銀杏葉提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮因子表達(dá)的影響

朱美娥，龔道愷

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

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銀杏葉提取物對(duì)局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮因子表達(dá)的影響

朱美娥，龔道愷

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院，湖北 荊州 434000)

目的探討銀杏葉提取物對(duì)大鼠局灶性腦缺血后神經(jīng)行為及血管內(nèi)皮因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法采用線(xiàn)栓法制備局灶性腦缺血大鼠模型，將24只造模成功的SD大鼠隨機(jī)分為模型組及銀杏葉提取物低、中、高劑量組，每組6只，另選取正常大鼠6只作為假手術(shù)組。銀杏葉提取物低、中、高劑量組分別給予銀杏葉提取物注射液0.9，1.8，2.7 mL/100 g灌胃，假手術(shù)組及模型組給予1.8 mL/100 g生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)14 d。通過(guò)平衡木實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠的神經(jīng)行為學(xué)改變，HE染色觀察大鼠腦組織形態(tài)學(xué)變化，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)大鼠腦內(nèi)VEGF mRNA以及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果灌胃7 d和14 d后，銀杏葉提取物低、中、高劑量組的平橫木實(shí)驗(yàn)測(cè)試評(píng)分均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)；HE染色顯示銀杏葉提取物能改變腦組織缺血區(qū)的組織形態(tài)；模型組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組VEGF mRNA及蛋白表達(dá)量均明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)。結(jié)論銀杏葉提取物能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，可能與上調(diào)大鼠腦組織中VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)；銀杏葉提取物對(duì)缺血性腦損傷的改善程度與給藥劑量有關(guān)。

銀杏葉提取物；局灶性腦缺血；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

腦血管疾病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率及致殘率有逐年上升的趨勢(shì)，其中缺血性腦血管病占43%～65%[1]。腦缺血后，導(dǎo)致腦組織缺氧，缺血中心區(qū)細(xì)胞迅速死亡，半暗區(qū)神經(jīng)細(xì)胞處于低氧、低灌注狀態(tài)，及時(shí)恢復(fù)該區(qū)域血流供應(yīng)有望改善患者的神經(jīng)功能。而半暗區(qū)血流的恢復(fù)有賴(lài)于側(cè)支循環(huán)的建立，血管再生是決定這些細(xì)胞存活的關(guān)鍵因素，與缺血后腦卒中患者的預(yù)后關(guān)系密切。在血管再生過(guò)程中，有眾多因子參與調(diào)節(jié)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vasular endothelial growth factor,VEGF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性多功能因子，能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[2]，參與腦缺血后的病理修復(fù)過(guò)程，是已知作用最強(qiáng)和特異性最高的促血管生長(zhǎng)因子[3]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，銀杏葉提取物能夠清除自由基，拮抗血小板活化因子，而且具有抗腦細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)因子表達(dá)等作用，對(duì)心腦血管疾病具有明顯療效[4]。本研究以線(xiàn)栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型，觀察銀杏葉提取物對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)行為學(xué)、腦組織形態(tài)學(xué)及腦內(nèi) VEGF mRNA和蛋白表達(dá)的影響，探討銀杏葉提取物發(fā)揮腦保護(hù)的作用機(jī)制。

1　實(shí)驗(yàn)資料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康6～7周齡雄性SD大鼠50只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(260±20)g，購(gòu)買(mǎi)自北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2藥品、試劑及主要儀器銀杏葉提取物注射液(含銀杏葉提取物17.5 mg/5 mL，北京悅康藥業(yè)集團(tuán)有限公司)；鼠抗人VEGF抗體(北京天根生化科技有限公司)；蘇木素(Sigma公司，美國(guó))；注射用青霉素鈉(山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司)；10%水合氯醛；4%多聚甲醛；伊紅染色液；0.9%氯化鈉注射液；TP600 PCR擴(kuò)增儀(TaKaRa，日本)；自動(dòng)切片機(jī)(LEICARM2145，德國(guó));全自動(dòng)脫水機(jī)(LEICARASP300，德國(guó))；CX41光學(xué)顯微鏡，(OLYMPUS，日本)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型的建立隨機(jī)取44只大鼠，參考Longa等[5]和朱繼等[6]報(bào)道的線(xiàn)栓法建立局灶腦缺血大鼠模型：大鼠稱(chēng)質(zhì)量后，按10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉；頸部正中切口，在頸總動(dòng)脈深面穿一細(xì)線(xiàn)，鈍性分離頸內(nèi)、外動(dòng)脈；提起該側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)，用眼科剪于CCA近分叉處剪一約0.2 mm的V型切口，將一直徑約0.2 mm的尼龍線(xiàn)穿入頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)；然后將切口的遠(yuǎn)心端及動(dòng)脈內(nèi)的絲線(xiàn)牢固結(jié)扎，造成大腦中動(dòng)脈栓塞模型。以上過(guò)程均在恒定室溫(24～25 ℃)情況下進(jìn)行，以利于評(píng)價(jià)腦缺血程度。剩余6只大鼠作為假手術(shù)組，除插線(xiàn)1 cm外，其余步驟同造模組。

1.3.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥將造模成功的24只大鼠隨機(jī)分為模型組和銀杏葉提取物低、中、高劑量組各6只。手術(shù)造模成功后24 h，銀杏葉提取物低、中、高劑量組分別給予銀杏葉提取物注射液0.9，1.8，2.7 mL/100 g灌胃，假手術(shù)組及模型組給予1.8 mL/100 g生理鹽水灌胃，均1次/d，連續(xù)14 d,末次灌胃24 h后取標(biāo)本。

1.3.3神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分分別在術(shù)后24 h及灌胃7 d、14 d，參考Feeney等[7]大鼠平衡木實(shí)驗(yàn)(Beam walking test,BWT)評(píng)價(jià)大鼠精細(xì)運(yùn)動(dòng)功能情況。根據(jù)大鼠是否能夠順利爬過(guò)橫木及癱瘓側(cè)肢體起作用的情況評(píng)定，BWT評(píng)分為1～7分。

1.3.4腦組織病理學(xué)觀察灌胃14 d后，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(0.3 mL/100 g)，斷頭處死，冰盤(pán)上迅速完整剝?nèi)∧X組織，浸入4%多聚甲醛固定液中，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，4μm厚冠狀連續(xù)切片進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.5VEGF mRNA表達(dá)檢測(cè)采用RT-PCR法檢測(cè)。引物合成：引物設(shè)計(jì)參考Gene-bank數(shù)據(jù)庫(kù)， VEGF基因：上游5’-GTAACCTAGGCCTGTGAACCGTGG-3’，下游5’-GCATCCTTGCATGCGCTTGCATGG-3’,DNA擴(kuò)增全長(zhǎng)為341 bp；內(nèi)參引物序列β-actin：上游5’- CAGGATGCAGAAGGAGATTA-3’，下游5’-ATCCACATCTGCTG GAAG-3’，DNA擴(kuò)增全長(zhǎng)為265 bp。采用Trizol一步法提取腦組織總RNA。取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳(50 V，45 min)，置于紫外透射儀下照相。應(yīng)用Image J軟件對(duì)RT-PCR電泳結(jié)果進(jìn)行灰度分析，按照以下公式計(jì)算VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量：產(chǎn)物含量=目的基因的光密度值/β-actin的光密度值×100%。

1.3.6VEGF蛋白表達(dá)檢測(cè)對(duì)組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟和抗原修復(fù)，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組化染色，采用ABC法。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性片作陽(yáng)性對(duì)照，VEGF主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)。采用Image Pro Plus醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞的積分光密度(IOD)。

2　結(jié)　　果

2.1各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分灌胃7 d和14 d后，模型組BWT評(píng)分均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組大鼠BWT評(píng)分均顯著高于灌胃前及模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組高于低劑量和高劑量組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，細(xì)胞膜及核膜清晰，核仁明顯，無(wú)水腫表現(xiàn)，見(jiàn)圖1。而模型組腦組織明顯水腫，而且神經(jīng)元變性壞死明顯，神經(jīng)元呈現(xiàn)腫脹或皺縮狀態(tài)，核仁基本消失，胞漿呈強(qiáng)烈嗜伊紅性，胞漿與核膜邊界不清，可見(jiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖2。銀杏葉提取物低、中、高劑量組腦組織神經(jīng)細(xì)胞水腫程度及胞漿濃縮較模型組均明顯減輕，其中以銀杏葉提取物中劑量組減輕最為明顯，見(jiàn)圖3～5。

表1　各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較±s，分)

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與灌胃前比較，P<0.05；③與模型組比較，P<0.05；④與銀杏葉提取物中劑量組比較，P<0.05。

圖1　假手術(shù)組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×200)

圖2　模型組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×200)

圖3　銀杏葉提取物低劑量組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×200)

2.3各組大鼠VEGF mRNA半定量假手術(shù)組VEGF相對(duì)表達(dá)量為2.854 9±0.154 9，模型組為4.537 2±0.684 2，銀杏葉提取物低劑量組為11.427 0±0.224 2，銀杏葉提取物中劑量組為18.9857±0.1983，銀杏葉提取物高劑量組為12.2013±0.243 6。模型組VEGF mRNA表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組VEGF mRNA表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組VEGF mRNA表達(dá)量均明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)。

圖4　銀杏葉提取物中劑量組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×200)

圖5　銀杏葉提取物高劑量組大鼠腦組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)情況假手術(shù)組VEGF蛋白表達(dá)IOD值為208.65±39.58，模型組為408.47±34.21，銀杏葉提取物低劑量組為685.13±94.22，銀杏葉提取物中劑量組為917.78±85.24，銀杏葉提取物高劑量組為746.48±83.49。模型組VEGF蛋白表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，銀杏葉提取物低、中、高劑量組VEGF蛋白表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)，且銀杏葉提取物中劑量組VEGF蛋白表達(dá)量均明顯高于低劑量組和高劑量組(P均<0.05)。

3　討　　論

腦中風(fēng)是目前危害人類(lèi)健康的重要疾病之一，聯(lián)合國(guó)世界衛(wèi)生組織曾調(diào)查57個(gè)國(guó)家死亡人群，結(jié)果顯示死于腦血管病者竟高達(dá)11.3%。在我國(guó)，腦血管病、心臟病及癌癥是造成患者死亡的三大疾病，而腦血管病居三大死因之首[8]。我國(guó)每年有急性腦血管病例約150萬(wàn)，缺血性腦中風(fēng)是最主要的原因[9]。

缺血性腦中風(fēng)之所以發(fā)生是因?yàn)檠茏枞笤斐删植磕X血流量減少，從而對(duì)神經(jīng)組織造成損傷。腦缺血后半暗區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞處于低氧狀態(tài)，神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而及時(shí)恢復(fù)半暗區(qū)的血流供應(yīng)，抑制腦部神經(jīng)細(xì)胞凋亡可改善患者的神經(jīng)功能[10]。VEGF是由2個(gè)相同亞基組成的一種多功能促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管生成，抗血栓，抗內(nèi)皮細(xì)胞損傷和凋亡以及神經(jīng)保護(hù)等作用，在胚胎發(fā)育、缺血性心腦血管疾病的發(fā)病和防治中具有重要意義。在缺氧缺血條件下，機(jī)體組織VEGF表達(dá)上調(diào)，其作用機(jī)制可能為：缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)誘導(dǎo)啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄，氧氣和生長(zhǎng)因子可以調(diào)節(jié)HIF-1，從而激活正常的缺氧感受基因，使得VEGF表達(dá)增加；缺氧能顯著延長(zhǎng)VEGF mRNA在體內(nèi)的半衰期，從而間接提高VEGF的生理活性[11]。隨著人們對(duì)局灶性腦缺血病研究的深入，VEGF在缺血性腦中風(fēng)中的作用逐漸成為人們研究的熱點(diǎn)。

中醫(yī)認(rèn)為缺血性腦中風(fēng)的基本病機(jī)為腎精虧虛，瘀血阻竅。銀杏葉是中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材之一，具有兩千多年的應(yīng)用歷史。有醫(yī)書(shū)記載銀杏葉提取物具有活血化瘀、通絡(luò)等功效，從上個(gè)世紀(jì)60年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者開(kāi)始對(duì)銀杏葉的化學(xué)成分及藥理作用進(jìn)行研究。20世紀(jì)80年代研究人員發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物具有抗缺氧、抗腦水腫和改善腦功能等作用，從而廣泛應(yīng)用于腦缺血等疾病中?，F(xiàn)代研究表明，銀杏葉提取物中主要化學(xué)成分為黃酮苷(24%)和萜類(lèi)內(nèi)酯(6%)，具有清除氧自由基、拮抗血小板活化因子、抑制一氧化氮合酶、改善能量代謝障礙、拮抗興奮性氨基酸毒性等作用，從而對(duì)腦缺氧缺血起到保護(hù)作用[12-14]。然而，銀杏葉提取物對(duì)局灶性腦缺血疾病的修復(fù)以及VEGF基因表達(dá)的影響鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果顯示，銀杏葉提取物能明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，而且中劑量銀杏葉提取物對(duì)大鼠的神經(jīng)功能改善情況最為顯著；通過(guò)對(duì)大鼠腦內(nèi)VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)檢測(cè)證明，銀杏葉提取物能顯著上調(diào)VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)水平，而且中劑量銀杏葉提取物效果最好，這與銀杏葉提取物對(duì)大鼠神經(jīng)功能改善結(jié)果一致；大鼠腦組織HE染色結(jié)果證實(shí)銀杏葉提取物能改善急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能損傷，減輕急性腦缺血時(shí)腦組織缺血區(qū)的組織形態(tài)學(xué)改變。以上結(jié)果說(shuō)明銀杏葉提取物能夠改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能，可能與上調(diào)大鼠腦組織中VEGF mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)；此外銀杏葉提取物對(duì)缺血性腦損傷的改善程度與給藥劑量有關(guān)。

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Effects of Ginkgo Biloba extract powder on expression of VEGF in brain tissue after focal cerebral infarction in rats

ZHU Meie,GONG Daokai

(Jingzhou Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Jingzhou 434000,Hubei,China)

Objective It is to observe the effects of Ginkgo Biloba extract powder on neurobehavior and expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) mRNA and protein in brain tissue of rats after focal cerebral infarction.Methods The ischemic models were established with line embolism method.24 successful modeling Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into model group,Ginkgo Biloba extract powder groups (low,middle and high dosage),each group had 6 rats,and 6 normal rats were selected as sham operation group for comparison.Low,middle and high dosage of Ginkgo Biloba extract groups were given Ginkgo Biloba extract injection 0.9,1.8,2.7 mL/100 g respectively by lavage,while sham operation group and model group were given normal saline by lavage once per day.All the treatments lasted for 14 days.Beam walking test was adopted to evaluate the SD rat's neural behavior and HE staining was used to observe the rat brain morphological changes.VEGF mRNA and proteins expression were measured by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and immunohistochemical methods respectively.Results The scores of Ginkgo Biloba extract powder groups(low,middle,high dosage)were respectively higher than that in model group after 7 and 14 days' treatment(P<0.05),and the scores in middle dosage group were higher than that in low or high dosage groups (P<0.05).The result of HE staining showed that Ginkgo Biloba extract powder could change the brain morpholody of rats.The expressions of VEGF mRNA and protein in model group was higher obviously than that in sham operation group (P<0.05),the expressions of VEGF mRNA and protein in Ginkgo Biloba extract powder groups(low,middle,high dosage)were respectively higher than that in model group (P<0.05),and the expression in middle dosage group was higher than that in low or high dosage groups (P<0.05).Conclusion Ginkgo Biloba extract powder could improve neurogenic function and up-regulate the expressions of VEGF in rats with focal cerebral ischemia,which may be a main mechanism of its neuroprotection against cerebral ischemia injury,and the improving effects were related with therapy dosage.

Ginkgo Biloba extract powder; focal cerebral infarction; vascular endothelial growth factor

朱美娥，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事腦血管病及周?chē)窠?jīng)病診治工作。

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.28.009

R-332

A

1008-8849(2016)28-3107-04

2015-12-12