超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安賽蜜與糖精鈉

陳麗娟，費(fèi)曉慶*，譚夢(mèng)茹，吳　斌，沈崇鈺，張　睿，丁　濤，劉　蕓，楊功俊

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局　食品實(shí)驗(yàn)室，江蘇　南京　210001;2.中國(guó)藥科大學(xué)　藥學(xué)院，江蘇　南京　211198)

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超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法測(cè)定蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安賽蜜與糖精鈉

陳麗娟1，費(fèi)曉慶1*，譚夢(mèng)茹2，吳斌1，沈崇鈺1，張睿1，丁濤1，劉蕓1，楊功俊2

(1.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局食品實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210001;2.中國(guó)藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211198)

建立了蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜分離測(cè)定方法。樣品采用甲醇-水溶液(10∶90)提取，Diamonsil Plus C18色譜柱進(jìn)行色譜分離，以0.5 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇為流動(dòng)相梯度洗脫，通過高分辨負(fù)離子掃描模式進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，4種物質(zhì)在0.02～2.0 mg/L范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.998 7～0.999 7。苯甲酸、山梨酸的方法定量下限為0.5 mg/kg，安賽蜜、糖精鈉為0.3 mg/kg 。在低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度下，方法的回收率為89.0%～104.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%～7.9%。該方法靈敏、簡(jiǎn)單、快速，定性準(zhǔn)確可靠，適用于大批量蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的檢測(cè)。

蜂蜜；高分辨質(zhì)譜；超高效液相色譜；防腐劑；甜味劑

苯甲酸和山梨酸作為常見的防腐劑，因良好的防腐效果被廣泛用于各類食品中。雖然人體腎臟具有排毒功能，但長(zhǎng)期且同時(shí)食用含有多種防腐劑的食物會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生如貧血、神經(jīng)系統(tǒng)的損壞和導(dǎo)致癌癥[1]等多種毒害作用。安賽蜜和糖精鈉作為非營(yíng)養(yǎng)性甜味劑具有甜度高、用量少等特點(diǎn)，因而備受食品生產(chǎn)廠商青睞，但其安全性問題一直是消費(fèi)者關(guān)注的焦點(diǎn)[2]。

一些不法廠家為降低成本，謀取利益，在糖漿中添加防腐劑、甜味劑、色素和香精，制成摻假蜂蜜，這種摻假行為嚴(yán)重干擾了蜂產(chǎn)品市場(chǎng)秩序。蜂蜜的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)GH/T 18796-2012中明確規(guī)定“蜂蜜中不得添加當(dāng)前明確或者不明確的添加物”[3]。食品添加劑的限量標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014中也規(guī)定了各類食品中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的使用限量[4]，但未對(duì)蜂蜜產(chǎn)品進(jìn)行規(guī)定。已有的關(guān)于這4種物質(zhì)的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中[5-9]，檢測(cè)的樣品基質(zhì)包括醬油、果醬、飲料、乳制品、飼料等，并未涉及蜂蜜。所以亟需建立一種能夠快速、簡(jiǎn)單地同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的分析方法。

目前苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的主要檢測(cè)方法有紫外分光光度法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法[10-16]。其中紫外分光光度法操作較簡(jiǎn)單，但方法靈敏度較低，定量不準(zhǔn)確，易造成假陽性結(jié)果。氣相色譜法具有較高的選擇性和靈敏度，但操作步驟繁瑣，需衍生，分析時(shí)間長(zhǎng)。常規(guī)的高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳法的操作耗時(shí)，檢出限相對(duì)較高。液相色譜-質(zhì)譜法在食品檢測(cè)中應(yīng)用較普遍，該法一般基于保留時(shí)間和質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性，接近保留時(shí)間和質(zhì)量數(shù)的物質(zhì)對(duì)被分析物質(zhì)會(huì)存在干擾，可能導(dǎo)致假陽性。高分辨質(zhì)譜利用一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行篩查，依靠提取精確質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間進(jìn)行定性，理論質(zhì)量數(shù)與實(shí)際測(cè)得的質(zhì)量數(shù)相對(duì)偏差越小，檢測(cè)結(jié)果可信程度越高，抗干擾能力越強(qiáng)，假陽性可能越低。目前使用高分辨質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)蜂蜜中防腐劑和甜味劑的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道和標(biāo)準(zhǔn)方法發(fā)布。

本實(shí)驗(yàn)采用甲醇-水溶液(10∶90)提取蜂蜜中的苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉，使用高分辨質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)這4種物質(zhì)，相對(duì)于紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法，該方法的檢出限明顯降低，能夠滿足日常檢測(cè)要求且適合大批量樣品的快速檢測(cè)。采用本方法首次對(duì)國(guó)內(nèi)純正蜂蜜樣本和抽檢樣本進(jìn)行分析，從而為我國(guó)有關(guān)部門進(jìn)一步開展蜂蜜的品質(zhì)監(jiān)管工作提供了科學(xué)根據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，在保護(hù)消費(fèi)者利益方面具有重要作用。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Q-Exactive 四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜及DIONEX UltiMate 3000 超高效液相色譜儀(Thermo Fisher公司，美國(guó))；Option-Q超純水儀(Elga公司，美國(guó))。

甲醇、乙酸銨(色譜純，Merck公司)；苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于99.0%，Dr.Ehrensorfer)；天然純正蜂蜜樣本共246個(gè)，來自國(guó)內(nèi)蜂蜜企業(yè)和蜂農(nóng)，油菜蜜36個(gè)、洋槐蜜33個(gè)、椴樹蜜29個(gè)、荊條蜜28個(gè)、百花蜜25個(gè)、棗花蜜22個(gè)、蕎麥蜜15個(gè)、葵花蜜13個(gè)、棉花蜜10個(gè)、進(jìn)口蜂蜜35個(gè)(包括麥盧卡蜂蜜、桉樹蜜、黑森林蜜等)；市場(chǎng)抽檢蜂蜜共276個(gè)，來自國(guó)內(nèi)各大超市及蜂蜜生產(chǎn)企業(yè)。

1.2溶液配制

單標(biāo)儲(chǔ)備液：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg(精確至0.01 mg)于25 mL容量瓶中，苯甲酸、山梨酸以乙醇定容，安賽蜜、糖精鈉以水定容，配成1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4 ℃冷藏條件下保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確量取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇-水(10∶90)溶液逐級(jí)稀釋，得到20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4 ℃冷藏條件下保存。

1.3樣品前處理

準(zhǔn)確稱取(1±0.01) g蜂蜜樣品于10 mL容量瓶中，用甲醇-水(10∶90)溶液定容至刻度，渦旋溶解混勻后，過0.22 μm聚醚砜濾膜，待測(cè)定。

1.4UPLC條件

色譜柱：Diamonsil Plus C18(5 μm×150 mm×4.6 mm，Dikma公司)；柱溫：室溫；流速：0.60 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相：0.5 mmol/L乙酸銨溶液(A)-甲醇(B)；梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1～4 min，5%～90%B；4～6.5 min，90%B，6.5～7 min，90%～5%B；7～8 min，5%B。分析時(shí)間8 min。

1.5質(zhì)譜條件

加熱源溫度300 ℃，毛細(xì)管溫度350 ℃，噴霧電壓3 000 V(負(fù)離子模式)，質(zhì)量掃描范圍m/z100～1 000，一級(jí)質(zhì)譜全掃描分辨率35 000，C-trap最大容量(AGC) 3×106，C-trap最長(zhǎng)等待時(shí)間200 ms。

2　結(jié)果與討論

2.1前處理方法的優(yōu)化

由于本方法前處理簡(jiǎn)單，在提取過程中添加劑幾乎無損失，所以對(duì)可能造成提取損失的濾膜進(jìn)行優(yōu)化?？疾炝丝讖?.22 μm尼龍濾膜、0.45 μm聚醚砜濾膜、0.22 μm聚醚砜濾膜對(duì)4種化合物回收率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，此3種濾膜對(duì)苯甲酸、山梨酸基本無吸附作用；但0.22 μm尼龍濾膜對(duì)安賽蜜、糖精鈉有吸附，損失可達(dá)50%，其他兩種濾膜對(duì)這兩種物質(zhì)無吸附作用?？紤]到保護(hù)儀器，實(shí)驗(yàn)選擇0.22 μm聚醚砜濾膜。

圖1　苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-Q Exactive 色譜圖Fig.1　Chromatograms of UPLC-Q Exactive for benzoic acid，sorbic acid，saccharin sodium and acesulfame-K standards

2.2色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

高效C18柱是UPLC分析較常用的一類色譜柱，如Kinetex 2.6u C18(Phenomenex)、Atlantis T3(Waters)、Diamonsil Plus C18(Dikma)。實(shí)驗(yàn)比較了這3種色譜柱對(duì)苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉的分離效果，發(fā)現(xiàn)苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉在3種色譜柱上均可有效分離。但在實(shí)際檢測(cè)中，Kinetex 2.6u C18(Phenomenex)和Atlantis T3(Waters)的使用壽命較短，當(dāng)樣品檢測(cè)數(shù)量較大時(shí)，使用15～20 d會(huì)出現(xiàn)峰形較差、嚴(yán)重拖尾以及分峰的現(xiàn)象，而相同檢測(cè)樣本數(shù)量下Diamonsil Plus C18(Dikma)的使用壽命可達(dá)4～5個(gè)月且價(jià)格低廉，因此，實(shí)驗(yàn)最終選用Diamonsil Plus C18(Dikma)作為色譜分離柱(圖1)。

同時(shí)考察了使用乙腈作為流動(dòng)相時(shí)的分離情況，該條件下苯甲酸和山梨酸的峰形過寬，拖尾嚴(yán)重；而改用甲醇作流動(dòng)相后峰形明顯改善。使用純水作為流動(dòng)相水相時(shí)，高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰形不佳；以5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相水相時(shí)，峰形明顯改善，但出峰時(shí)間較晚，當(dāng)乙酸銨濃度為0.5 mmol/L時(shí)，4種化合物的出峰時(shí)間明顯提前，繼續(xù)降低乙酸銨濃度至0.1 mmol/L時(shí)，安賽蜜、糖精鈉的出峰時(shí)間均在1 min內(nèi)，不能有效保留。因此，實(shí)驗(yàn)最終選用甲醇-0.5 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動(dòng)相。

由于本文考察的化合物或含有羥基(—OH)，或以K+，Na+鹽形式存在，在極性溶劑中，易失去H+，K+，Na+等離子，形成帶負(fù)電荷的基團(tuán)，因此適合在負(fù)離子模式下檢測(cè)。用Q Exactive以全掃模式進(jìn)樣分析，對(duì)得到的總離子流圖提取可能產(chǎn)生的離子質(zhì)荷比，發(fā)現(xiàn)含Na+或K+的糖精鈉、安賽蜜會(huì)同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)離子，選取質(zhì)荷比響應(yīng)最高的作為定量離子。由于本方法利用一級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行篩查，依靠提取精確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行定性，因此理論質(zhì)量數(shù)與實(shí)際測(cè)得值的相對(duì)偏差越小，檢測(cè)結(jié)果可信程度越高。由于高分辨質(zhì)譜為新開發(fā)儀器，目前暫無準(zhǔn)確的定性偏差指標(biāo)，所以將化合物實(shí)測(cè)質(zhì)荷比(m/z)與理論值相差不超過±1×10-5定性為相同物質(zhì)。陽性樣品可通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的保留時(shí)間和精確質(zhì)量數(shù)比對(duì)來進(jìn)一步定性定量。4種化合物的UPLC-Q Exactive MS分析參數(shù)見表1。

表1　4種化合物的UPLC-Q Exactive MS分析參數(shù)Table 1　UPLC-Q Exactive MS parameters of four compounds

2.3線性關(guān)系、檢出限與定量下限

將20 mg/L的4種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制成2.0,1.0,0.5,0.2,0.1,0.05,0.02 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳條件下進(jìn)行檢測(cè)，以標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X,mg/L)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。將4種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋至信噪比S/N=3，以此進(jìn)樣濃度為檢出限(LOD)，以10倍信噪比對(duì)應(yīng)的加標(biāo)水平為定量下限(LOQ)，結(jié)果見表2。4種物質(zhì)在0.02～2.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)不低于0.998 7，防腐劑苯甲酸和山梨酸的LOD和LOQ分別為0.2 mg/kg和0.5 mg/kg，甜味劑安賽蜜、糖精鈉的LOD和LOQ分別為0.1 mg/kg和0.3 mg/kg。

表2　4種化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量下限Table 2　Regression equations,correlation coefficients(r2),linear ranges,LODs and LQDs of four compounds

2.4回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以陰性蜂蜜樣品加標(biāo)的回收率考察方法的準(zhǔn)確度，以回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)考察方法的精密度。在陰性蜂蜜樣品中添加4種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加標(biāo)水平分別為0.5，1.0，2.0 mg/kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6個(gè)樣品，其回收率和RSD見表3。方法的平均回收率為89.0%～104.0%，RSD為2.0%～7.9%。說明本方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

表3　蜂蜜樣品中4種化合物的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3　Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of four compounds in blank honey(n=6)

2.5實(shí)際樣品分析

采用本方法對(duì)246個(gè)天然蜂蜜樣品和276個(gè)市場(chǎng)抽檢蜂蜜樣品進(jìn)行分析。天然純正蜂蜜中有11個(gè)油菜蜜檢出苯甲酸，含量為0.6～1.3 mg/kg，而其他純正樣本均不含4種分析物，推測(cè)這是由于油菜對(duì)苯甲酸有一定的富集效應(yīng)，但有待于進(jìn)一步研究。市場(chǎng)抽檢蜂蜜樣品中有32個(gè)樣品檢出苯甲酸，含量為10.5～433.9 mg/kg，苯甲酸含量明顯高于上述純正油菜蜜；11個(gè)樣品檢出安賽蜜，含量為8.5～160.2 mg/kg。采用已有的蜂蜜摻假檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[17]和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部方法對(duì)檢出苯甲酸和安賽蜜的市場(chǎng)抽檢樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明這些樣本均為摻假蜂蜜。

3　結(jié)　論

本文建立了一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、快速、靈敏、環(huán)境友好的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定蜂蜜中苯甲酸、山梨酸、安賽蜜和糖精鈉的方法。高分辨質(zhì)譜在樣品分析中能夠消除基質(zhì)干擾，提高分析定性的準(zhǔn)確性。該方法適用于蜂蜜中防腐劑和甜味劑的測(cè)定，用于蜂蜜實(shí)際樣品的檢測(cè)，能有效考察苯甲酸、山梨酸、安賽蜜、糖精鈉在蜂蜜中的添加情況。

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Determination of Benzoic Acid，Sorbic Acid，Acesulfame-K and Saccharin Sodium in Honey by Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

CHEN Li-juan1，F(xiàn)EI Xiao-qing1*，TAN Meng-ru2，WU Bin1，SHEN Chong-yu1，ZHANG Rui1,DING Tao1，LIU Yun1，YANG Gong-jun2

(1.Laboratory of Food，Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing210001，China；2.College of Pharmacy，China Pharmaceutical University，Nanjing211198，China)

A method based on ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry was developed to separate benzoic acid，sorbic acid，acesulfame-K and saccharin sodium in honey.The targeted compounds in honey samples were extracted with methanol-water mixtures(10∶90),and separated on a Diamonsil Plus C18column with 0.5 mmol/L ammonium acetate-methanol as mobile phase by gradient elution.The qualitative and quantitative analyses were operated under t-MS2by high resolution mass spectrometry with the external standard method.The results indicated that four analytes had good linearities in the concentration range of 0.02-2.0 mg/L with correlation coefficients of 0.998 7-0.999 7.The quantilition limits for benzoic acid，sorbic acid,acesulfame-K and saccharin sodium were 0.5，0.5，0.3,0.3 mg/kg，respectively.The recoveries of four compounds at three spiked levels were in the range of 89.0%-104.0%，with relative standard deviations(RSDs) of 2.0%-7.9%.The method was simple and rapid，and was suitable for the determination of benzoic acid，sorbic acid and acesulfame-K，saccharin sodium in honey.

honey；high resolution mass spectrometry(HRMS)；ultra high performance liquid chromatography(UPLC)；preservative；sweetener

2016-03-11；

2016-04-06

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015IK138)；江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015KJ31)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21275162)

費(fèi)曉慶，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：食品分析與食品摻假鑒別，Tel：025-52345193，E-mail：dii01208@163.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.012

O657.63;S482.294

A

1004-4957(2016)09-1142-05