食品中酵母菌的分離鑒定及其致腐能力

陸文俊，王　芳，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，張　充，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

食品中酵母菌的分離鑒定及其致腐能力

陸文俊，王芳，陸兆新，呂鳳霞，趙海珍，張充，別小妹*

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇 南京 210095）

參照食品安全GB 4789.15—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》中酵母菌的檢測方法，從水果、蜂蜜中分離篩選酵母菌并根據(jù)其26S rDNA D1/D2區(qū)序列進行鑒定。從蜂蜜、草莓、香蕉、橙子、油桃、芒果中共分離得到3 株固囊酵母（Citeromyces matritensis）、3 株異常威客漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、12 株季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）、1 株長孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）、2 株葡萄有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）和1 株海洋酵母菌（Metschnikowia reukaufii）。將每種酵母菌接種于蘋果、油桃和香蕉中與空白對照進行對比，以食品腐爛的速率來判斷酵母菌的腐敗能力，確定了W. anomalus和 C. matritensis是上述3 種水果中主要的腐敗酵母菌，除此之外，M. reukaufi i對油桃有較強的腐敗作用，M. guilliermondii對香蕉的腐敗效果明顯。食品工業(yè)中加強對上述這些腐敗酵母菌的檢測與控制，可以更好地防止腐敗酵母對于食品工業(yè)造成的危害。

酵母菌；分離；鑒定；腐敗能力

近幾年食品防腐劑的大量使用及食品輻照保藏技術(shù)的使用，使得由酵母菌引起的食品腐敗問題越來越顯著。在低pH值、低水活性、低濕度、高鹽或高糖的食品中，多數(shù)細菌無法在這種環(huán)境中生長繁殖，而酵母菌由于其耐受性較強，能夠生長［1］，在這類環(huán)境條件下成為了優(yōu)勢菌株［2］，故這類食品的腐敗主要是由酵母菌引起的。GB 14963—2011《食品安全國家標準 蜂蜜》［3］與GB 17325—2005《食品工業(yè)用濃縮果蔬汁（漿）衛(wèi)生標準》［4］中對蜂蜜及濃縮果蔬汁中酵母菌的數(shù)量進行了規(guī)定。酵母菌引起食品的變質(zhì)及腐敗對食品工業(yè)造成了巨大的安全影響，因此對此類腐敗酵母菌的研究意義重大［5］。

對酵母菌rDNA區(qū)序列的分析是快速鑒定酵母菌的一種手段［6］，其中應(yīng)用較多的是對26S rDNA D1/D2區(qū)和5.8S-ITS區(qū)序列的分析。但相比于5.8S-ITS區(qū)序列，26S rDNA D1/D2區(qū)序列數(shù)據(jù)庫更加完善［7］，目的序列更易在數(shù)據(jù)庫中比對得到結(jié)果，而且目前公認的大多數(shù)酵母菌的26S rDNA D1/D2序列的種內(nèi)差異在0%～1%之間，故該方法準確度高［8］。與傳統(tǒng)的生理生化鑒定的方法相比，序列分析不僅省去了大量繁瑣的操作，而且大大節(jié)省了時間，且準確性更高。本研究從水果、蜂蜜等食品原料中分離得到酵母菌，針對這些酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列比對確定其種屬，并初步確定了這些不同種屬酵母菌的致腐能力，為蜂蜜及果蔬汁等常受酵母菌污染引起腐敗的食品的防腐研究提供了理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)基

各種水果與蜂蜜 市售。

PDA培養(yǎng)基：將馬鈴薯去皮后切成小塊，加水煮爛（20～30 min即可），用8 層紗布過濾后，補足水量（每200 g土豆對應(yīng)1 L水），再加入葡萄糖（添加量為20 g/L），固體培養(yǎng)基加入適量瓊脂后，121 ℃滅菌20 min。

1.2試劑與儀器

聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴增和限制性酶切反應(yīng)所需試劑、DNA Marker 廣州東盛生物科技有限公司；引物 生工生物工程（上海）股份有限公司。

PTC-100TMPCR擴增儀 美國MJ Research公司；JS-380c全自動數(shù)碼凝膠成像分析儀 上海培清科技有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；PowPacTMHC164-5052高電流電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1酵母菌的分離

取液體25 mL（固體25 g）樣品加入225 mL滅菌蒸餾水中，均質(zhì)，按照10 倍系列稀釋，選擇2～3 個適宜稀釋度的樣品勻液，各取1 mL加入無菌培養(yǎng)皿中，每皿加入15～20 mL PDA培養(yǎng)基，（28±1） ℃培養(yǎng)5 d后［9］，挑取平板上圓形白色、邊緣整齊、表面光滑濕潤黏稠的菌落于裝有固體PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上進行三區(qū)平板劃線，（28±1） ℃培養(yǎng)3 d后再挑取具有典型酵母菌菌落特征的菌落在PDA培養(yǎng)基平板上進行2～3 次純化培養(yǎng)，（28±1） ℃培養(yǎng)24～48 h后挑取分離效果較好的菌株，經(jīng)鏡檢為純種后，用接種環(huán)接種于斜面PDA上，（28±1） ℃培養(yǎng)3 d后將菌種于4 ℃保存?zhèn)溆茫?0］。

1.3.2酵母菌的鑒定

D N A模板提取參照細菌基因組提取試劑盒方法，加入液氮研磨破壁過程。以引物N L 1（5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’）和NL4（5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’）擴增酵母菌株26S rDNA D1/D2區(qū)序列［11］。

采用25 μL PCR反應(yīng)體系：2×Master Mix 12.5 mL，ddH2O 9.5 mL，引物NL1與NL4各1 mL，DNA模板1 mL［12］。擴增條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36 個循環(huán)；72 ℃延伸8 min［13］。PCR產(chǎn)物用1%的葡聚糖凝膠在120 V的電壓下進行電泳，并以DL2000作為其分子質(zhì)量標準。

PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行膠回收后送到南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序，測得的基因序列利用BLAST在GenBank中搜索一致性序列后利用軟件Clustal X與樣品序列進行比對，并用軟件MEGA 5.0構(gòu)建鄰接（neighbor-joining，NJ）法系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.3.3酵母菌致腐能力測定

取大小、成熟度相近的蘋果和油桃，在蘋果、油桃的表皮用酒精棉擦拭消毒后利用打孔器打上小孔，然后取分離并鑒定得到的每種酵母菌懸浮液20 μL加入到小孔內(nèi)，待孔內(nèi)液體充分吸收后于30 ℃恒溫貯藏，同時每種水果以注射等量生理鹽水作為空白對照，每種菌液進行3 組重復實驗。5 d后測量腐敗圈的直徑。

取成熟度相似、大小接近的香蕉，每根香蕉用針管注射20 μL酵母菌懸浮液，并以注射等量生理鹽水的香蕉作為空白對照，30 ℃貯藏，將注射不同種菌液和生理鹽水的香蕉每天剝開一根，觀察其內(nèi)部腐爛情況。

2　結(jié)果與分析

2.1酵母菌種分離鑒定

從水果與蜂蜜中分離得到的酵母菌，對其26S rDNA D1/D2區(qū)序列擴增并測序得到結(jié)果與一致性序列比對后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，設(shè)置Bootstrap為500，來鑒定分離得到的酵母菌。由圖1可知，分離菌株與參考菌株之間的親緣關(guān)系，M. guilliermondii由Picha guilliermondii更名而來［14］，因此菌株Y6、Y7、Y10、Y11、Y12、Y13、Y15、Y16、Y17、Y18、Y21和Y22都可被鑒定為M. guilliermondii。但Y10與Y22和其他10 株M. guilliermondii的堿基存在差異。W. anomalus由Pichia anomalus 更名而來［15］，Y4、Y8、Y2與模式菌株P(guān). anomala CECT 11972（AY296048.1）及模式菌株W. anomalus NRRL Y-366（EF550341.1）聚為一枝的支持率均為100%，故Y4、Y8和Y2均可判斷為W. anomalus。Y14與模式菌株L. elongisporus ATCC 11503（HQ876050.1）及菌株L. elongisporus MB148（KF830177.1）聚為一枝的支持率為100%，故可判斷Y14為L. elongisporus。

圖1　水果與蜂蜜中分離的酵母菌基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.1　Neighbor-joining phylogenetic tree based on D1/D2 domain sequences

Y19、Y20與模式菌株H. uvarum KCTC 7834（AF257273.1）與菌株H. uvarum N328（EU268633.1）聚為一枝的支持率均為100%，故可判斷Y19與Y20均為H. uvarum。Y9與參考菌株M. reukaufi i W6b（EU439452.1）聚為一枝的支持率為100%，且這兩株菌與模式菌株M. reukaufii CBS 8997聚為一枝的支持率也為100%，故可判斷Y9為L. elongisporus。Y1與模式菌株C. matritensis NRRL Y-2407（EF550346.1）聚為一枝的支持率為100%，故可判斷Y1為C. matritensis，Y3、Y5聚為一枝，與模式菌株C. matritensis NRRL Y-2407（EF550346.1）屬于同種但堿基存在差異，故Y 3、Y 5可判斷為C. matritensis。

因此得到的酵母菌種鑒定結(jié)果如表1所示，故分離得到的22 株酵母菌中包含3 株固囊酵母（C. matritensis）、3 株異常威客漢姆酵母（W. anomalus）、12 株季也蒙畢赤酵母（M. guilliermondii）、1 株長孢洛德酵母（L. elongisporus）、2 株葡萄有孢漢遜酵母（H. uvarum）和1 株海洋酵母菌（M. reukaufi i）。

表1　分離所得菌種鑒定結(jié)果Table1　Identification results of the isolated yeasts

2.2酵母菌致腐實驗結(jié)果

2.2.1蘋果、油桃致腐實驗結(jié)果

圖2　不同腐敗酵母菌對蘋果致腐作用Fig.2　Apple spoilage ability of different spoilage yeasts

將20 μL菌液或生理鹽水注入蘋果上用打孔器打的小孔后，放置5 d后，觀察腐敗情況（圖2）并測量腐敗區(qū)域直徑。本研究共進行了3 組重復實驗，其中菌株Y14、Y6、Y20、Y9均未出現(xiàn)與空白對照有明顯差異的腐敗區(qū)域，故認為這4 株（L. elongisporus、M. guilliermondii、H. uvarum、M. reukaufii）對蘋果沒有明顯的腐敗作用。而菌株Y2與菌株Y5有明顯的腐敗區(qū)域，其中菌株Y2腐敗區(qū)域的平均直徑為17.44 mm，菌株Y5為20.64 mm，即腐敗區(qū)域大小Y5＞Y2，故認為Y2和Y5兩株菌對蘋果有較為明顯的腐敗作用，即W. anomalus與C. matritensis可加速蘋果的腐敗，且對于蘋果，其腐敗能力C. matritensis＞W(wǎng). anomalus。

圖3　不同腐敗酵母菌對油桃致腐作用Fig.3　Nectarine spoilage ability of different spoilage yeasts

將20 μL菌液或生理鹽水注入油桃上用打孔器打的小孔后，放置5 d后，觀察腐敗情況（圖3）并測量腐敗區(qū)域直徑。本研究共進行了3 組重復實驗，其中菌株Y14、Y6、Y20在3 次實驗中均未出現(xiàn)與空白對照有明顯差異的腐敗區(qū)域，故認為這3 株菌（L. elongisporus、M. guilliermondii、H. uvarum）對油桃沒有明顯的腐敗作用。而菌株Y2、Y5與Y9與空白對照組對比可發(fā)現(xiàn)均有明顯的腐敗區(qū)域，其中菌株Y2腐敗區(qū)域的平均直徑為26.39 mm，菌株Y5為32.28 mm，菌株Y9為43.78 mm，即腐敗區(qū)域大小Y9＞Y5＞Y2，故可確定Y2、Y5和Y9這3 種菌對油桃具有較強的腐敗能力，即W. anomalus、C. matritensis與M. reukaufi i可加速油桃的腐敗，且對于油桃，其腐敗能力大小依次為M. reukaufi i＞C. matritensis＞W(wǎng). anomalus。

2.2.2香蕉致腐實驗結(jié)果

將用注射器注入等量菌液或生理鹽水的香蕉30 ℃保藏后，每天各取一支注射不同樣品的香蕉，剝開皮后觀察其腐爛狀況，如表2所示。由于香蕉質(zhì)地較軟，容易腐敗，將與空白對照的腐敗情況差距在1以內(nèi)的認為該種菌液不具有明顯的腐敗能力，因此，根據(jù)表2中結(jié)果可看出Y6、Y2、Y5這3 種菌對香蕉的腐敗具有明顯影響，即M. guilliermondii、W. anomalus與C. matritensis可加速香蕉的腐敗。

表2　不同腐敗酵母菌對香蕉致腐作用Table2　Banana spoilage ability of different spoilage yeasts

3　討 論

3.1水果和蜂蜜中主要腐敗酵母菌種類

從樣品蜂蜜、草莓、香蕉、橙子、油桃、芒果中共分離得到22 株酵母菌，根據(jù)其26S rDNA D1/D2區(qū)序列測序所得結(jié)果，大多數(shù)為M. guilliermondii或P. guilliermondii，另外還有部分酵母菌為L. elongisporus、W. anomalus、C. matritensis、H. uvarum和M. reukaufii。Kurtzman等［14］根據(jù)26S rDNA和18S rDNA分析結(jié)果，建議將P. guilliermondii歸入新屬Meyerozyma，故將所得的P. guilliermondii全部認為M. guilliermondii，即得12 株M. guilliermondii。

據(jù)研究報道，岑濤等［15］從芒果中分離得到1 株仙人掌有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae）和5 株異常威客漢姆酵母（W. anomalus），而從芒果中分離得到季也蒙畢赤酵母（M. guilliermondii）之前鮮少報道。本研究從多種水果分離得到的酵母菌株中，季也蒙畢赤酵母（M. guilliermondii）最多，該酵母屬于畢赤酵母屬，與Tournas等［16］的研究得到了印證。關(guān)于蜂蜜中的酵母菌，樊潔等［8］在蜂蜜樣品中分離得到了八孢裂殖酵母（Schizosaccharomyces octosporus）、蜂蜜接合酵母（Zygosaccharomyces mellis）和暹羅接合酵母（Zygosaccharomyces siamensis），Carvalho等［17］從蜂蜜中得到膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）、木蘭假絲酵母（Candida magnoliae）與蜂蜜接合酵母（Zygosaccharomyces mellis）。本研究從蜂蜜中分離得到了固囊酵母（C. matritensis）與異常威客漢姆酵母（W. anomalus），目前鮮見報道。

3.2蘋果、油桃、香蕉中存在的主要腐敗酵母

對每種所得酵母菌分別在蘋果、油桃和香蕉上進行致腐實驗，以對其腐敗能力進行檢測，根據(jù)實驗結(jié)果，菌株Y2和Y5對于每種水果都具有較強的腐敗作用，即W. anomalus和C. matritensis對3 種水果的腐敗都具有較強作用。在實驗過程中，菌株Y14和菌株Y9都曾在蘋果的致腐實驗中發(fā)現(xiàn)接種后有單個樣品產(chǎn)生了腐敗，但通過重復實驗的驗證，最終確認這兩株菌對蘋果并沒有明顯的腐敗性，腐敗效果是由單個樣品所產(chǎn)生的偏差，不具有代表性。菌株Y9雖然對于蘋果的腐敗能力不具有代表性，但其對油桃的腐敗能力通過重復實驗得到了驗證，該腐敗性非常明顯，所以可以認為M. reukaufii對蘋果不具備腐敗能力，但對于油桃有較為明顯的腐敗作用。而從香蕉的致腐實驗中，可以發(fā)現(xiàn)除了Y2和Y5兩株菌的腐敗作用明顯，菌株Y6從第3天起對樣品的腐敗作用變得明顯，故應(yīng)認為M. guilliermondii對香蕉也具有一定的腐敗作用。

通過實驗結(jié)果可看出，并非食品原料中的酵母菌均具有明顯的腐敗能力，如Y14和Y20兩株菌在致腐實驗中均未發(fā)現(xiàn)對樣品有明顯的腐敗作用。饒瑜等［18］也曾指出只有約10%的常從食物和飲料中分離的酵母與食品腐敗有關(guān)。部分酵母菌對部分品種樣品具有腐敗能力，而對很多其他樣品并不具備腐敗性，如菌株Y20對油桃有腐敗性而在蘋果與香蕉的致腐實驗中未曾發(fā)現(xiàn)，菌株Y6對于香蕉有較明顯的腐敗作用而對蘋果及油桃的腐敗并沒有明顯作用。也有部分酵母菌對大部分水果原料都具有較為明顯的腐敗能力，如菌株Y2和Y5在蘋果、油桃及香蕉的致腐實驗中均發(fā)現(xiàn)了明顯的腐敗性。故通過本實驗可以確定W. anomalus和C. matritensis是水果和蜂蜜中主要的腐敗酵母菌，具有較強的腐敗能力。除此之外，M. reukaufii對油桃也有較強的腐敗能力、M. guilliermondii對香蕉的腐敗作用也非常明顯。

4　結(jié) 論

本研究對多種水果及蜂蜜中的酵母菌進行了分離與鑒定，通過酵母菌致腐實驗確定了不同水果中存在的主要腐敗酵母菌，同時證明了并非所有酵母菌均具有腐敗能力。Passoth等［19］在研究中提到W. anomalus是多種水果中的腐敗酵母菌，本研究結(jié)果與其一致。而M. guilliermondii對水果的腐敗能力的研究鮮少見報道。

許多發(fā)酵食品和飲料［20］生產(chǎn)過程中的酵母菌是必不可少的，但即使是這些發(fā)酵食品中的酵母菌產(chǎn)生的作用也并非均為有益的，如白酒生產(chǎn)中常常出現(xiàn)的酒香酵母屬與德克酵母屬的酵母成為了白酒工業(yè)中的一個主要問題，它們通過反應(yīng)得到的某些物質(zhì)往往會產(chǎn)生令人討厭的氣味及風味［21］，在其他一些食品中，這類酵母菌成為了導致這些食品腐敗的主要微生物［22］。了解該類食品中常見的腐敗酵母菌的種類，同時采用實時熒光PCR檢測等方法對這些腐敗酵母菌進行認真檢測并嚴格控制［23］，從而避免這些酵母菌對食品的腐敗作用，達到延長這些食品貨架期的目的。

［1］ FELL J W， BOEKHOUT T， FONSECA A， et al. Biodiversity and systematics of basidiomycetous yeasts as determined by large-subunit rDNA D1/D2 domain sequence analysis.［J］. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology， 2000， 50（3）: 1351-1371. DOI:10.1099/00207713-50-3-1351.

［2］ 陳世瓊， 逄波， 蔡雪鳳， 等. 食品中腐敗酵母的實時熒光PCR鑒定［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2013， 39（7）: 185-187. DOI:10.13995/ j.cnki.11-1802/ts.2013.07.007.

［3］ 衛(wèi)生部. GB 14963—2011 食品安全國家標準 蜂蜜［S］. 北京: 中國標準出版社， 2011.

［4］ 衛(wèi)生部. GB 17325—2005 食品工業(yè)用濃縮果蔬汁（漿）衛(wèi)生標準［S］.北京: 中國標準出版社， 2005.

［5］ KURTZMAN C P， ROBNETT C J， BASEHOAR-POWERS E. Phylogenetic relationships among species of Pichia， Issatchenkia and Williopsis determined from multigene sequence analysis， and the proposal of Barnettozyma gen. nov.， Lindnera gen. nov. and Wickerhamomyces gen. nov.［J］. FEMS Yeast Research， 2008， 8（6）: 939-954. DOI:10.1111/j.1567-1364.2008.00416.x.

［6］ WALTHER T， REINSCH H， GROSSE A， et al. Mathematical modeling of regulatory mechanisms in yeast colony development［J］. Journal of Theoretical Biology， 2004， 229（3）: 327-338. DOI:10.1016/ j.jtbi.2004.04.004.

［7］ 郭冬琴， 戴木蘭， 周志欽， 等. 橙汁腐敗酵母菌的分子鑒定及其形態(tài)特征分析［J］. 食品科學， 2012， 33（9）: 131-137.

［8］ 樊潔， 韓燁， 周志江， 等. 蜂蜜中耐高滲透壓酵母菌的分離與鑒定［J］. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（9）: 165-168. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2014.09.027.

［9］ 衛(wèi)生部. GB 4789.15-2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數(shù)［S］. 北京: 中國標準出版社， 2010.

［10］ 杜志琳， 尹望. 一株來自泡菜汁中的酵母菌分離鑒定［J］. 飼料研究，2014（21）: 24-27. DOI:10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2014.21.007.

［11］ KURTZMAN C P， ROBNETT C J. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit （26S）ribosomal DNA partial sequences［J］. Antonie Van Leeuwenhoek，1998， 73（4）: 331-371. DOI:10.1023/A:1001761008817.

［12］ 常玉華， 仇農(nóng)學. 基于PCR技術(shù)快速檢測食品微生物的原理方法與應(yīng)用［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工（學刊）， 2011（11）: 4-6. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646（X）.2011.11.001.

［13］ SIPICZKI M. Candida zemplinina sp. nov.， an osmotolerant and psychrotolerant yeast that ferments sweet botrytized wines［J］. International Journal of Systematic & Evolutionary Microbiology，2003， 53（Pt 6）: 2079-2083. DOI:10.1099/ijs.0.02649-0.

［14］ KURTZMAN C P， SUZUKI M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella， Meyerozyma， Millerozyma， Priceomyces， and Scheffersomyces［J］. Mycoscience， 2010， 51（1）: 2-14. DOI:10.1007/ s10267-009-0011-5.

［15］ 岑濤， 岳田利， 袁亞宏， 等. 云南芒果中酵母菌分離鑒定及在芒果酒發(fā)酵中的應(yīng)用［J］. 食品科學， 2015， 36（11）: 119-124. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201511023.

［16］ TOURNAS V H， HEERES J， BURGESS L. Moulds and yeasts in fruit salads and fruit juices［J］. Food Microbiology， 2006， 23（7）: 684-688. DOI:10.1016/j.fm.2006.01.003.

［17］ CARVALHO C M， MEIRINHO S， ESTEVINHO M L F， et al. Yeast species associated with honey: different identification methods［J］. Archivos de Zootecnia， 2010， 59（225）： 103-113. DOI：10.4321/S0004-05922010000100011.

［18］ 饒瑜， 常偉， 唐潔， 等. 食品中腐敗酵母的研究進展［J］. 食品與發(fā)酵科技， 2013， 49（4）: 61-64. DOI:10.3969/j.issn.1674-506X.2013.04-016.

［19］ PASSOTH V， FREDLUND E， DRUVEFORS U ?， et al. Biotechnology， physiology and genetics of the yeast Pichia anomala［J］. FEMS Yeast Research， 2006， 6（1）: 3-13. DOI:10.1111/ j.1567-1364.2005.00004.x.

［20］ HIERRO N， ESTEVE-ZARZOSO B， GONZALEZ A， et al. Real-time quantitative PCR （qPCR） and reverse transcription-qPCR for detection and enumeration of total yeasts in wine［J］. Applied & Environmental Microbiology， 2006， 72（11）: 7148-7155. DOI:10.1128/AEM.00388-06.

［21］ COMITINI F， de INGENIIS J， PEPE L， et al. Pichia anomala and Kluyveromyces wikerhamii killer toxins as new tools against Dekkera/ Brettanomyces spoilage yeasts［J］. FEMS Microbiology Letters， 2004，238（1）: 235-240. DOI:10.1111/j.1574-6968.2004.tb09761.x.

［22］ TORO M R D， CAPOZZI V， BENEDUCE L， et al. Intraspecific biodiversity and ‘spoilage potential’ of Brettanomyces bruxellensis in Apulian wines［J］. LWT-Food Science and Technology， 2015， 60（1）: 102-108. DOI:10.1016/j.lwt.2014.06.059.

［23］ 陳世瓊. 實時熒光PCR快速檢測果汁中釀酒酵母的初步研究［J］. 食品工業(yè)科技， 2013， 34（7）: 319-321. DOI:10.13386/ j.issn1002-0306.2013.07.023.

Isolation and Identification of Spoilage Yeasts in Foods and Their Spoilage Ability

LU Wenjun， WANG Fang， LU Zhaoxin， L? Fengxia， ZHAO Haizhen， ZHANG Chong， BIE Xiaomei*
（College of Food Science and Technology， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

According to the method to detect yeasts described in the National Food Safety Standard GB 4789.15 2010， yeasts from fruit and honey were isolated and identifi ed by sequence analysis of the D1/D2 domain of 26S rDNA. From honey，strawberries， bananas， oranges， nectarines and mangoes， a total of 3 Citeromyces matritensis strains， 3 Wickerhamomyces anomalus strains， 12 Meyerozyma guilliermondii strains， 1 Lodderomyces elongisporus strain， 2 Hanseniaspora uvarum strains and 1 Metschnikowia reukaufi i strain were isolated. Each of these yeasts was inoculated on apples， nectarines and bananas to evaluate their spoilage ability in comparison with blank control based on how fast the inoculated samples spoiled. We determined W. anomalusand and C. matritensisare to be the major spoilage yeasts of fruits and honey. Moreover，M. reukaufiicauses could result in strong putrefaction on nectarines and M. guilliermondiidoes was obviously active in causing spoilage of bananas. By strengthening the detection and control of these yeasts， we can prevent them from causing hazards to the food industry better.

yeast； isolation； identifi cation； spoilage ability

10.7506/spkx1002-6630-201619030

TS201.3

A

1002-6630（2016）19-0177-06

陸文俊， 王芳， 陸兆新， 等. 食品中酵母菌的分離鑒定及其致腐能力［J］. 食品科學， 2016， 37（19）： 177-182. DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201619030. http：//www.spkx.net.cn

LU Wenjun， WANG Fang， LU Zhaoxin， et al. Isolation and identification of spoilage yeasts in foods and their spoilage ability［J］. Food Science， 2016， 37（19）: 177-182. （in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201619030. http://www.spkx.net.cn

2015-10-19

江蘇省重點研發(fā)計劃（社會發(fā)展）項目（BE2012746）

陸文?。?991—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物。E-mail：2014108012@njau.edu.cn

別小妹（1964—），女，教授，博士，研究方向為食品微生物及生物技術(shù)。E-mail：bxm43@njau.edu.cn