HPLC 法測定鹽酸法舒地爾注射液與葡萄糖注射液配伍液中的5-羥甲基糠醛

程永科，李銳，陳祖利

（河南中帥醫(yī)藥科技股份有限公司，河南鄭州451000）

HPLC 法測定鹽酸法舒地爾注射液與葡萄糖注射液配伍液中的5-羥甲基糠醛

程永科，李銳，陳祖利

（河南中帥醫(yī)藥科技股份有限公司，河南鄭州451000）

目的測定鹽酸法舒地爾注射液與葡萄糖注射液配伍液中的5-羥甲基糠醛（5-HMF）。方法采用高效液相色譜法（HPLC），色譜柱：Wetch C18柱（150.0 mm×4.6 mm×5.0 μm），流動相：0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈（89∶11），流速：1.0 mL/min，檢測波長：284 nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。結(jié)果5-HMF在1.45～2.61 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好（r= 0.9998）；平均回收率為97.4%（RSD=1.1%）。結(jié)論采用HPLC測定鹽酸法舒地爾注射液與葡萄糖注射液配伍液中的5-HMF方法簡便，準(zhǔn)確可靠。

色譜法，高壓液相；鹽酸；葡萄糖；注射劑；藥物配伍禁忌；糠醛/類似物和衍生物

鹽酸法舒地爾作為一種新型、高效的血管擴(kuò)張藥，是全球唯一一個(gè)Rho激酶抑制劑，也是新型細(xì)胞內(nèi)鈣離子拮抗劑，主要適應(yīng)證為腦血管疾病。鹽酸法舒地爾注射液用于改善和預(yù)防蛛網(wǎng)膜下腔出血術(shù)后的腦血管痙攣及引起的腦缺血癥狀［1］。根據(jù)使用說明書，本品使用時(shí)需用葡萄糖注射液稀釋，而5-羥甲基糠醛（5-hydroxymethyl furfural，5-HMF）是含糖溶液中主要控制的雜質(zhì)，其對人體橫紋肌及內(nèi)臟有損害，具有神經(jīng)毒性，能與人體蛋白質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生蓄積中毒［2］。因此，《中國藥典》從1985年版開始對葡萄糖注射液中5-HMF含量作了限量規(guī)定。朱大勝等［3］已對鹽酸法舒地爾注射液和葡萄糖注射液的配伍進(jìn)行了研究，但是沒有考察5-HMF；也有眾多學(xué)者對5-HMF進(jìn)行了研究［4-13］。鹽酸法舒地爾注射液與葡萄糖注射液混合后是否產(chǎn)生5-HMF對用藥安全至關(guān)重要。本文建立了測定配伍液中5-HMF含量的方法，旨在為臨床安全用藥提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1一般材料鹽酸法舒地爾注射液（自制，批號：20151012、20151013、20151014，規(guī)格：2 mL∶30 mg）；葡萄糖注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：B15040601，規(guī)格：500 mL∶50 g）。

1.1.2儀器與試劑

1.1.2.1儀器日本島津LC-10ATVP高效液相色譜儀；BP211D電子天平（德國賽多利斯集團(tuán)）；Phs-3C pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；日本島津UV-1800紫外分光光度儀。

1.1.2.2試劑5-HMF對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111626-200402）；甲醇（色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司）；其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性色譜柱：Wetch C18柱（150.0 mm×4.6 mm×5.0 μm），流動相：0.05 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈（89∶11），流速：1.0 mL/min，檢測波長：284 nm，柱溫：25℃，進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.2供試品溶液的配制取鹽酸法舒地爾注射液1支，與100 mL 5%葡萄糖溶液配伍，加水稀釋5倍，制成每毫升含鹽酸法舒地爾0.06 mg、含葡萄糖10 mg的溶液，作為配伍供試品溶液。

1.2.3對照品溶液的配制取5-HMF對照品適量，精密稱定，加水制成每毫升約含2.0 μg/mL的溶液，作為對照品溶液。

1.2.4空白溶液的配制取鹽酸法舒地爾注射液1支，加水制成每毫升含鹽酸法舒地爾0.06 mg溶液，作為空白溶液。

1.2.5配伍溶液配置取本品1支，與100mL 5%葡萄糖溶液配伍，加水稀釋5倍，制成每毫升含鹽酸法舒地爾0.06 mg，含葡萄糖10 mg的溶液，于室溫下放置。

1.2.6限度范圍的確定根據(jù)《中國藥典2015年版二部》鹽酸法舒地爾注射液項(xiàng)下5-HMF的規(guī)定，10 mg/mL的葡萄糖溶液，按照紫外-可見分光光度法《中國藥典2015年版二部附錄ⅣA》，在284 nm波長處的吸光度不得大于0.32。

精密稱取5-HMF 5.8 mg，置于10 mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為5-HMF儲備液（500 μg/mL）。精密量取5-HMF儲備液1 mL，置100 mL量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2、3、4、5、6 mL置于10 mL量瓶中，按照紫外-可見分光光度法，分別在284 nm波長處測定吸光度。

1.2.7定量限與檢測限取5-HMF儲備液適量，加水依次稀釋制成每毫升約含0.020、0.010、0.005 μg的溶液，取樣20μL注入液相色譜儀，當(dāng)濃度為0.020μg/mL時(shí)，信噪比（S/N）約為10，計(jì)算得定量限；濃度為0.010 μg/mL時(shí)，色譜圖S/N約為3∶1，計(jì)算得檢測限。

1.2.8線性試驗(yàn)精密稱取5-HMF5.8mg，置于10 mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取1 mL，置于100 mL量瓶中加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mL置于10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，以濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸。

1.2.9溶液重復(fù)性試驗(yàn)取5-HMF儲備液適量，加水制成每毫升約含2.0 μg/mL的溶液，精密量取20 μL注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。

1.2.10回收率試驗(yàn)取定量限濃度，限度濃度和150%限度濃度樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度試驗(yàn)，即供試品濃度分別為0.02、2.00、3.00 μg/mL，取各供試品溶液和對照品溶液，照高效液相色譜法，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算回收率。見表4。

1.2.11溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取5-HMF儲備液適量，加水制成每毫升約含2.0 μg/mL的溶液，作為對照品溶液；于室溫下放置8 h，分別于第0、1、2、4、6、8小時(shí)，精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察5-HMF的主峰面積，比較不同時(shí)間峰面積的變化。

1.2.12配伍液中5-HMF的變化按照1.2.1的色譜條件，精密量取供試品溶液及對照品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，供試品溶液的色譜圖中如顯5-HMF峰，其面積不得大于對照品溶液中主峰的面積（0.020%）。

2　結(jié)果

2.1色譜條件和系統(tǒng)適用性對照品溶液色譜峰的理論板數(shù)大于3 000，空白溶液不干擾，供試品溶液未檢出。

2.2限度范圍的確定以吸光度A對濃度C進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：y=0.158 8x+0.001 4，相關(guān)系數(shù)（r）=0.999 8。見表1。5-HMF在1.16～3.48 μg/mL內(nèi)線性良好，經(jīng)計(jì)算吸光度為0.32時(shí)濃度應(yīng)為2.006 297 μg/mL，即限度應(yīng)為0.020%，參考《中國藥典2010版二部》，將5-HMF控制在0.020%（按葡萄糖含量計(jì)算）左右，葡萄糖溶液濃度為10 mg/mL時(shí)，5-HMF對照品溶液濃度應(yīng)為2.0 μg/mL。

表1　5-HMF線性試驗(yàn)結(jié)果（紫外吸收）

2.3定量限與檢測限定量限約為0.4 ng，檢測限約為0.2 ng。

2.4線性試驗(yàn)以濃度對峰面積進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程：y=81358x-53.1，r=0.999 9，見表2。5-HMF在1.45～2.61 μg/mL內(nèi)線性良好。

表2　5-HMF測定線性試驗(yàn)結(jié)果（HPLC法）

2.5溶液重復(fù)性試驗(yàn)RSD=0.27%，說明本品重復(fù)性良好。見表3。

表3　5-HMF重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.6回收率試驗(yàn)RSD=1.1%，說明采用HPLC測定5-HMF含量回收率高，準(zhǔn)確度良好。見表4。

表4　5-HMF含量測定回收率試驗(yàn)結(jié)果（HPLC法）

2.7溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)RSD=0.07%，說明對照品溶液在室溫下8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表5。

表5　配伍溶液及5-HMF穩(wěn)定性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.8配伍液中5-HMF的變化各批樣品配伍溶液中的5-HMF均小于限度0.02%。見表6。

表6　5-HMF測定結(jié)果

3　討論

3.1色譜條件的選擇。對照品溶液進(jìn)行紫外掃描，最大吸光度值在284 nm，故選該波長進(jìn)行檢測。采用了鹽酸法舒地爾含量的色譜條件，鹽酸法舒地爾和5-HMF可以同時(shí)檢測，相互不干擾。

3.2文獻(xiàn)［3］中關(guān)于鹽酸法舒地爾和葡萄糖注射液的配伍，在配伍8 h內(nèi)外觀、pH、含量及液相色譜峰形無明顯變化，說明相互配伍未見化學(xué)反應(yīng)及結(jié)構(gòu)的改變，且不溶性微粒符合藥典規(guī)定。本研究結(jié)果表明，鹽酸法舒地爾注射液和葡萄糖注射液在配伍8 h內(nèi)沒有產(chǎn)生5-HMF，說明配伍沒有問題，可以安全使用。

3.3HPLC用于檢測鹽酸法舒地爾注射液和葡萄糖注射液配伍中的5-HMF含量，結(jié)果滿意，可作為國內(nèi)同類產(chǎn)品的借鑒，在研發(fā)藥品過程中，要考慮使用過程中產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對注射用藥品，要對配伍液進(jìn)行考察。

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Determination of 5-HMF in compatibility solution of Fasudil Hydrochloride Injection and Glucose Injection by HPLC

ChengYongke，LiRui，ChenZuli
（ZhongshuaiPharmaceuticalScience&TechnologyCo.，Ltd.，Zhengzhou，Henan451000，China）

ObjectiveTo establish a HPLC method for determining the 5-HMF content in the compatibility solution of Fasudil Hydrochloride Injection and Glucose Injection by HPLC.MethodsThe HPLC method was adopted with the chromato graphic column of Wetch C18column（150 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was 0.05 mol/L ammonium dihydrogen phosphateacetonitrile（89∶11），the flow rate was 1.0 mL/min，the column temperature was maintained at 25℃，the detection wavelength was 284 nm，the injection volume was 20 μL.Results5-HMF had good linear relation in the range of 1.45-2.61 μg/mL（r=0.999 8）. The average recovery rate was 97.4%（RSD=1.1%）.ConclusionAdopting the HPLC method for detecting the 5-HMF content in the compatibility solution of Fasudil Hydrochloride Injection and Glucose Injection is simple，accurate and reliable.

Chromatography，high pressure liquid；Hydrochloric acid；Glucose；Injectio；Drug incompatibility；Furaldehyde/analogs&derivatives

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.09.013

A

1009-5519（2016）09-1317-03

程永科（1981-），碩士研究生，工程師，主要從事化藥新藥的研發(fā)工作。

（2016-01-12）