五味子和芍藥醇提取物對(duì)氣道成纖維細(xì)胞增殖的影響

楊 柳，黃 科，楊 艷，陳 霞，馮 靜

·論著·

五味子和芍藥醇提取物對(duì)氣道成纖維細(xì)胞增殖的影響

楊 柳，黃 科，楊 艷，陳 霞，馮 靜

目的 探討芍藥和五味子醇提取物對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖活性的影響。方法 采用滲濾提取法制備芍藥和五味子醇提取液，分別用0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、1.25 g/ml醇提取物刺激人胚肺成纖維細(xì)胞72 h，觀察醇提取物對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞形態(tài)、增殖活性、細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 不同濃度醇提取物均可抑制成纖維細(xì)胞增殖，但無明確的量效關(guān)系；醇提取物濃度達(dá)到0.0625 g/m l時(shí)，不僅能抑制人胚肺成纖維細(xì)胞增殖，且可將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，減少進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞。結(jié)論 芍藥和五味子醇提取物可有效抑制人胚肺成纖維細(xì)胞增殖，且0.0625 g/m l可能為最適宜濃度。

醇提取物；氣道成纖維細(xì)胞；增殖；濃度

氣道重塑是哮喘的重要病理特征之一，也是哮喘難以治愈的關(guān)鍵因素。在哮喘病程中，氣道上皮細(xì)胞在炎癥因子作用下分泌大量促纖維化生長(zhǎng)因子，以及β型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β），促使成纖維細(xì)胞增生，并分化演變成肌原成纖維細(xì)胞導(dǎo)致氣道重塑。因此，抑制成纖維細(xì)胞增殖已成為控制哮喘氣道重塑的治療方向。本課題組經(jīng)多年的臨床研究，并在大量前期研究基礎(chǔ)中發(fā)現(xiàn)，具有高抗氧化活性的五味子和芍藥醇提取物對(duì)哮喘氣道重塑有良好治療效果。因此，本研究將進(jìn)一步探討此醇提取物對(duì)氣道成纖維細(xì)胞增殖活性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 人胚肺成纖維細(xì)胞株（human embryonic lung fibroblast，HELF）（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），細(xì)胞培養(yǎng)瓶（Corning公司），特級(jí)胎牛血清（GIBCO），CCK-8試劑盒（日本同仁），細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （碧云天生物技術(shù)研究所），細(xì)胞培養(yǎng)板（NEST）。

1.2 方法

1.2.1 芍藥和五味子醇提取物制備 取合格芍藥和五味子，分別粉碎，各取500 g混合，以70%乙醇潤(rùn)濕，裝滲濾筒，滲濾液位約12倍體積的70%乙醇，收集滲濾液，減壓濃縮，回收乙醇，至樣品濃度為1.6 g/m l藥材，即得。

1.2.2 不同濃度醇提取物對(duì)HELF形態(tài)的影響

原代HELF培養(yǎng)傳代至3代HELF接種于6孔板，將 1.6 g/ml醇提取物原液用生理鹽水稀釋成0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1、1.25 g/ml不同濃度，分別加入HELF培養(yǎng)板中培養(yǎng)24、48、72 h，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 不同濃度醇提取物對(duì)HELF增殖活性的作用 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HELF常規(guī)消化，調(diào)整細(xì)胞為5×104個(gè)/ml，以104個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后隨機(jī)分成6組，第1組只加入無血清DMEM 50μl作為空白對(duì)照組；2～5組加入等量的用無血清DMEM配制的醇提取液，濃度分別為0.03125、0.0625、0.125、 0.25、0.5 g/ml，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。吸出培養(yǎng)液，各孔加入10μl的CCK-8液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸棄培養(yǎng)液。應(yīng)用酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定各孔的吸光值（OD值）。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡率 取第4代生長(zhǎng)良好的HELF細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入濃度分別為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 g/ml的醇提取物，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，離心收集細(xì)胞，棄上清，用PBS洗滌3次，加入700ml/L冷乙醇2ml混勻，置于4℃冰箱固定24 h，1000 r/min離心5 min，棄乙醇，用PBS洗滌3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為4.0×105/ml，加入碘化丙錠300μl，混勻，4℃避光染色1 h，流式細(xì)胞儀（激光波長(zhǎng)488 nm）檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)CellQuest軟件分析處理得出細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度醇提取物對(duì)HELF形態(tài)的影響 鏡下可見醇提取物濃度為 1、1.25 mg/ml時(shí)，加入HELF中，細(xì)胞在24 h內(nèi)出現(xiàn)大批凋亡；而在濃度為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 g/ml時(shí)，HELF可存活 72 h。當(dāng)醇提取物濃度為 0.03125 g/m l及0.125 g/ml時(shí)，HELF的形態(tài)變化最具特征 （圖1、2）。從圖1、2中可以看出，醇提取物有明確抑制人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且隨著濃度增高抑制作用越大。

2.2 醇提取物對(duì)HELF增殖活性的影響 醇提取物作用24 h開始對(duì)HELF有明顯抑制作用，因抑制作用較強(qiáng)，在24、48、72 h時(shí)的抑制作用比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。從圖3中可以看出，0.03125 g/ml濃度組與0.0625 g/m l組比較有顯著差異（P＜0.05），而當(dāng)濃度＞0.0625 g/ml后，隨著濃度增加，OD值無顯著差異（P＞0.05）。提示0.0625 g/m l可能為抑制作用最強(qiáng)且能維持細(xì)胞活性最適宜濃度。

圖1 0.03125 9/m l醇提取物作用不同時(shí)間時(shí)，HELF的形態(tài)變化（×100）左圖：作用24 h；中圖：作用48 h；右圖：作用72 h

圖2 0.125 9/m l醇提取物作用不同時(shí)間時(shí)，HELF的形態(tài)變化（×100）左圖：作用24 h；中圖：作用48 h；右圖：作用72 h

圖3 氣道成纖維細(xì)胞增殖

2.3 不同濃度醇提取物對(duì)HELF細(xì)胞周期的影響及凋亡率 作用48 h后，隨著醇提取物濃度增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，S期細(xì)胞比例明顯減少。醇提取物濃度為0.0625 g/ml時(shí)的凋亡率顯著高于0.03125 g/ml時(shí)（P＜0.05），而后更高濃度時(shí)的凋亡率基本不再增加。見表1。

3 討論

支氣管哮喘是氣道慢性炎癥性疾病，長(zhǎng)期慢性炎癥過程中，支氣管黏膜下成纖維細(xì)胞（FB）受轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）等刺激而增殖，并產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），沉積于基底膜。最新研究發(fā)現(xiàn)，慢性未治療及激素抵抗性哮喘患者無論血液還是氣道黏膜，都存在持續(xù)高水平的FB，而這些大量的FB正是持續(xù)氣道炎癥和氣道重建的主要因素之一。另外，哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞也可吸引FB聚集，導(dǎo)致Th2淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞促進(jìn)血液FB的重塑和增生功能增強(qiáng)。氣道黏膜高水平的FB還可放大Th2淋巴細(xì)胞炎癥，甚至可增加病毒感染后炎癥反應(yīng)，釋放大量致炎因子。因此，抑制FB增殖，減少ECM產(chǎn)生，阻止哮喘氣道重建，對(duì)改善哮喘預(yù)后有重要意義。本課題組在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)了五味子和芍藥醇提取物不僅能有效改善氣道重塑，而且無論體內(nèi)或體外均具有高抗氧化活性，此提取方法已獲國(guó)家發(fā)明專利（專利號(hào)2013100708612）。

為了進(jìn)一步探求醇提取物對(duì)FB最適宜的抑制濃度，本研究將1.6 g/ml醇提取物用生理鹽水稀釋成不同濃度，加入HELF中培養(yǎng)72 h。鏡下可見1、1.25 g/ml醇提取物加入后，24 h內(nèi)HELF很快出現(xiàn)凋亡，因此，在后期測(cè)定HELF增殖曲線、凋亡率時(shí)未采用這兩個(gè)濃度。隨之，課題組檢測(cè)了醇提取物對(duì)HELF增殖活性、細(xì)胞周期的影響及48 h凋亡率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)醇提取物濃度達(dá)到0.0625 g/m l時(shí)，能有效抑制FB增殖，且可將細(xì)胞阻滯于G0/G1，減少進(jìn)入DNA合成期的細(xì)胞，因此，0.0625 g/ml可能為醇提取物抑制FB增殖的最適宜濃度。

但是，為何具有高抗氧化活性的五味子和芍藥醇提取物可有效抑制FB的增殖，加速FB的凋亡，以及這些功能是否與前期研究中提到與細(xì)胞因子水平調(diào)節(jié)有關(guān)，目前仍不清楚，還需在下一步研究中證實(shí)。

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Effects of extracts from fructus schisandrae and paeonol on airway fibroblasts proliferation

Yang Liu，Huang Ke，Yang Yan，Chen Xia，F(xiàn)eng Jing
Department of Pediatrics，Hospital 324 of PLA，Chongqing，400020，China

Objective To explore the effects of extracts from fructus schisandrae and paeonol on airway fibroblasts proliferation. Methods Extracts from fructus schisandrae and paeonol were prepared by percolation extraction method.Human embryonic lung fibroblast（HELF）was stimulated with 0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5，1 and 1.25 g/m l extracts for 72 h to observe the effects of such extracts on themorphology，proliferation activity and cell cycle of HELF.Results All extracts of different concentration could inhibit fibroblasts proliferation，but there was no clear dose-effect relationship；when the concentration of extractwas 0.0625 g/m l，the extracts could not only inhibit the proliferation of HELF but also arrest cell cycle in G0/G1，so as to reduce the number of cells entering DNA synthesis phase.Conclusion The extracts from fructus schisandrae and paeonol can effectively inhibit the proliferation of HELF，and 0.0625 g/m lmay be themostappropriate concentration.

ethanol extract；airway fibroblasts；proliferation；concentration

表1　不同濃度醇提取物對(duì)HELF細(xì)胞周期的影響及凋亡率

R 284.2

A

1004-0188（2016）10-1093-03

10.3969/j.issn.1004-0188.2016.10.001

2016-04-06）

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃（重點(diǎn)）項(xiàng)目（cstc2015jcyj BX0062）

400020重慶，解放軍324醫(yī)院兒科

陳 霞，E-mail：06chenxia@163.com