下通透性改變是腦水腫發(fā)生的重要原因[24]。LN是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，與Ⅳ型膠原一起構(gòu)成基膜；因其能與細(xì)胞表面的特異性受體連接，使基底膜和細(xì)胞緊密結(jié)合，起保護(hù)、過濾作用，LN表達(dá)降低可導(dǎo)致血腦屏障通透性增高[25]。

研究顯示[26]，LN表達(dá)于缺血發(fā)生后6 h開始降低，24 h降至最低，與腦缺血損傷后發(fā)生腦水腫最重的時(shí)間段(24~48 h)相符，提示LN的表達(dá)與血腦屏障通透性相關(guān)。本研究顯示，經(jīng)運(yùn)動(dòng)或電針預(yù)處理的腦梗死大鼠，LN表達(dá)降低程度減輕，提示血腦屏障較完整，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

綜上所述，本研究顯示，運(yùn)動(dòng)或電針預(yù)處理均能對(duì)缺血環(huán)境下的神經(jīng)功能起到保護(hù)作用，抑制LN早期表達(dá)的降低，從而使血腦屏障的通透性得到改善。在觀察期間未觀察到兩者的作用有顯著性差異，也未在LN后期表達(dá)回升并堆積的情況下進(jìn)行比較。有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Exercise or Electroacupuncture Preconditioning on Neurological Deficits and Expression of Laminin in Rats with Cerebral Infarction

TANG Qiang1,RUAN Ye2,LI Hong-yu2,YE Tao2,WU Xiao-jun2,TIAN Yuan2,ZHU Lu-wen1
1.Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150001,China;2.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin,Heilongjiang 150040,China

ZHU Lu-wen.E-mail:zhuluwen1983@126.com

ObjectiveTo investigate the effect of electroacupuncture or exercise preconditioning on neurological function after focal cerebral infarction in rats and the possible mechanism.MethodsA total of 24 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into model group(n=6),sham group(n=6),exercise preconditioning group(n=6)and electroacupuncture preconditioning group(n=6).The model group and the sham group did not accept any treatment,while the exercise preconditioning group and the electroacupuncture preconditioning group accepted treadmill training and electroacupuncture for two weeks,respectively.Their middle cerebral arteries were occluded with modified Longa's approach,except the sham group that was ligated the same arteries but did not result in infarction.They were evaluated with Neurologic Severity Scores(NSS)24 hours after modeling,and the laminin expression in the ischemic area was detected with Western blotting.ResultsThere was no neurological deficit in the sham group.The NSS was lower in both preconditioning groups than in the model group(P<0.05),but was not significant different between preconditioning groups(P>0.05).The expression of laminin was the most in the sham group,and was more in both preconditioning groups than in the model group(P<0.05),but was not significant different between preconditioning groups(P>0.05).ConclusionPreconditioning with exercise or electroacupuncture can both reduce the neurological deficits in rats after focal cerebral infarction,which may associate with the protection of laminin from inhibition in early stage.

focal cerebral infarction;preconditioning;exercise;electroacupuncture;neurological function;laminin;rats

R743.32

A

1006-9771(2017)03-0288-04

2016-11-15

2017-01-13)

1.國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81503666)；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)領(lǐng)軍人才計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012RCL02)；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新科研項(xiàng)目(No.yjscx2016037)。

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江哈爾濱市150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱市150040。作者簡(jiǎn)介：唐強(qiáng)(1963-)，男，漢族，四川大竹縣人，博士，教授，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。通訊作者：朱路文(1983-)，男，漢族，山東鄒城市人，博士，副教授，主要研究方向：神經(jīng)系統(tǒng)疾病中醫(yī)康復(fù)基礎(chǔ)與臨床研究。E-mail:zhuluwen1983@126.com。

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.03.008

0.05 )。假手術(shù)組層粘連蛋白表達(dá)最高，模型組較預(yù)處理組表達(dá)降低(P<0.05)，兩預(yù)處理組間無顯著性差異(P>0.05)。結(jié)論運(yùn)動(dòng)預(yù)處理與電針預(yù)處理均能降低局灶性腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損程度，可能與抑制層粘連蛋白早期表達(dá)降低有關(guān)。