Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化貴州野生地枇杷總黃酮提取工藝

陳　琳，俸婷婷*，游　嬋，李　超

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

?

Box-Behnken 設(shè)計優(yōu)化貴州野生地枇杷總黃酮提取工藝

陳琳1，2，3，俸婷婷1，2，3*，游嬋1，李超1

(1.貴州大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省藥食同源植物資源開發(fā)研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

在各單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以總黃酮提取率為指標(biāo)，通過Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計考察乙醇濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)對地枇杷總黃酮提取工藝的影響，優(yōu)化貴州野生地枇杷總黃酮提取工藝。結(jié)果表明：地枇杷總黃酮的乙醇回流最佳提取工藝條件的酒精濃度為70%，液固比1∶15，提取時間為30 min，提取次數(shù)為3次，地枇杷總黃酮提取率為5.09%。按最優(yōu)提取條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終地枇杷總黃酮平均提取率5.13%。本文利用乙醇回流提取地枇杷總黃酮工藝操作簡便，穩(wěn)定可行。

地枇杷；乙醇回流提??；Box-Behnken設(shè)計

地枇杷(Ficus tikoua Bur)也稱地果、地瓜、地石榴，為桑科榕屬匍匐木質(zhì)藤本，莖上生細(xì)長不定根，節(jié)膨大，花期5～6個月，果期7個月，榕果成熟可食[1]。地枇杷味苦、性寒，清熱利濕、活血通絡(luò)、解毒消腫，主治肺熱咳嗽、痢疾、小兒消化不良、風(fēng)濕疼痛、帶下、跌打損傷[2]。榕屬植物主要含有萜類、黃酮、香豆素、生物堿等化學(xué)成分，國內(nèi)外對該屬植物的藥理學(xué)研究表明，該屬植物具有降血糖、松弛平滑肌、抗腫瘤、抗菌等作用，該屬植物具有潛在的藥食兩用資源開發(fā)價值[3]。貴州的地枇杷野生資源豐富，分布區(qū)域廣泛，并且長期作為苗族的習(xí)慣用藥材。本實(shí)驗(yàn)通過比較不同提取條件對地枇杷總黃酮乙醇回流提取率的影響，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化地瓜藤總地枇杷黃酮的提取工藝，確定最佳提取工藝條件，為貴州野生地枇杷資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

地枇杷植物采集于貴州省貴陽市花溪區(qū)，經(jīng)貴州大學(xué)熊源新教授鑒定為地枇杷Ficus tikoua Bur.的全草。

蘆丁對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號100080-200707)，所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器設(shè)備責(zé)任有限公司)；SG8200HPT型超聲波清理器(上海冠特超聲儀器有限公司)；FA 2004型電子天平 (上海良平儀器儀表有限公司)；DGG-9246電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海齊心儀器有限公司)；HH-s2s數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市大地自動儀器廠)；DZF-6020型真空干燥箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司)。

1.3方法

1.3.1總黃酮的含量測定精密稱取蘆丁對照品10 mg，置50 mL量瓶中，加無水乙醇適量，超聲處理使溶解完全，加無水乙醇至刻度，搖勻，得對照品溶液。準(zhǔn)確吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液 l mL，搖勻，放置6 min，加 10%硝酸鋁溶液l mL，搖勻，放置6 min，加 4.3% 氫氧化鈉溶液10 mL，加水至刻度，搖勻，放置l5 min，以相應(yīng)試劑為空白，于500 nm處測定吸光度(A)，A為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]，得到回歸方程為：y = 0.0125x -0.0027 (R2= 0.9999)。

1.3.2總黃酮提取率的測定將不同提取方法所得提取液濃縮后加無水乙醇溶解定容至100 mL，分別準(zhǔn)確吸取定容溶液1 mL，置于25 mL容量瓶中，按1.3.1項(xiàng)下方法測定總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

1.4單因素實(shí)驗(yàn)考察

1.4.1乙醇濃度稱取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分為3組，酒精濃度為40、50、60、70、80%，按料液比1∶5加入浸泡過夜，用水浴控制恒溫75℃，每次提取60 min。

1.4.2料液比稱取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分為3組，按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，加入60%乙醇溶液浸泡過夜，用水浴控制恒溫75℃，每次提取60 min，考察料液比對黃酮濃度的影響。

1.4.3提取時間稱取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分為3組，按料液比1∶15，加入60%乙醇溶液，浸泡過夜，75℃水浴恒溫回流提取時間分別為30、60、90、120、150 min，考察提取時間對黃酮得率的影響。

1.4.4提取次數(shù)對黃酮得率的影響稱取地枇杷粗粉15份，每份3.0 g，均分為3組，按料液比1∶15，乙醇濃度60%寖泡過夜，用水浴控制恒溫75℃回流提取90 min，分別為1、2、3、4、5次，考察提取時間對黃酮得率的影響[5]。

1.5響應(yīng)面設(shè)計實(shí)驗(yàn)說明

根據(jù)Central Composite實(shí)驗(yàn)設(shè)計原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取酒精濃度、料液比、提取時間和提取次數(shù)4個因素為自變量，分別以A、B、C、D代表，每一個自變量的最低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，以黃酮得率Y為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化工藝[5-6]。中心點(diǎn)實(shí)驗(yàn)5次，因素水平編碼見表1。

表1　地枇杷總黃酮提取工藝優(yōu)選Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)考察

2.1.1乙醇濃度結(jié)果總黃酮提取率為2.69、3.15、3.21、2.59、2.55%，表明60%的乙醇使地枇杷總黃酮的提取率達(dá)到最大值，增加乙醇濃度后總黃酮提取率反而降低，可能其他非黃酮物質(zhì)的提取率增加導(dǎo)致總黃酮的提取率反而降低，因此酒精濃度選擇在60%為宜。

2.1.2料液比結(jié)果總黃酮提取率為2.86、3.21、3.50、3.49、3.42%，表明1∶15的料液比使地枇杷總黃酮的提取率達(dá)到最大值，料液比增加后提取率反而降低，可能是非黃酮類物質(zhì)的溶解增加使得總黃酮提取率反而降低，因此料液比選擇在1∶15為宜。

2.1.3提取時間結(jié)果總黃酮平均提取率為3.37、3.49、3.73、3.74、3.71%，表明90 min的提取時間使地瓜地枇杷藤總黃酮的提取率達(dá)到最大值，90 min以后提取率維持在一定水平，綜合考慮時間長短和能源損耗的因素影響選擇90 min的提取時間為宜。

2.1.4提取次數(shù)對黃酮得率的影響結(jié)果總黃酮提取率為3.49、4.09、4.67、4.99、5.03%，表明4次的提取次數(shù)使地枇杷總黃酮的提取率達(dá)到最大值，增加提取次數(shù)后提取率維持在一定水平，綜合考慮時間長短和能源損耗的因素影響選擇提取次數(shù)3次為宜。

2.2響應(yīng)面設(shè)計實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)選地枇杷總黃酮，以總黃酮提取率為考察指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表2　地枇杷總黃酮提取工藝優(yōu)選Box-Behnken實(shí)驗(yàn)安排

表3　回歸模型方差分析

A

B

C

D

E

F

應(yīng)用Design-Exper 9.0軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，方差分析結(jié)果見表3。結(jié)果表明，模型的“P>F”值小于0.01，表明二次方程擬合極顯著。酒精濃度A、提取時間C的“P>F”值大于0.05，表明其對總黃酮提取率影響不顯著，料液比B的“P>F”值在0.01至0.05間，表明其對總黃酮提取率影響顯著，提取次數(shù)的“P>F”值小于0.01，表明其對總黃酮提取率影響極顯著。二次項(xiàng)B2的“P>F”值小于0.01，表明其對總黃酮提取率影響極顯著，A2、D2影響顯著，C2影響不顯著。交互項(xiàng)AC、BC、BD達(dá)到顯著水平，其他不顯著。

回歸方程為Y = 4.67000+0.05250A+0.13333B+0.05417C+0.32000d-0.19208A2-0.23333B2+0.09292C2-0.09083D2+0.01500AB-0.24500AC-0.02750AD+0.20000BC-0.04500BD-0.16750CD，整體模型顯著水平，P=0.01，表明該二次方程模型達(dá)顯著水平，擬合良好。

由圖可知，提取次數(shù)和提取時間對地枇杷黃酮得率的影響較大。利用Design-Expert軟件求解方程，計算出地枇杷總黃酮的最佳提取工藝條件的酒精濃度為70%，料液比1∶15，提取時間為30 min，提取次數(shù)為3次，地枇杷總黃酮提取率為5.09%。按調(diào)整的提取條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，最終地枇杷總黃酮平均提取率5.13%，RSD 0.79%與預(yù)測值較為接近，說明采用響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)可靠，與實(shí)際提取試驗(yàn)結(jié)果擬合良好，對實(shí)際提取工作具有一定指導(dǎo)意義。

3　結(jié)論與討論

中藥有效成分的提取過程往往會受到諸多因素的影響，響應(yīng)曲面優(yōu)化法在中藥有效成分的提取應(yīng)用中越來越受到重視[5，7]。本研究發(fā)現(xiàn)地枇杷總黃酮乙醇回流提取工藝的主要影響因素為提取次數(shù)和提取時間。通過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析得到地枇杷總黃酮乙醇回流提取工藝最佳條件為酒精濃度70%，料液比1∶15，此條件下提取30 min，重復(fù)提取3次，按此預(yù)測的最優(yōu)提取條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，最終得到地枇杷總黃酮提取率為5.13%，表明響應(yīng)面設(shè)計得到的理論值與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合良好，其預(yù)測結(jié)果科學(xué)有效，對實(shí)際提取工作的重要指導(dǎo)意義。貴州省野生地枇杷資源豐富，是提供提取黃酮類化合物的優(yōu)良資源。采用乙醇回流提取法提取貴州地枇杷總黃酮具有提取率較高、操作方便、設(shè)備簡單且易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)，也為貴州野生地枇杷資源的有效開發(fā)利用提供科學(xué)途徑與方法。

[1]中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京:科學(xué)出版社，2006:156-157.

[2]關(guān)永霞，楊小生，佟麗華，等.苗藥地瓜藤化學(xué)成分的研究[J].中草藥，2007，38(3):342-344.

[3]陳勝發(fā)，劉彥超，龍鳳來.楊榕屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報，2010，9(3):13-17.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:258.

[5]周向軍，高義霞，張霞.響應(yīng)面法優(yōu)化黃花菜總黃酮提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(16):29-31.

[6]侯莉偉，楊鳳梅，楊明，等.Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化荷葉總黃酮的溫浸提取工藝[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(18):51-54.

[7]彭曉霞，路莎莎.響應(yīng)面優(yōu)化法在中藥研究中的應(yīng)用和發(fā)展[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(19)：296-299.

Optimization of Extracting Total Flavonoids in Wild Ficus tikoua by Box-Behnken Design

CHEN Lin1,2,3,FENG Ting-ting1,2,3*,YOU Chan1,LI Chao1

(1.School of Pharmaceutical Sciences,Guizhou University,Guiyang,Guizhou 550025,China;2.Medicinal and Edible Plant Resources Research and Development Center of Guizhou,Guiyang,Guizhou 550025,China;3.Medicinal and Edible Plant Resources Application and Development Engineer Laboratory of Guizhou,Guiyang,Guizhou 550025,China)

In this research we tested the effects of ethanol concentration,solid-liquid ratio,time and period of extraction on extraction rateof total flavonoids from F.tikoua by Box-Behnken design to optimize extracting technology based on single factor test.The results showed that,the optimum ethanol reflux extraction conditions of total flavonoids in F.tikouawas as follow:extracting 3 times with the alcohol concentration of 70%,liquid-solid ratio of 15,30 min each time.The yield of total flavonoids was 5.09%.The optimum extraction conditions wasverifiedforthree times,and the average yield of total flavonoids was 5.13%.Extracting total flavonoids from wild F.tikoua by ethanol reflux process is a simple,stable and feasible method.

Ficustikoua;Ethanolreflux extraction;Box-Behnken design

2016-05-03；

2016-05-19

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(黔科合J字[2012]2173號)；貴州省科技合作計劃項(xiàng)目(黔科合LH字[2015]7666號)；貴州省藥食同源資源研究開發(fā)科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)(黔科合人才團(tuán)隊(duì)(2015)4010號)；貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心(黔科合G字(2015)4001)；貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實(shí)驗(yàn)室(黔發(fā)改投資[2015] 542號)；貴州省中藥民族藥制藥工程專業(yè)學(xué)位研究生工作站(黔教研合JYSZ字[2014]002)。

俸婷婷(1983-)，博士，副教授，主要研究方向：藥理學(xué)；E-mail：ftt0809@163.com。

R283.6

A

1008-0457(2016)04-0083-05國際

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.04.015