柞蠶免疫蛹粉在刺參健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

孫永欣，溫志新，米銳，孟楠，馬淑慧，李學(xué)軍，李亞潔，都興范，李樹英

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連116024）

水產(chǎn)養(yǎng)殖

柞蠶免疫蛹粉在刺參健康養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

孫永欣，溫志新，米銳，孟楠，馬淑慧，李學(xué)軍，李亞潔，都興范，李樹英*

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所，遼寧大連116024）

體外誘導(dǎo)方法制備含有抗菌活性物質(zhì)的柞蠶蛹粉，并將其以不同比例（0%、1.0%、2.0%）添加到刺參飼料中，并對照商品抗菌肽產(chǎn)品（0.5%添加），制成C、M1、M2和K幾種等能、等氮飼料，探討其在海參養(yǎng)殖中的應(yīng)用可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗菌肽添加組（K）刺參的體增重率（82.06%）顯著高于對照組（C）（64.77%）（P＜0.05），M1組比對照組提高13.4%，但差異不顯著。免疫學(xué)指標(biāo)測定中發(fā)現(xiàn)，刺參體腔細(xì)胞吞噬活性在各組間無顯著差異，但各添加組體腔液超氧化物歧化酶（SOD），M2、K組溶菌酶（LSZ）和M1、M2組酸性磷酸酶（ACP）活性與對照組相比均表現(xiàn)出顯著提高（P＜0.05），其中SOD活性M1、M2組和K組分別比對照組提高了40.24%、49.91%和61.49%；LSZ活性M2組和K組分別比對照組提高6.41%和5.48%；ACP活性，M1組和M2組分別比對照組提高了29.65%和37.34%。經(jīng)體腔注射用燦爛弧菌（Vibrio splendidus）侵染各組健康刺參，三處理組刺參均表現(xiàn)出一定的對病原菌的抵抗力，但其中K組刺參的免疫保護(hù)率最高。電鏡切片顯示，柞蠶抗菌肽和免疫蛹粉可以提高小腸絨毛的長度，但2.0%免疫蛹粉則對小腸形態(tài)產(chǎn)生一定程度的破壞。綜上，飼料添加1.0%柞蠶免疫蛹粉可有效促進(jìn)刺參生長，并提高抗病力。

刺參；柞蠶免疫蛹粉；生長；免疫；腸絨毛

刺參（Apostichopus japonicus），又稱仿刺參，作為高級滋補(bǔ)品和中醫(yī)藥膳，其被冠為肴品海八珍之首。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的突破，刺參養(yǎng)殖業(yè)已成為中國北方沿海水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要新興產(chǎn)業(yè)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)和社會效益。但隨著養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，刺參的品質(zhì)逐漸下降，良種匱乏，病害頻發(fā)，為了控制病情，在刺參育苗過程中大量使用抗生素。長期大量使用抗生素類藥物會造成一系列嚴(yán)重后果，其中最主要的是導(dǎo)致養(yǎng)殖水域生態(tài)環(huán)境污染和抗生素在養(yǎng)殖動物體內(nèi)殘留，直接危害人類公共安全（Planas和Cunha，1999）。

柞蠶蛹經(jīng)過一系列生物技術(shù)處理能夠自身產(chǎn)生抗菌物質(zhì)（包括抗菌蛋白、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等），統(tǒng)稱為柞蠶抗菌素（呂貴仁等，2011）。在柞蠶蛹誘導(dǎo)源研究中進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，注射細(xì)菌、生理鹽水、某些化學(xué)物質(zhì)均能誘導(dǎo)蛹體產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)，它們種類基本一致，只是抗菌物質(zhì)活性有所差異（周奇等，1988）。通過不同誘導(dǎo)源篩選表明，柞蠶鏈球菌誘導(dǎo)的抗菌物質(zhì)活性高，且持續(xù)時間長（張春發(fā)等，1985）。目前，關(guān)于柞蠶蛹經(jīng)誘導(dǎo)后作為抗生素替代品已在海珍品（都興范等，2000）和仔豬（李亞潔等，2016）上有了應(yīng)用研究，但在海參養(yǎng)殖中鮮見報道。本試驗擬用柞蠶鏈球菌作為誘導(dǎo)源誘導(dǎo)柞蠶蛹體制備柞蠶免疫蛹粉，添加到海參飼料中，對比市售抗菌肽，探討免疫蛹粉對海參生長和免疫的影響，為拓展柞蠶資源綜合利用，開發(fā)海參免疫增強(qiáng)劑提供思路。

1　材料與方法

1.1飼料制備柞蠶免疫誘導(dǎo)蛹粉（IPP）由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大連生物技術(shù)研究所制備得到。柞蠶抗菌肽產(chǎn)品（富力泰）由廣東海納川藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。試驗原料以海泥、鼠尾藻、魚粉等為主要原料，分別添加0%（C）、1.0%（M1）、2.0%（M2）的IPP和0.5%的抗菌肽（K）制成4種等氮、等能試驗飼料，飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。飼料原料的其他組分用粉碎機(jī)（DFY-500）粉碎至180目以上（粒徑為80 μm），用攪拌機(jī)（B10G）混合均勻后，加30%～40%的水，再次混合均勻，用制粒機(jī)擠壓成顆粒料（粒徑為1.8 mm），置于60℃烘箱中烘干，于-20℃冰箱中儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理試驗用刺參來自大連瓦房店市謝屯某育苗場，初始體重為（1.24± 0.41）g，暫養(yǎng)馴化7 d，期間投喂對照組飼料，直至刺參出現(xiàn)有規(guī)律的攝食和排便為馴化完成。挑選560只規(guī)格整齊、體色鮮亮、體質(zhì)健壯的刺參進(jìn)行試驗。

表1　試驗飼料組成及營養(yǎng)水平%

試驗于大連生物技術(shù)研究所水產(chǎn)動物養(yǎng)殖實驗室避光進(jìn)行，刺參隨機(jī)分成4個處理，分別飼喂C、M1、M2和K飼料。每個處理設(shè)4個重復(fù)，每槽35只刺參，水槽體積為40 L。每天投餌一次，投餌量為刺參體重的3%～5%，根據(jù)刺參的攝食情況，相應(yīng)調(diào)節(jié)投餌量，以幼參完全攝食并略有剩余為宜。每天換水一次，日換水量為1/2～1/3，同時清理糞便和收集殘餌，換水后投餌。每兩周徹底清理一次養(yǎng)殖水槽，試驗周期為60 d。試驗期間海水pH為7.9～8.4，養(yǎng)殖水溫16～19℃，鹽度為30～32‰。

1.3生長指標(biāo)測定在試驗開始和結(jié)束時分別對各組刺參計數(shù)，并逐一稱量個體體重，稱量前幼參禁食24 h，于干凈培養(yǎng)皿靜置5 min，待其體腔內(nèi)的水盡量排空后用電子分析天平（AL204，感量0.01 g）稱重。幼參增重率（WGR）、日增重率（WGPD）和特定生長率（SGR）、飼料系數(shù)（FC）計算公式如下：

式中：m0為刺參的平均初始體重，g；mt為刺參的平均終末體重，g；t為飼養(yǎng)時間，d；C為攝餌量（干重），g；W0為試驗刺參的初始體重，g；Wt為試驗刺參的終末體重，g。

1.4免疫指標(biāo)測定飼養(yǎng)結(jié)束后，從每個水槽中隨機(jī)抽取3只刺參樣本，用注射器從刺參腹部近口處抽取體腔液，混于同一離心管中。體腔液樣本在4℃、5000 r/min離心10 min，移取上清，分裝到離心管中-20℃凍存，用于免疫指標(biāo)測定。所有指標(biāo)在24 h內(nèi)完成分析。

1.4.1刺參體腔液超氧化物歧化酶活性測定體腔液中超氧化物歧化酶（SOD）的活力采用江蘇南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒測定。體腔液SOD酶活性單位定義為每毫升體腔液中SOD抑制率達(dá)到50%時對應(yīng)的SOD量為一個酶活性單位，U。

1.4.2刺參體腔液酸性磷酸酶活性測定體腔液中酸性磷酸酶（ACP）活性采用江蘇南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒測定。體腔液ACP酶活力單位定義為100 mL體腔液在37℃與基質(zhì)作用30 min產(chǎn)生1 mg酚為1個活力單位。

1.4.3刺參體腔液溶菌酶活力的測定體腔液中溶菌酶（LSZ）活性采用南京建成試劑盒空白對照法測定。體腔液LSZ酶活力單位定義：在37℃以每毫升刺參體腔液樣品每分鐘使吸光度降低0.001為一個酶活力單位。

1.4.4細(xì)胞吞噬率測定使用中性紅吞噬法測定各組刺參體腔細(xì)胞的吞噬活性（Sun等，2014）。每槽隨機(jī)取2個刺參樣本，抽取的刺參體腔液混于同一離心管中，用膠頭滴管反復(fù)吹打以充分混勻體腔液，無菌生理鹽水調(diào)整體腔細(xì)胞濃度為106個/mL體腔液；取100 μL體腔細(xì)胞懸液加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，孵育30 min；輕微振蕩，小心吸出未貼壁上清細(xì)胞懸液。加入100 μL 0.001 mol/L的中性紅溶液吞噬30 min；移除未被細(xì)胞吞噬的中性紅溶液，用無菌生理鹽水潤洗三遍；加入100μL細(xì)胞裂解液（1 mol/L HCL溶液4 mL加入無水乙醇96 mL，臨用前配制）以釋放吞噬細(xì)胞攝取的中性紅顆粒，裂解液處理20 min后，用分光光度計在540 nm波長處測量各組細(xì)胞裂解液的吸光度值。體腔液的細(xì)胞吞噬活性以540 nm波長下細(xì)胞裂解液的吸光度值計量。

1.5攻毒試驗飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，從每個水槽隨機(jī)抽取個體大小均一的刺參15只，合并飼養(yǎng)于兩個40 L藍(lán)色聚乙烯水槽中，每槽30頭，對刺參進(jìn)行14 d的燦爛弧菌攻毒試驗。攻毒試驗使用的燦爛弧菌（V.splendidus）為本研究所保存菌種，經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)基在搖床25℃、140 r/min培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水沖洗菌落，調(diào)整菌液濃度為5.0×108cfu/mL。菌懸液用1 mL無菌注射器注射到刺參體腔中，每只刺參注射0.2 mL菌液，將注射后1 h內(nèi)即吐臟的刺參記為死亡。攻毒期間對刺參投喂少量基礎(chǔ)飼料，及時記錄刺參死亡和吐臟數(shù)目，攻毒試驗結(jié)束后，統(tǒng)計刺參的累積死亡率，并計算免疫保護(hù)率。

其中，D0和Dt分別為攻毒過程中刺參初始只數(shù)和累積死亡只數(shù)。

1.6刺參腸道上皮細(xì)胞形態(tài)電鏡觀察試驗使用透射電鏡（TEM）觀察各處理組和對照組刺參腸道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，取各組刺參，解剖取出腸道，將中腸和后腸剪成小段于安剖瓶中2.5%戊二醛固定，4℃保存。透射電鏡樣品制備過程如下：先將戊二醛固定好的腸道小段樣品經(jīng)1%鋨酸后固定，再由乙醇系列濃度脫水，Epon 812環(huán)氧樹脂包埋，E型超薄切片機(jī)切片，醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，最后選取有代表性的視野用JEM-1200EX型透射電鏡觀察拍照。

1.7數(shù)據(jù)分析試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan’s多重法比較各組間平均值的差異顯著性，P＜0.05為顯著性差異。

2　結(jié)果

2.1柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參生長的影響?zhàn)B殖試驗期間，各組海參沒有死亡現(xiàn)象，增重率情況如表2所示。由表2可見，飼養(yǎng)結(jié)束后，刺參的增重率和特定生長率以添加柞蠶抗菌肽組（K組）最高，增重率分別比對照組和M2組提高43.69%和49.55%，均達(dá)到顯著水平（P＜0.05），其次是M1組，增重率比對照組提高13.4%，但與對照組無顯著差異（P＞0.05）。各組特定增長率（SGR）與增重率表現(xiàn)出一致的結(jié)果。

表2　柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參生長的影響（n=4）

2.2柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參體腔液免疫指標(biāo)的影響由表3可見，刺參體腔液吞噬細(xì)胞的吞噬活性各組間沒有顯著性差異（P＞0.05）；SOD活性，M1、M2和K組分別比對照組提高40.24%、49.91%和61.49%，均達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），其中K組顯著高于M1組和M2組；LSZ活性表現(xiàn)為M2、K組顯著高于對照組和M1組（P＜0.05），其中M2組比對照組提高6.41%，K組則提高5.48%；體腔液ACP活性，M1組和M2組顯著高于對照組（P＜0.05），各提高了29.65%和37.34%，K組酶活性也明顯高于對照組。

表3　柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參體腔液免疫指標(biāo)的影響（n=4）

2.3柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參抵抗病菌侵染的影響燦爛弧菌侵染對刺參累計死亡率和免疫保護(hù)率的影響表明，攝食添加柞蠶抗菌肽的刺參累計死亡率最低（13.33%），免疫保護(hù)率最高（46.67%）；免疫誘導(dǎo)蛹粉也能降低刺參被病菌侵染后的死亡率，但沒有抗菌肽效果明顯（表4）。

表4　柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參抵抗?fàn)N爛弧菌侵染的影響（n=60）

2.4柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉對刺參腸道上皮細(xì)胞形態(tài)的影響通過透射電鏡圖比較刺參中腸和后腸上皮細(xì)胞形態(tài)以及內(nèi)部細(xì)胞器種類和數(shù)量發(fā)現(xiàn)，刺參中腸上皮細(xì)胞的狀態(tài)與后腸上皮細(xì)胞相差極大，中腸上皮細(xì)胞微絨毛密集且較長，細(xì)胞中線粒體數(shù)量多，細(xì)胞間排列緊密；后腸細(xì)胞微絨毛稀疏而短，胞內(nèi)線粒體少，細(xì)胞近微絨毛端有破損。各處理組中，2.0%免疫蛹粉表現(xiàn)出較為明顯的對腸道細(xì)胞的破壞作用（表5和表6）。

表5　柞蠶抗菌肽和免疫蛹粉對刺參中腸上皮細(xì)胞的影響

表6　柞蠶抗菌肽和免疫蛹粉對刺參后腸上皮細(xì)胞的影響

3　討論

抗菌肽對畜禽和水產(chǎn)動物均具有一定的生長促進(jìn)作用。姜珊等（2011）對富吉羅非魚的研究結(jié)果表明，在一定添加水平內(nèi)，重組抗菌肽能顯著提高羅非魚的存活率、增重率和特定生長率。在本試驗中，抗菌肽組和1.0%免疫蛹粉組都呈現(xiàn)出對刺參的促生長作用。然而夏耘等（2012）發(fā)現(xiàn)，飼料中添加抗菌肽對花鱸生長和存活率均無顯著影響，溫劉發(fā)等（2007）也認(rèn)為抗菌肽制劑對斷奶仔豬的增重?zé)o顯著影響，過量添加反而會對仔豬生長不利。這說明抗菌肽對動物生長的影響可能會因飼養(yǎng)動物種類、發(fā)育階段和養(yǎng)殖環(huán)境的不同而存在差異。本研究中也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柞蠶免疫蛹粉添加量達(dá)到2.0%時，刺參的增重率與對照組相當(dāng)，可能是因為蛹粉含量過高，導(dǎo)致飼料中營養(yǎng)成分出現(xiàn)不均衡，這與桑蠶粉替代魚粉用于海參養(yǎng)殖研究中的結(jié)果類似（Sun等，2014）。

刺參體腔液細(xì)胞的吞噬活性各組間雖沒有表現(xiàn)出顯著性差異，但容易發(fā)現(xiàn)，在攝食M1組、M2組和K組飼料的刺參，體腔液中細(xì)胞的吞噬活性相比對照組都有增高的趨勢。這可能與柞蠶抗菌肽和免疫誘導(dǎo)蛹粉的使用劑量和投喂時間長短有關(guān)。在刺參的體壁防御和體內(nèi)免疫中，SOD、LSZ和ACP都發(fā)揮著重要的作用。各免疫指標(biāo)比較而言，刺參體腔細(xì)胞吞噬活性、體腔液LSZ、ACP活性均是M2組刺參最高，唯獨體腔液SOD活性是K組刺參更高，這說明體腔液SOD活性是直接與抗菌肽含量相關(guān)的。何義進(jìn)等（2011）研究顯示，日糧中添加0.1%～0.4%的抗菌肽能有效提高異育銀鯽的抗氧化能力。白燕等（2012）研究結(jié)果表明，用蠅蛆粉替代魚粉能顯著提高刺參體腔液ACP、T-SOD、LSZ和堿性磷酸酶（AKP）活性，這些研究與本試驗所得結(jié)論相近。本試驗中，刺參體腔液ACP活性三個處理組均顯著高于對照組（P＜0.05），M2組和M1組的酶活性又明顯高于K組。這說明柞蠶抗菌肽對刺參具有一定的免疫刺激作用，而免疫誘導(dǎo)蛹粉中非抗菌肽成分能更為強(qiáng)烈地刺激刺參體腔液ACP活性，其機(jī)理尚有待探討。試驗結(jié)果還表明，刺參體腔液ACP水平與體腔細(xì)胞吞噬活性和LSZ活性都存在一定程度的關(guān)聯(lián)，這可能正是ACP在海參免疫系統(tǒng)中調(diào)理作用的體現(xiàn)。

燦爛弧菌是刺參腐皮綜合癥的致病菌，對刺參的養(yǎng)殖危害嚴(yán)重。通常，被燦爛弧菌感染的刺參表現(xiàn)為軀體收縮、停止攝食，并伴有搖頭、口腫、皮膚潰爛的現(xiàn)象出現(xiàn)（Wang等，2004；Bertheussen，1982）。本試驗對受感染刺參的觀察也發(fā)現(xiàn)了上述表征。總體來看，柞蠶抗菌肽攝食組刺參的免疫保護(hù)率最高，免疫蛹粉也能增強(qiáng)刺參對燦爛弧菌的抵抗能力，說明兩者通過攝食途徑能夠調(diào)節(jié)刺參機(jī)體的免疫水平，但是機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

小腸是動物營養(yǎng)吸收的主要部位之一，動物消化的絕大部分營養(yǎng)物質(zhì)在小腸部位被吸收。王靜等（2007）研究表明，豬小腸抗菌肽能顯著提高肉雞腸道絨毛長度和腸絨毛長度與隱窩深度的比值，從而改善雞十二指腸和空腸的消化吸收功能，提高肉雞生產(chǎn)性能。郭志強(qiáng)等（2012）也發(fā)現(xiàn)，抗菌肽能夠顯著提高肉兔空腸絨毛高度以及腸絨毛與隱窩深度的比值。在水產(chǎn)動物，鮮見抗菌肽調(diào)節(jié)腸道上皮細(xì)胞形態(tài)的研究。在對水產(chǎn)動物前后腸絨毛的研究中，方靜等（1997）觀察表明，齊口裂腹魚腸上皮吸收細(xì)胞微絨毛長而密，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，存在發(fā)育良好的高爾基體；而后腸微絨毛稀而短，核上區(qū)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，這與本試驗對刺參的觀察描述相似，這種結(jié)構(gòu)特征可能意味著，刺參的前、中腸消化吸收及合成分泌功能比較強(qiáng)，后腸則較弱。本研究中對不同處理對刺參中腸和后腸影響的觀察發(fā)現(xiàn)，M2組刺參后腸微絨毛及細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所破壞，細(xì)胞近腸腔端破裂，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器外流，對中腸的觀察發(fā)現(xiàn)，三個處理組的腸上皮細(xì)胞微絨毛長度明顯比對照組更高，而M2組線粒體數(shù)量明顯變少，說明刺參中腸對免疫蛹粉營養(yǎng)物質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)運效果較差，這與M2組刺參增重率較低存在一定的聯(lián)系。大量研究都表明，食物成分能通過改變腸道菌群來破壞魚類腸道細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。用豆粕替代50%的魚粉飼喂虹鱒，會引發(fā)其腸炎疾病，表現(xiàn)為腸上皮微絨毛損壞，后腸微絨毛顯著短于前腸，密度也較飼喂魚粉組稀疏，此外，黏附在腸微絨毛的細(xì)菌也會因絨毛密度的稀疏而減少，進(jìn)而導(dǎo)致腸上皮緊致連接暴露，腸細(xì)胞壞死，使腸上皮屏障作用減弱（Cociancich等，1994）。對本試驗而言，抗菌肽能明顯提高刺參的增重率并增加中腸細(xì)胞微絨毛高度和細(xì)胞轉(zhuǎn)運吸收能力，柞蠶免疫蛹粉同樣含有抗菌類蛋白以及免疫活性物質(zhì)，但其卻呈現(xiàn)出抑制刺參生長的效果，這可能是蛹粉中的營養(yǎng)物質(zhì)與刺參營養(yǎng)需求和攝食生理不匹配造成的，營養(yǎng)成分的改變導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生移位，弧菌由前中腸轉(zhuǎn)移到本應(yīng)存在量很少的后腸，滋生并破壞上皮細(xì)胞，侵染機(jī)體，致使刺參免疫酶活性持續(xù)表達(dá)，從而影響刺參生長。M2組的數(shù)據(jù)與這一推斷是較為吻合的，但具體的原因必須要進(jìn)行更嚴(yán)格地試驗設(shè)計和推敲才能知曉。

4　小結(jié)

在本試驗條件下，飼料中添加柞蠶免疫蛹粉對刺參的生長指標(biāo)影響不顯著，但是能提高刺參免疫力并提高刺參對致病性燦爛弧菌的抵抗力，此外，添加1.0%柞蠶免疫蛹粉能提高刺參小腸絨毛長度，如升至2.0%則對小腸形態(tài)有一定程度破壞?？梢?，添加1.0%柞蠶免疫蛹粉可有效提高刺參免疫力和抗病力，且對刺參生物體無損害。

［1］白燕，王維新，遲進(jìn)坤.蠅蛆粉對刺參生長、消化和免疫力的影響［J］.飼料研究，2012，12：58～61.

［2］都興范，李樹英，石理鑫，等.柞蠶免疫活性物質(zhì)對海珍品生長發(fā)育的研究.飼料研究，2000，12：5～6.

［3］范阿南，袁杰利，康白.在水產(chǎn)養(yǎng)殖中作為生物防治因素的益生菌制劑（節(jié)譯）［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2001，13（3）：183～186.

［4］方靜，周毅.齊口裂腹魚腸粘膜上皮透射電鏡觀察［J］.水生生物學(xué)報，1997，21（1）：71～74.

［5］郭志強(qiáng)，楊奉珠，雷岷，等.抗菌肽對肉兔小腸黏膜形態(tài)，盲腸菌群和免疫功能的影響［J］.動物營養(yǎng)學(xué)報，2012，24（9）：1778～1784.

［6］何義進(jìn)，陳嘉殷，劉波，等.抗菌肽對異育銀鯽生長，免疫與抗氧化相關(guān)因子及腸道菌群的影響［J］.遼寧大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2011，38（2）：149～154.

［7］姜珊，王寶杰，劉梅等.飼料中添加重組抗菌肽對吉富羅非魚生長性能及免疫力的影響［J］.中國水產(chǎn)科學(xué)，2011，18（6）：1308～1314.

［8］李亞潔，溫志新，孫永欣，等.用添加柞蠶免疫活性蛋白的飼料飼養(yǎng)斷奶仔豬的試驗.蠶業(yè)科學(xué)，2016，42（1）：143～147.

［9］呂貴仁，劉雋彥，陳丹.柞蠶抗菌素穩(wěn)定性的研究.北方蠶業(yè)，2011，32（1）：25～26.

［10］王靜.抗菌肽對肉雞生產(chǎn)性能和免疫功能的影響研究［碩士學(xué)位論文］［D］.泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

［11］溫劉發(fā)，黃自然，黃達(dá)華，等.新型飼料添加劑抗菌肽飼養(yǎng)肉豬的效果［J］.廣東蠶業(yè)，2007，41（1）：39～41.

［12］夏耘，余德光，郁二蒙，等.飼料中添加抗菌肽和枯草芽孢桿菌對花鱸生長和非特異性免疫功能的影響［J］.淡水漁業(yè)，2012，42（1）：52～57.

［13］張春發(fā)，丁杰，盧長禎等，柞蠶抗病機(jī)制及抗病物質(zhì)的研究——柞蠶腸道致病菌誘導(dǎo)柞蠶蛹產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的比較研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，1985，11（4）：226～230.

［14］周奇，黃自然，盧蘊(yùn)良等，柞蠶蛹抗菌物質(zhì)的誘導(dǎo)源的研究［J］..華南農(nóng)學(xué)院學(xué)報，1988，4（4）：1～7.

［15］Bertheussen K.Receptors for complement on echinoid phagocytes，Ⅱ．Purified human complement mediates echinoid phagocytosis［J］.Developmental &Comparative Immunology，1982，6：635～642.

［16］Cociancich S，Dupont A，Hegy G，et al.Novel inducible antibacterial peptides from a hemipteran insect，the sap-sucking bug Pyrrhocoris apterus［J］. Biochemical Journal，1994，300（2）：567～575.

［17］Planas M，Cunha I.Larviculture of marine fish：problems and perspectives［J］.Aquaculture，1999，177（1）：171～190.

［18］Sun Y X，Chang A K，Wen Z X，et al.Effect of replacing dietary fish meal with silkworm（Bombyx mori L）caterpillar meal on growth and nonspecific immunity of sea cucumber Apostichopus japonicus（Selenka）［J］. Aquaculture Research，2014，45：1246～1252.

［19］Wang Y G，Zhang C Y，Rong X J，et al.Diseases of cultured sea cucumber，Apostichopus japonicus，in China.In：Lovatelli Alessandro，editor. Advances in sea cucumber aquaculture and management［J］.Rome：FAO，2004：297～310.■

Immunity induced pupae of Antheraea Pernyi powder（IPP）was produced by our institute，and supplemented into basic diets of sea cucumber with the different levels（0%，1.0%and 2.0%），simultaneously 0.5%merchandise antimicrobial peptides was used as a refer.Four isonitrogenous and isoenergic diets contained different levels of IPP and antimicrobial peptides were formulated named group C，M1，M2 and K，respectively.After 60 days feeding trail，growth performance，immunity，disease-resistance and intestinal epithelial cells of sea cucumber with average weight of（1.24±0.41）g were investigated to discuss its feasible application in sea cucumber culture.Results showed that the weight gain rate of group K（82.06%）adding antimicrobial peptides was significantly higher than that of group C（64.77%）（P＜0.05）.Although group M1 increased by 13.4%than the control，no significant difference was found.As to the immunological parameters，no significant difference of phagocytic activity of coelomic cells was observed among groups，while activities of superoxide dismutase（SOD）of all treated groups，lysozyme（LSZ）of groups M2 and K，and acid phosphatase（ACP）of groups M1and M2 were all significantly higher than that of the controls（P＜0.05）.Among them，the SOD of activity group M1，M2 and K increased by 40.24%，49.91%and 61.49%，respectively；the LSZ activity of group M2 and K increased by 6.41%and 5.48%，respectively；while the ACP activity of group M1 ang M2 was found 29.65%and 37.34%higher than that of the control.Infectious disease test showed that sea cucumber of three treated groups presented resistance against pathogenic bacteria to an certain extent，while group K showed the highest immune protection rate.An electron microscopic study was undertaken to investigate the effect of dietary IPP and antimicrobial peptides on intestinal villi and their villi promoting effect exhibited，however，2.0%IPP showed some damage to intestinal villi.From the above，1.0%IPP supplemented in the basic diets could increase growth performance and disease resistance of the sea cucumber in the study.

Apostichopus japonicus；immunity induced pupae of Antheraea Pernyi powder；growth；immunity；intestinal epithelial cells

資源開發(fā)利用

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161505

S963

A

1004-3314（2016）15-0019-05

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD16B09-1）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-22）；遼寧省重大科技攻關(guān)項目（2014209001）