蘇南地區(qū)漢族人群不穩(wěn)定型心絞痛患者IL-10基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性分析

倪悅，錢(qián)志宏，李銀福，何國(guó)平

（1.溧陽(yáng)市人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇213300；2.武進(jìn)人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇常州213002）

蘇南地區(qū)漢族人群不穩(wěn)定型心絞痛患者IL-10基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性分析

倪悅1，錢(qián)志宏1，李銀福1，何國(guó)平2

（1.溧陽(yáng)市人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇213300；2.武進(jìn)人民醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇常州213002）

目的探討蘇南地區(qū)漢族人群白介素-10（IL-10）基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性與不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）發(fā)病的相關(guān)性。方法選取2010年6月至2013年2月在溧陽(yáng)市人民醫(yī)院心內(nèi)科及武進(jìn)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的UAP患者146例作為A組，另選取同期行冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病患者153例作為B組。采用DNA試劑盒提取兩組患者外周靜脈血DNA，用回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，進(jìn)一步測(cè)序鑒定IL-10基因819C/T多態(tài)性，檢測(cè)血糖和血脂等生化指標(biāo)。結(jié)果

IL-10基因啟動(dòng)子819C/T在A、B組中均存在CC、CT和TT 3種基因型，且基因分型符合Hardy-Weinbery平衡；A組中3種基因型分布頻率及等位基因分布頻率與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；調(diào)整對(duì)多個(gè)危險(xiǎn)因素行多元logistic回歸性分析，提示IL-10基因啟動(dòng)子819C/T 3種基因型與UAP的發(fā)病仍無(wú)相關(guān)性。結(jié)論IL-10基因819C/T多態(tài)性與蘇南地區(qū)漢族人群UAP的發(fā)病可能無(wú)相關(guān)性。

漢族；心絞痛，不穩(wěn)定型；白細(xì)胞介素10/遺傳學(xué)；基因；多態(tài)現(xiàn)象，遺傳

不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）的病理基礎(chǔ)是冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定性，炎性反應(yīng)貫穿冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及斑塊破潰的全過(guò)程，炎癥和抗炎作用的平衡控制著動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展［1］。白介素-10（IL-10）是一類(lèi)主要由單核巨噬細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞分泌的，具有抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，并能增強(qiáng)抗炎性因子釋放的細(xì)胞因子，具有下調(diào)炎性反應(yīng)和免疫抑制作用。IL-10參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，并發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)域有-1082A/G、-819C/T和-592A/C這3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs），國(guó)內(nèi)目前鮮見(jiàn)IL-10基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性與UAP關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究探討了蘇南地區(qū)漢族人群中IL-10基因啟動(dòng)子819C/T單核苷酸多態(tài)性與UAP發(fā)病的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2010年6月至2013年2月在溧陽(yáng)市人民醫(yī)院心內(nèi)科及常州市武進(jìn)人民醫(yī)院心內(nèi)科住院的UAP患者146例（A組），其中男106例，女44例；年齡30～85歲，平均（65.57±10.55）歲，均行冠狀動(dòng)脈造影明確診斷UAP。另選取同期2家醫(yī)院住院并部分行冠狀動(dòng)脈造影排除冠心病患者153例（B組），其中男77例，女76例；年齡30～76歲，平均（55.80±11.70）歲。入選對(duì)象排除肝臟疾病、腎臟疾病、風(fēng)濕類(lèi)疾病、惡性腫瘤、急慢性感染。所有患者均同意參與本研究，并簽署知情同意書(shū)。

1.2方法記錄研究對(duì)象的一般臨床資料；測(cè)定研究對(duì)象的血糖、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）等指標(biāo)。抽取外周靜脈血2 mL，置入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，抽提DNA后于-70℃冰箱保存。IL-10基因啟動(dòng)子819C/T引物由上海生物技術(shù)工程有限公司合成，上游引物5′TGGCTCCCCTTACCTTCTACA3′，下游引物5′GGGTGGGCTAAATATCCTCAA3′，PCR反應(yīng)體系：dNTP 1 μL，Taq Buffer 5 μL，25 mmol/L MgCl25 μL，10 pmol/L上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，去離子水35.5 μL，共50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性3 min，然后按94℃30 s，58℃35 s進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，終末72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖電泳（150 V、100 mA、20 min），最后采用回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物并測(cè)序，鑒定IL-10基因啟動(dòng)子819C/T基因型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，血清TC、LDL等計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)；IL-10基因頻率用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，基因型和等位基因頻率及Hardy-Weinberg平衡程度采用χ2檢驗(yàn)，UAP的多種危險(xiǎn)因素采用多元logistic回歸分析，用相對(duì)危險(xiǎn)度（OR）和95%可信區(qū)間（95%CI）表示關(guān)聯(lián)程度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組患者一般臨床資料比較A組合并糖尿病及高血壓多，且年齡大、吸煙比例高，與B組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。A組患者血清TC、TG和LDL水平均明顯高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或0.01），而HDL水平與B組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1　兩組患者一般臨床資料比較

2.2IL-10基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性分型IL-10 819C/T基因多態(tài)位點(diǎn)經(jīng)PCR擴(kuò)增后獲得目的片段大小為140 bp，見(jiàn)圖1；IL-10 819C/T基因表達(dá)的多態(tài)性產(chǎn)物測(cè)序見(jiàn)圖2。

圖1　IL-10基因啟動(dòng)子819C/T基因目的片段PCR擴(kuò)增電泳圖

圖2　IL-10基因啟動(dòng)子819C/T位點(diǎn)表達(dá)的多態(tài)性PCR產(chǎn)物測(cè)序圖

2.3IL-10基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性與UAP關(guān)系分析兩組均存在CC、CT和TT 3種基因型，且基因分型符合Hardy-Weinbery平衡。兩組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)這3種基因型行多個(gè)危險(xiǎn)因素（包括年齡、性別、吸煙、高血壓、糖尿病、血脂）logistic回歸分析后，仍然發(fā)現(xiàn)IL-10基因啟動(dòng)子819C/T與UAP發(fā)病無(wú)相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2　IL-10基因啟動(dòng)子819C/T多態(tài)性與UAP關(guān)系

3　討論

UAP的主要發(fā)病機(jī)制是冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定及伴隨的血小板聚集、血栓形成，局部和全身炎癥在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。UAP患者的冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊中炎性細(xì)胞較穩(wěn)定型心絞痛患者明顯增多，多種炎性細(xì)胞因子均可影響冠狀粥樣硬化的發(fā)展。IL-10主要由單核巨噬細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞分泌，具有很強(qiáng)的抗炎作用，同時(shí)還有免疫刺激作用及免疫抑制作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10與自身免疫性疾病的發(fā)病密切相關(guān)，且參與了心血管疾病的發(fā)病過(guò)程，IL-10能夠調(diào)節(jié)血管炎癥與斑塊穩(wěn)定，對(duì)粥樣硬化形成發(fā)揮重要的保護(hù)作用［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)，急性冠狀動(dòng)脈綜合征患者，IL-10的濃度可下降也可不變，但與促炎因子的比值是下降的，促炎因子與抗炎因子間的失衡可能促進(jìn)急性冠狀動(dòng)脈綜合征的發(fā)生，高表達(dá)的IL-10具有保護(hù)血管、對(duì)抗粥樣硬化及減少急性冠脈事件的作用［4-5］。

冠心病的發(fā)病是環(huán)境因素和基因缺陷共同作用的結(jié)果［6］。SNP能夠影響疾病的易感性，IL-10基因的啟動(dòng)子有多個(gè)SNP位點(diǎn)，啟動(dòng)子區(qū)能夠調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄，該區(qū)存在的基因多態(tài)性可能影響到基因的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致不同個(gè)體間IL-10基因的表達(dá)差異。Trompet等［7］對(duì)IL-10啟動(dòng)子區(qū)域SNP與發(fā)生冠心病和腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了遺傳關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，-592C/A多態(tài)性與冠心病發(fā)生有關(guān)。Fragoso等［8］發(fā)現(xiàn)，IL-10啟動(dòng)子區(qū)域-592C/A和-1082A/G多態(tài)性會(huì)增加急性冠狀動(dòng)脈綜合征的患病風(fēng)險(xiǎn)。Yu等［9］研究表明，IL-10啟動(dòng)子區(qū)域-592C/A和-819C/ T多態(tài)性與缺血性心臟病的發(fā)病相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者均存在CC、CT、TT 3種基因型，且基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。但是未發(fā)現(xiàn)兩組間3種基因型頻率及等位基因頻率有差異，且經(jīng)多因素logstic回歸分析發(fā)現(xiàn)，3種基因型與UAP的發(fā)病仍無(wú)相關(guān)性，說(shuō)明該位點(diǎn)的SNP與蘇南地區(qū)漢族人群UAP發(fā)病的易感性無(wú)關(guān)聯(lián)。這與Koch等［10］研究發(fā)現(xiàn)IL-10啟動(dòng)子區(qū)SNP在德國(guó)人群中與冠心病或心肌梗死無(wú)相關(guān)性的研究一致。Donger等［11］對(duì)IL-10啟動(dòng)子區(qū)域-1082A/G、-819C/T、-592C/A與歐洲人群冠心病的關(guān)系進(jìn)行了研究，但未能發(fā)現(xiàn)這些位點(diǎn)與冠心病有關(guān)。這些研究出現(xiàn)不同的結(jié)果考慮與下列因素有關(guān)：（1）其他多態(tài)性位點(diǎn)的影響。有研究表明，IL-10啟動(dòng)子區(qū)域-1082、IL-10啟動(dòng)子區(qū)域-819、-592這3個(gè)位點(diǎn)SNP不僅單獨(dú)對(duì)IL-10的表達(dá)調(diào)控產(chǎn)生影響，還會(huì)以連鎖的形式控制著IL-10水平變化［12］。（2）研究對(duì)象的人選偏倚。本研究入選者的平均年齡較大。（3）研究人種不同。遺傳易感性在不同人群種族中存在差異。

綜上所述，中國(guó)蘇南地區(qū)漢族人群中IL-10基因啟動(dòng)子-819C/T多態(tài)性與UAP的發(fā)病未見(jiàn)相關(guān)性，需多中心、大樣本量的進(jìn)一步研究來(lái)明確IL-10基因SNP與UAP的確切聯(lián)系。

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Polymorphism analysis of interleukin-10 gene promoter 819C/T polymorphism in patients with unstable angina pectoris among Han population of Sunan region

Ni Yue1，Qian Zhihong1，Li Yinfu1，He Guoping2
（1.Department of Cardiology，Liyang Municipal People′s Hospital，Jiangsu 213300，China；2.Department of Cardiology，Wujin People′s Hospital，Changzhou，Jiangsu 213002，China）

ObjectiveTo investigate the relationship between interleukin-10（IL-10）gene promoter 819C/T polymorphism and unstable angina pectoris（UAP）in the Chinese Han population of Sunan region.MethodsFrom June 2010 to February 2013，a total of 146 patients with UAP（group A）and other 153 healthy subjects without coronary artery disease by coronary arterial angiography（group B）were selected into the study.The DNA kit was adopted to extract DNA from peripheral venous blood，and the PCR products were recovered by the recycle reagent kit.The IL-10 gene polymorphisms were identified by further sequencing. The biochemical indicators of blood sugar and blood fat were detected.ResultsThe three genotypes CC，CT and TT in IL-10 gene promoter 819C/T existed in the group A and B，moreover the genotyping conformed to the Hardy-Weinbery balance；the 3 kinds of genotype distribution frequency and allele distribution frequency in the group A had no statistical difference compared with the control group（P＞0.05）；the multivariate Logistic regression analysis by adjusting multiple risk factors indicated that there was no significant correlation between three genotypes of IL-10 gene promoter 819C/T and UAP pathogensis.ConclusionThe IL-10gene819C/TpolymorphismmayhavenocorrelationwithUAPpathogensisamongtheChineseHanpopulationofSunanregion.

Han nationality；Angina，unstable；Interleukin-10/genetics；Genes；Polymorphism，genetic

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.09.015

A

1009-5519（2016）09-1323-03

倪悅（1983-），碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事心血管內(nèi)科臨床工作。

（2016-01-11）