降低日糧蛋白質(zhì)含量并補(bǔ)充氨基酸對(duì)泌乳母豬生產(chǎn)性能、乳腺吸收效率和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的影響

Manjarin R，Zamora V，Wu G，Steibel J P，4，Kirkwood R N，Taylor N P，Wils-Plotz E，Trifilo K，Trottier N L

（1.密歇根州立大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，東蘭辛48824；2.墨西哥州Montecillo研究生院，墨西哥56230；3.德克薩斯州農(nóng)工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)部，學(xué)院站77843；4.密歇根州立大學(xué)漁業(yè)和野生動(dòng)物系，東蘭辛48824；5.美國密歇根州立大學(xué)大型動(dòng)物臨床科學(xué)系，東蘭辛48824）

中國·豬營養(yǎng)國際論壇

降低日糧蛋白質(zhì)含量并補(bǔ)充氨基酸對(duì)泌乳母豬生產(chǎn)性能、乳腺吸收效率和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因表達(dá)的影響

Manjarin R1，Zamora V2，Wu G3，Steibel J P1，4，Kirkwood R N5，Taylor N P1，Wils-Plotz E1，Trifilo K1，Trottier N L1

（1.密歇根州立大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，東蘭辛48824；2.墨西哥州Montecillo研究生院，墨西哥56230；3.德克薩斯州農(nóng)工大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和營養(yǎng)學(xué)部，學(xué)院站77843；4.密歇根州立大學(xué)漁業(yè)和野生動(dòng)物系，東蘭辛48824；5.美國密歇根州立大學(xué)大型動(dòng)物臨床科學(xué)系，東蘭辛48824）

中國豬營養(yǎng)國際論壇是由美國動(dòng)物科學(xué)學(xué)會(huì)、上海亙泰實(shí)業(yè)集團(tuán)和上海優(yōu)久生物科技有限公司聯(lián)合主辦，以“凝聚全球科研力量，驅(qū)動(dòng)豬業(yè)創(chuàng)新思維”為宗旨，力邀全球一流的機(jī)構(gòu)、專家和學(xué)者，傾力打造一個(gè)動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域具有國際性、前沿性和權(quán)威性的論壇。該論壇每?jī)赡昱e辦一屆，聚焦行業(yè)發(fā)展中的熱點(diǎn)、難點(diǎn)，通過專家學(xué)者和企業(yè)領(lǐng)導(dǎo)者之間進(jìn)行開放建設(shè)性的學(xué)術(shù)探討、理論研究和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)交流，整合全球動(dòng)物營養(yǎng)領(lǐng)域最新的技術(shù)和研究成果，推動(dòng)行業(yè)發(fā)展，創(chuàng)造和提升產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

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為驗(yàn)證降低日糧蛋白質(zhì)水平并補(bǔ)充晶體氨基酸是否可以提高氨基酸用于泌乳母豬產(chǎn)奶的使用效率，試驗(yàn)選用3種日糧，蛋白質(zhì)含量分別為9.5%（不足型）、13.5%（理想型）和17.5%（標(biāo)準(zhǔn)型）飼喂泌乳母豬，各日糧氨基酸水平相同。檢測(cè)乳腺氨基酸動(dòng)靜脈濃度差（A-V）、氨基酸運(yùn)輸效率（A-V/A×100）、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體和乳蛋白基因的轉(zhuǎn)錄豐度。在第7和18天，收集采食后動(dòng)脈、乳腺靜脈血液和乳腺組織樣品。使用定量PCR測(cè)定氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體b0，+AT（SLC7A9）、Y+LAT2（SLC7A6）、ATB0，+（SLC6A14）、CAT-1（SLC7A1）、CAT-2b（SLC7A2）以及β酪蛋白（CSN2）和α乳清蛋白（LALBA）的轉(zhuǎn)錄豐度。結(jié)果表明，隨著蛋白質(zhì)含量從不足型到標(biāo)準(zhǔn)型逐漸增加，仔豬日增重呈曲線上升（線性和二次方，P＜0.03）。第7天，隨粗蛋白質(zhì)含量增加，賴氨酸和精氨酸A-V、運(yùn)輸效率呈二次方增加（P＜0.05）。第18天，隨粗蛋白質(zhì)含量增加，賴氨酸A-V呈增加趨勢(shì)（線性，P=0.08）。第7天，隨著粗蛋白質(zhì)含量增加，異亮氨酸和纈氨酸A-V增加（呈線性，分別為P=0.05和P=0.08）。第18天，異亮氨酸和纈氨酸濃度增加（呈線性，分別為P=0.04和P=0.07）。第7天，血液支鏈AA（BCAA）：賴氨酸（Lys）比值呈二次方降低（P＜0.05）。SLC7A9、SLC7A6、SLC6A14、SLC7A1、SLC7A2、CSN2和LALBA的基因表達(dá)不受日糧影響?？傊占Z蛋白質(zhì)含量從17.5%下降到13.5%，并補(bǔ)充晶體氨基酸并不影響仔豬日增重，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體或乳蛋白基因的表達(dá)，但可以增加泌乳第7天乳腺運(yùn)輸效率和賴氨酸與精氨酸動(dòng)靜脈濃度差。這種增加與血液BCAA∶Lys比值下降有關(guān)，表明氨基酸運(yùn)輸至乳腺細(xì)胞時(shí)，陽離子型AA和BCAA之間存在競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制。

氨基酸；效率；基因；哺乳期；母豬；轉(zhuǎn)運(yùn)載體

為了使豬更好地利用日糧蛋白質(zhì)，越來越多的研究關(guān)注最佳日糧氨基酸（AA）水平（NRC，2012）。有研究表明，日糧AA過量或不足引起的AA不平衡可導(dǎo)致哺乳母豬氮利用率降低，乳蛋白合成和窩增重受限（Pérez-Laspiur等，2009；Guan等，2004）。對(duì)于生長豬，減少日糧粗蛋白質(zhì)（CP）并補(bǔ)充晶體AA，可以增加賴氨酸利用效率，并降低N排泄量（Otto等，2003）。然而，關(guān)于氨基酸利用率在細(xì)胞水平上的作用機(jī)制還不是很清楚。日糧AA胞內(nèi)可利用性是由位于細(xì)胞膜上允許氨基酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)載體控制（Bro?r，2008；Palacín等，1998；Shennan等，1997）。

賴氨酸（Lys）是哺乳母豬第一限制性氨基酸（NRC，1998），因此涉及賴氨酸攝取的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能對(duì)整個(gè)乳腺日糧蛋白質(zhì)利用率發(fā)揮關(guān)鍵作用。曾報(bào)道為了滿足奶需求（Manjarín等，2011）和日糧氨基酸可利用性（Pérez-Laspiur等，2009），使編碼Lys轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因轉(zhuǎn)錄豐度增加。因此，由乳腺動(dòng)脈循環(huán)提取AA的比例反映了AA轉(zhuǎn)運(yùn)速率相對(duì)于動(dòng)脈AA可用度。本試驗(yàn)中，AA轉(zhuǎn)運(yùn)效率被定義為AA提取率。

我們推測(cè)，豬乳腺轉(zhuǎn)運(yùn)AA效率增加，與日糧CP減少并補(bǔ)充晶體AA相關(guān)，這種增加是通過編碼Lys轉(zhuǎn)運(yùn)載體的乳腺基因mRNA豐度增加來調(diào)控。本試驗(yàn)?zāi)康模海?）檢測(cè)減少日糧蛋白質(zhì)，并補(bǔ)充晶體AA，是否可以通過乳腺奶產(chǎn)量來使Lys利用效率增加；（2）對(duì)編碼特定乳腺Lys轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和主導(dǎo)乳腺合成乳蛋白的基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。

1　材料與方法

本研究中所有動(dòng)物試驗(yàn)程序由密歇根州立大學(xué)動(dòng)物護(hù)理學(xué)院和使用委員會(huì)批準(zhǔn)（AUF號(hào)為10 /08-162-00）。

1.1動(dòng)物和組織收集試驗(yàn)選用24頭經(jīng)產(chǎn)母豬（長×大），3個(gè)重復(fù)（組）。每組被定義為一個(gè)產(chǎn)仔周期，第一組和第二組包含9頭母豬，第三組包含6頭母豬。試驗(yàn)中3頭母豬由于采食量過低或?qū)Ч芟嚓P(guān)問題被踢除；因此，第一組和第二組分別包含8頭和7頭母豬。整個(gè)研究過程中所有母豬單獨(dú)飼養(yǎng)在20℃分娩欄中。預(yù)產(chǎn)期前一周，母豬被隨機(jī)分配給三種日糧：9.5%的CP（不足型；N=8），13.5%的CP（理想型；N=6）和17.5%的CP（標(biāo)準(zhǔn)型；N=7）。分娩前所有母豬每天兩次飼喂，共2.5 kg日糧（飼喂基礎(chǔ)）。分娩后的第二天當(dāng)作哺乳期第1天，分別在8∶00和16∶00飼喂母豬1 kg飼料。哺乳期第2和3天，分別飼喂母豬3、4 kg。其他時(shí)間，每天最多飼喂5.5 kg，以確保所有母豬干物質(zhì)采食量均等。整個(gè)哺乳期每天記錄母豬采食量。自由飲水。泌乳期第2和18天記錄母豬體重?？傊丶s15 kg的仔豬在出生后24 h內(nèi)完成交叉寄養(yǎng)，每窩均分8頭仔豬。哺乳期第2和18天記錄窩重，第21天斷奶。

1.2日糧處理和飼料營養(yǎng)分析不足型、理想型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧中分別含有0.50%、0.81%、1.01%的標(biāo)準(zhǔn)回腸可消化（SID）Lys（表1）。通過向標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加淀粉和蔗糖降低CP含量，以得到理想型和不足型日糧，但整個(gè)日糧保持豆粕玉米比例不變。理想型日糧中添加晶體AA以滿足哺乳10頭仔豬的母豬對(duì)必需氨基酸需求和AA∶Lys比，預(yù)測(cè)仔豬日增重為200 g/d，母豬采食量為4.61 kg/d，哺乳期體重變化為-10 kg（NRC，1998）。標(biāo)準(zhǔn)型日糧中添加晶體L-賴氨酸，使其比理想型高30%（即為1.01%和0.81%SID）。標(biāo)準(zhǔn)日糧中賴氨酸量按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)選擇（安大略省，圭爾夫大學(xué)；美國農(nóng)業(yè)部，農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院）。為了滿足NRC（1998）AA∶Lys比例，并維持與理想型日糧相同的AA配方，標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加晶體AA。不足型日糧中添加L-賴氨酸以滿足0.50%的SID賴氨酸，從而實(shí)現(xiàn)不足型、理想型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧之間SID賴氨酸相近。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)型日糧，添加晶體AA以確保與理想型日糧有相同的AA∶Lys比例。此外，日糧中添加大豆油以減少粉塵并改善適口性，Solka-Floc（紐約，國際纖維有限公司）用來平衡整個(gè)日糧纖維水平。

每組制備新鮮日糧，避免長期儲(chǔ)存3個(gè)不同批次的混合日糧。從每包取樣，充分混合。所有混合樣品用樣品研磨機(jī)（Cyclotec 1093；Foss Teca-tor，Eden Prairie，MN）磨細(xì)。使用燃燒測(cè)定儀（FP-2000，LECO Corp.，St.Joseph，MI）分析每個(gè)樣品的N含量，并取平均值?；旌巷暳蠘悠分邪被釢舛扔藐栯x子交換色譜分析，柱后茚三酮衍生和定量分析（農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，密蘇里大學(xué)，哥倫比亞大學(xué)，MO）。AA計(jì)算值和分析值見表2。

表2　試驗(yàn)日糧能量和營養(yǎng)成分計(jì)算值和分析值（飼喂基礎(chǔ)）

1.3基因表達(dá)分析

1.3.1樣品采集哺乳期第7天（早期）和第18天（峰值）所有母豬采食后3.5 h，根據(jù)Kirkwood等（2007）描述的方法，從第一和第二胸腺對(duì)乳腺實(shí)質(zhì)組織進(jìn)行活體檢查。乳腺組織收集期間，仔豬被隔離在配備有保溫?zé)舻南噜彊??；顧z后，將乳腺組織快速冷凍在液氮中，-80℃保存。活檢后3 h，仔豬被送回母豬欄，并允許哺乳。

1.3.2RNA提取和cDNA合成用試劑盒從乳腺組織提取核糖核酸（PerfectPure RNA細(xì)胞與組織試劑盒；PRIME，馬里蘭州蓋瑟斯堡）。對(duì)分離的RNA進(jìn)行定性和定量測(cè)定（安捷倫科技帕洛阿爾托，加利福尼亞安捷倫生物分析儀2100與核糖核酸6000納米芯片實(shí)驗(yàn)室）。所有樣品RNA完整性數(shù)值范圍為8.7～10。每個(gè)樣品使用2 μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板合成互補(bǔ)DNA（SuperscriptⅢ反轉(zhuǎn)錄酶和寡（dT）15-18引物；英杰公司，卡爾斯巴德，加利福尼亞州）。用分光光度法對(duì)最終cDNA濃度進(jìn)行定量分析（NanoDrop 1000；Thermo Scientific，Waltham，MA），然后工作原液稀釋至10 ng/μL，并于-20℃儲(chǔ)存。

1.3.3引物設(shè)計(jì)參考基因和靶基因的引物序列分別見表3和表4。本試驗(yàn)中，每個(gè)靶基因被稱為所編碼蛋白質(zhì)的通用名稱。因此，SLC7A9將被稱為b0，+AT，SLC7A7稱為y+LAT1，SLC7A6稱為y+LAT2，SLC6A14稱為ATB0，+，SLC7A1稱為CAT-1，SLC7A2稱為CAT-2b，CSN2稱為β-酪蛋白，LALBA稱為α-乳蛋白。依據(jù)先前的研究選擇備選參考基因（Tramontana等，2008；Bionaz和Loor，2007），但本試驗(yàn)所用的引物與已經(jīng)發(fā)表的文章里反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）的優(yōu)化效率不同。引物設(shè)計(jì)依據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心公開可用的豬cDNA和表達(dá)序列標(biāo)簽序列（貝塞斯達(dá)，MD），使用缺省設(shè)置的軟件數(shù)據(jù)庫（引物設(shè)計(jì)軟件3.0版）。設(shè)計(jì)的引物與已發(fā)表的豬、人、牛和大鼠的基因組序列比對(duì)，核苷酸序列配對(duì)顯示出顯著對(duì)齊（即高的查詢覆蓋率），而其他物種所提到的蛋白比對(duì)被丟棄。本研究沒有對(duì)引物對(duì)擴(kuò)增子進(jìn)行序列測(cè)定。形成引物二聚體的判斷是基于RT-qPCR反應(yīng)后解離曲線中單峰的存在。引物設(shè)計(jì)不是跨兩個(gè)外顯子結(jié)合。然而，提取RNA所用的方法為下一步柱上DNase處理的DNA裂解消除了基因組DNA（PerfectPure RNADNase，蓋瑟斯堡，馬里蘭州）。使用引物優(yōu)化矩陣來優(yōu)化引物對(duì)濃度（Mikeska和Dobrovic，2009），并用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定效率（Yuan等，2006）。用所有樣品的RNA庫合成cDNA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，cDNA含量為（一式兩份）：40、20、10、5、2.5 ng。每個(gè)基因RT-qPCR反應(yīng)效率由Yuan等（2006）描述的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算，公式為（10-1/斜率-1）×100。引物的特異性雜交通過RT-qPCR擴(kuò)增末端解離曲線中特有峰的存在驗(yàn)證。所有RT-qPCR模板包含非模板鏈，以驗(yàn)證引物擴(kuò)增不含污染的DNA。

表3　反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）參考基因引物信息

1.3.4參考基因選擇使用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（Larionov等，2005）作為RT-qPCR方法來測(cè)定潛在參考基因的mRNA豐度。如Vandesompele等（2002）所描述，標(biāo)準(zhǔn)曲線中相對(duì)mRNA量直接被輸入到軟件（geNorm，http：//medgen.ugent.be/～jvdesomp/genorm），選擇分析設(shè)置中最穩(wěn)定的參考基因，簡(jiǎn)單地說，每個(gè)基因的表達(dá)穩(wěn)定值被確定為所有參考基因中每個(gè)基因的平均成對(duì)變異，而所用的參考基因數(shù)目由2個(gè)連續(xù)的歸一化因子之間的配對(duì)變異分析值計(jì)算。此類歸一化因子是基于n和n+1最佳參考基因表達(dá)的幾何平均值（Vandesompele等，2002）。

表4　反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）靶基因引物信息

1.3.5RT-qPCR分析反轉(zhuǎn)錄定量PCR反應(yīng)使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司MicroAmp光學(xué)96孔反應(yīng)板進(jìn)行。向每個(gè)孔中加入3 μL（30 ng）模板cDNA，12.5μL SYBR熒光標(biāo)記物（Applied Biosystems公司），10 μmol/L正向和反向引物各6 μL，3.5 μL經(jīng)焦碳酸二乙酯處理不含核苷酸的水（DEPC-水）（Fisher Scientific公司，新澤西州）。將板密封，于15℃、400 g離心1 min，置于系統(tǒng)中（ABI PRISM7000序列檢測(cè)系統(tǒng)，Applied Biosystems公司）。擴(kuò)增程序包括2個(gè)初始步驟（50℃，2 min；95℃，10 min），接著進(jìn)行40次循環(huán)（95℃，15 s；60℃，1 min）和解離曲線（95℃，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s）。用7000 RQ序列檢測(cè)系統(tǒng)軟件2.2.1版本（應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）分析數(shù)據(jù)。

1.3.6RT-qPCR數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化靶基因表達(dá)值的標(biāo)準(zhǔn)化是按照以下公式計(jì)算：

式中：ΔCtijk為第j頭母豬、哺乳第i階段、第k天日糧標(biāo)準(zhǔn)化目標(biāo)基因的表達(dá)；CtCijk、CtRijk分別是目標(biāo)基因和參考基因閾值循環(huán)?；虮磉_(dá)結(jié)果顯示ΔCt值往往令人困惑，因?yàn)棣t的增加反映了mRNA豐度降低。因此，在統(tǒng)計(jì)分析之前或之后從常量中減去ΔCt值，使得對(duì)數(shù)據(jù)的解釋更簡(jiǎn)單，從而增加的ΔCt值與增加的mRNA豐度相對(duì)應(yīng)，而不改變P值或SE值。為了進(jìn)一步簡(jiǎn)化對(duì)結(jié)果的解釋，這個(gè)常數(shù)選擇為大于所有基因中任何ΔCt值的最大數(shù)值。因此，在圖中所有的值都是正的。

1.3.7AA轉(zhuǎn)運(yùn)至乳腺效率分析如Trottier等（1997）所述，每組日糧處理的5頭母豬在哺乳期第3天和第4天插入乳腺靜脈和頸動(dòng)脈導(dǎo)管。每12 h用無菌肝素化（20 U/mL）的鹽溶液（0.9%）導(dǎo)管沖洗，以維持肝素環(huán)境。采樣前一晚飼喂母豬1 kg料，以保證第二天早上日糧被完全消耗。哺乳期第7天和第18天，所有母豬在8∶00喂2 kg飼料，從8∶30到11∶30每隔30 min采集血液樣品。用注射器同時(shí)采動(dòng)脈和靜脈血（各8 mL），并轉(zhuǎn)移到樣品管（內(nèi)含0.147 mL的75 g/L EDTA溶液；Becton Dickinson公司，富蘭克林湖，新澤西州）。前3 mL被丟棄，以消除被肝素稀釋的影響。血液樣品在600 g離心10 min，并將血漿于-20℃儲(chǔ)存。通過鄰苯二甲酸衍生后，使用HPLC檢測(cè)血漿中的游離AA（Li等，2011；Wu和Meininger，2008）。

將每天3.5 h收集的母豬血漿樣品進(jìn)行混合，每個(gè)混合樣當(dāng)作一個(gè)樣品單位。計(jì)算出第7和18天的AA轉(zhuǎn)運(yùn)效率作為AA循環(huán)占整個(gè)乳腺的百分比：

式中：Yij為j頭母豬哺乳第i階段AA運(yùn)輸效率；A-V是動(dòng)脈和靜脈AA濃度之差。乳腺總DNA定量。

根據(jù)Labarca和Paigen的方法（1980）使用冷高氯酸提取乳腺組織中總DNA（Sigma-Aldrich公司，圣路易斯，密蘇里州）。提取后，通過雙苯酰亞胺分光光度法（Hoechst 33258，Sigma-Aldrich公司）和酶標(biāo)儀（Bio-Tek FL600，360/460 nm）對(duì)DNA進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示為μg/mg乳腺組織。）。

1.4數(shù)據(jù)分析使用SAS統(tǒng)計(jì)軟件單變量程序下Shapiro-Wilk檢驗(yàn)做正態(tài)分布分析。使用線性混合模型，將日糧、泌乳階段和互作效應(yīng)作為固定因子，母豬和分組作為隨機(jī)因子，母豬初始體重和胎次作為協(xié)變量，分析仔豬ADG、母豬體重?fù)p失、窩增重、母豬飼料和蛋白采食量、乳腺組織DNA濃度、ΔCt、血漿AA水平、A-V和轉(zhuǎn)運(yùn)效率以及血漿支鏈AA（BCAA）。該統(tǒng)計(jì)模型是：

式中：Yij是哺乳階段（i）測(cè)得的變量（j），μ是總平均值，αi是i階段日糧的固定效應(yīng)，γi是第i個(gè)泌乳階段的固定效應(yīng)，αiγi是第i階段日糧和泌乳之間的交互作用，βi是與協(xié)變量母豬初始體重相關(guān)變量的回歸系數(shù)，xij表示為第j頭母豬在哺乳期第i階段的初始體重，x是所有母豬初始體重的平均數(shù)，β2是與協(xié)變量母豬肽次相關(guān)變量的回歸系數(shù)，yij是第j頭母豬第i泌乳階段的肽次，y是整期肽次平均值，bj是母豬的隨機(jī)效應(yīng)，cj是欄的隨機(jī)效應(yīng)，eij是試驗(yàn)誤差。

使用線性和二次方對(duì)照分析日糧CP攝入、哺乳天數(shù)及其交互作用。交互作用不顯著時(shí)，以主效應(yīng)的P值作為結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為最小二乘方平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。P≤0.05表示差異顯著，P≤0.1表示有差異趨勢(shì)。

2　結(jié)果

由表5可見，日糧CP攝入不影響采食量，哺乳期第7天到第17天，飼料和日糧CP攝入均明顯升高（P＜0.01）（結(jié)果未顯示）。不同日糧間第1天或第17天母豬體重和產(chǎn)仔數(shù)沒有明顯差異。仔豬日增重（線性，P=0.03；二次方，P=0.01）和窩增重（線性，P=0.07；二次方，P=0.01）隨著日糧CP水平增加而增加。日糧或哺乳階段對(duì)乳腺DNA濃度沒有影響。

參考基因MTG1、MRPL39和VAPB具有最小平均值（穩(wěn)定值），因此被選擇為豬乳腺組織中最穩(wěn)定的基因模型（圖1）。連續(xù)歸一化因子之間的成對(duì)變異分析低于0.15臨界值，參考基因的最佳數(shù)目是3。第四基因的加入增加了（V2/3=0.11，V3/ 4=0.12）成對(duì)變異（圖2）。編碼基因b0，+AT、y+LAT2、ATB0，+、CAT-1、CAT-2b、β酪蛋白、α乳蛋白的表達(dá)不受日糧影響（表6）。

動(dòng)脈必需AA濃度、A-V濃度差、整個(gè)乳腺運(yùn)輸效率分別見表7、表8和表9。動(dòng)脈非必需AA濃度、A-V濃度差、整個(gè)乳腺運(yùn)輸效率分別見表10、表11和表12。哺乳第7和8天，隨著CP濃度增加，動(dòng)脈纈氨酸濃度呈線性增加（P＜0.01），而亮氨酸呈曲線增加（線性，P=0.001；二次方，P＜0.01）（表7）。第7天賴氨酸（線性，P=0.06）和異亮氨酸（線性和二次，P=0.08）有增加的趨勢(shì)，第18天賴氨酸呈線性增加（P=0.01），異亮氨酸呈曲線增加（線性，P=0.02；二次方，P=0.08）。哺乳第7天（P=0.09）和18天（P=0.07）精氨酸呈線性增加趨勢(shì)。

表5　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)母豬、仔豬性能和乳腺組織DNA濃度的影響

圖1　參考基因API5、MRPL39、VAPB、MTG1、RPS21、ACTB和GAPDH的平均表達(dá)穩(wěn)定性值

圖2　歸一化因子NFn和NFn+1之間的成對(duì)變異系數(shù)（Vn/Vn+1），來確定標(biāo)準(zhǔn)化參考基因的最佳數(shù)目

第7天，賴氨酸和精氨酸的動(dòng)靜脈濃度差（P＜0.03）和傳輸效率（P＜0.05）明顯呈二次方增加，而隨著CP比例增加異亮氨酸動(dòng)靜脈濃度差（P= 0.05）和運(yùn)輸效率（P=0.08）呈線性增加趨勢(shì)（表8和表9）。同樣的，隨著日糧CP增加纈氨酸動(dòng)靜脈濃度差呈線性增加趨勢(shì)（P=0.08）。第18天，隨著CP比例增加，賴氨酸和纈氨酸動(dòng)靜脈濃度差呈線性增加趨勢(shì)（P＜0.08），亮氨酸的動(dòng)靜脈濃度差明顯呈線性增加趨勢(shì)（P=0.04），蘇氨酸動(dòng)靜脈濃度差呈曲線增加趨勢(shì)（線性，P=0.06；二次方，P= 0.09）。第18天整個(gè)日糧運(yùn)輸效率沒有改變。

表6　通過反轉(zhuǎn)錄定量PCR（RT-qPCR）對(duì)編碼母豬乳腺組織中AA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和乳蛋白基因的mRNA豐度的定量分析

動(dòng)脈BBCA∶Lys比例見表13。第7天隨著CP水平增加，血漿總BCAA∶Lys、Leu∶LYS和Ile∶Lys先降低后增加（二次方，P＜0.03），同樣，血漿Val∶Lys也先下降再升高（線性，P=0.05；二次方，P= 0.09）。哺乳第7和18天不同日糧血漿Arg：Lys保持不變。

3　討論

大多數(shù)研究關(guān)注于優(yōu)化哺乳母豬日糧賴氨酸攝取來最大化窩增重（Kim等，1999；Yang等，2000；Dourmad等，1998；NRC，1998），但很少有研究關(guān)注調(diào)節(jié)賴氨酸用于乳蛋白產(chǎn)量的利用效率這一機(jī)制?？梢栽O(shè)計(jì)一個(gè)試驗(yàn)方案，以最優(yōu)化賴氨酸利用效率用于窩增重和減少氮素?fù)p失到環(huán)境中。第一步，賴氨酸用于奶產(chǎn)量的利用效率涉及乳腺細(xì)胞賴氨酸攝取，位于細(xì)胞膜上轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的過程（Shennan和Peaker，2000；Shennan等，1997）。本研究評(píng)估飼喂NRC（1998）提出的最佳必需AA時(shí)，整個(gè)乳腺賴氨酸運(yùn)輸是否受日糧CP影響。本研究中，在日增重、母豬體重?fù)p失、采食量的基礎(chǔ)上，預(yù)測(cè)不足型、理想型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧的SID Lys需求量分別為0.82%，0.91%和0.85%（NRC，2012）。日糧包含0.60%、0.85%和1.11%的SIDLys分別表明不足型、理想型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧中Lys供應(yīng)為明顯缺乏、少量缺乏和過量。然而，尤其是對(duì)理想型日糧來說，這種預(yù)測(cè)并不是基于經(jīng)驗(yàn)而得出降低日糧粗蛋白質(zhì)含量，很可能是本研究中理想型日糧需要增加賴氨酸利用率。例如，不足型、理想型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧中凈賴氨酸攝?。〝?shù)據(jù)未示出）與平均日增重比率估計(jì)分別為0.099、0.093和0.095。此研究中觀察到的日增重對(duì)應(yīng)日糧蛋白質(zhì)結(jié)果與Pérez-Laspiur等（2009）和Guan等（2004）報(bào)道類似。然而，在研究中，賴氨酸需要量?jī)H達(dá)到18%日糧蛋白質(zhì)；因此，日糧蛋白質(zhì)水平超過曾報(bào)道的添加量（18%），日增重才能最大化。與此研究相似，Guan等（2004）報(bào)道，在最大平均日增重時(shí)，動(dòng)靜脈濃度差、賴氨酸和精氨酸的提取效率最大。先前關(guān)于賴氨酸和精氨酸增加與較高的日增重相對(duì)應(yīng)，這一機(jī)制研究是有限的。Pérez-Laspiur等（2009）報(bào)道隨著日糧Lys和CP從不足到過量逐漸增加，乳腺組織編碼CAT-2b的基因（SLC7A2）表達(dá)量呈線性降低。本試驗(yàn)中，我們進(jìn)一步探討了在飼喂理想型和低蛋白質(zhì)日糧時(shí)，負(fù)責(zé)Lys和Arg轉(zhuǎn)運(yùn)的其他基因是否與日糧Lys和Arg可利用率相對(duì)應(yīng)。

表7　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)哺乳期第7天和第18天母豬動(dòng)脈AA濃度的影響μmol/L

表8　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)哺乳期第7天和第18天母豬乳腺動(dòng)靜脈AA之差的影響μmol/L

表9　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)哺乳期第7和天第18天母豬乳腺AA運(yùn)輸效率影響%

表10　哺乳期第7天和第18天日糧粗蛋白濃度對(duì)母豬乳腺動(dòng)脈AA比率的影響

表11　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)哺乳期第7天和第18天母豬動(dòng)脈非必需AA濃度的影響μmol/L

表12　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)哺乳期第7天和第18天母豬乳腺動(dòng)靜脈非必需AA差異的影響μmol/L

表13　日糧蛋白質(zhì)水平對(duì)哺乳期第7天和第18天母豬乳腺非必需AA運(yùn)輸效率的影響%

已知促進(jìn)賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中的蛋白質(zhì)包括y+系統(tǒng)中AA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特異性陽離子型AA（Shennan和Peaker，2000；Palacín等，1998），其中2個(gè)已經(jīng)確定在哺乳母豬乳腺組織中，即CAT-1和CAT-2b（Pérez-Laspiur等，2009、2004）。賴氨酸也可通過與BCAA共享系統(tǒng)，如B0，+、b0，+和y+L系統(tǒng)，這些系統(tǒng)中，已有報(bào)道蛋白質(zhì)ATB0，+、b0，+AT和y+LAT2在豬乳腺組織中表達(dá)，并在預(yù)翻譯水平調(diào)節(jié)（Manjarín等，2011；Pérez-Laspiur等，2009、2004）。在本研究中，隨著蛋白質(zhì)從17.5%（標(biāo)準(zhǔn)型）降低為13.5%（理想想），Lys和Arg運(yùn)輸效率增加，但不同日糧和整個(gè)泌乳階段CAT-1、CAT-2b、ATB0，+、b0，+和y+LAT2基因的表達(dá)不變。運(yùn)輸效率的這種變化很可能與乳腺細(xì)胞數(shù)增加無關(guān)，因?yàn)椴煌占Z和整個(gè)哺乳期乳腺DNA濃度保持不變。在體內(nèi)試驗(yàn)（Pérez-Laspiur等，2009）和體外試驗(yàn)（Satsu等，1998）表明，隨著CP攝入降低，CAT-2b和ATB0，+基因表達(dá)具有適應(yīng)性調(diào)節(jié)。然而，本研究中，總賴氨酸（分析值）從1.24%（標(biāo)準(zhǔn)型）降到0.99%（理想型）或0.62%（不足型），可能不足以引起AA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)的改變。Pérez-Laspiur等（2009）研究表明，日糧總賴氨酸自適應(yīng)調(diào)節(jié)值為0.60%，與本試驗(yàn)中不足型日糧氨基酸數(shù)值接近，但本試驗(yàn)中SID賴氨酸濃度比Pérez-Laspiur等（2009）試驗(yàn)中低。

同樣地，哺乳期第7天和第18天所有日糧中主導(dǎo)-α-乳清蛋白和β酪蛋白的轉(zhuǎn)錄物豐度保持不變，表明乳蛋白基因表達(dá)的變化發(fā)生在哺乳期早期或者在轉(zhuǎn)錄后（也就是蛋白質(zhì)翻譯或表達(dá)）。事實(shí)上，我們先前的研究顯示豬乳腺組織賴氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和乳蛋白基因是正調(diào)節(jié)，與產(chǎn)前和泌乳第5天發(fā)生的奶需求相對(duì)應(yīng)（Manjarín等，2011）。此外，大鼠肌肉組織的研究表明，日糧AA可能通過激活哺乳動(dòng)物納巴霉素（mTOR）的靶物質(zhì)來調(diào)節(jié)mRNA翻譯和蛋白合成（Hundal和Taylor，2009；Kimball和Jefferson，2007；O’Connor等，2003）。在這方面，奶牛上研究表明mTOR途徑在泌乳期整個(gè)蛋白質(zhì)翻譯和調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用（Burgos等，2010；Hayashi等，2009；Hayashi和Proud，2007），mTOR途徑蛋白激酶的基因表達(dá)已在豬乳腺中被證實(shí)（Manjarín等，2011）。因此，本研究中觀察到的賴氨酸和精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率和仔豬日增重的增加，可能是由于AA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因在蛋白水平的正向調(diào)節(jié)。

乳腺中Lys運(yùn)輸效率的變化與BCAA∶Lys比值的變化相反。與日糧蛋白質(zhì)9.5%和17.5%相比，日糧蛋白質(zhì)13.5%哺乳期第7天飼喂理想AA配方，乳腺BCAA∶Lys比值降低，Lys轉(zhuǎn)運(yùn)效率升高。與此相反，泌乳第18天，所有日糧動(dòng)脈BCAA∶Lys比值和Lys轉(zhuǎn)運(yùn)效率保持不變。所有日糧SID BCAA∶Lys為常量時(shí)，動(dòng)脈BCAA∶Lys比值變化的生理機(jī)制尚不清楚。飼喂理想型日糧的母豬可能BCAA外周組織攝入量較高，導(dǎo)致動(dòng)脈BCAA：Lys比值降低。BCAA的代謝主要是發(fā)生在肝外組織，如肌肉和脂肪組織（Herman等，2010），是因?yàn)楦渭?xì)胞缺乏參與支鏈氨基酸氧化的BCAA氨基轉(zhuǎn)移酶（Li等，2009；Nelson和Cox，2008）。事實(shí)上，與飼喂標(biāo)準(zhǔn)型和不足型日糧的母豬相比，飼喂理想型日糧的母豬體重?fù)p失少，表明骨骼肌蛋白活性低。

在泌乳母豬（Guan等，2002）和奶牛（Bequette等，1996）上可見，蛋白質(zhì)攝入量增加，導(dǎo)致乳腺支鏈氨基酸運(yùn)輸增加，而乳蛋白含量沒有增加。因此Bequette等（1996）推測(cè)乳腺過量吸收的支鏈氨基酸可能在組織中被氧化，有可能降低日糧氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)槿榈鞍椎睦眯?。乳腺支鏈氨基酸氧化分解代謝，可通過氨基酸競(jìng)爭(zhēng)活動(dòng)對(duì)賴氨酸和精氨酸運(yùn)輸進(jìn)入乳腺細(xì)胞的效率產(chǎn)生負(fù)面影響。例如，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATB0，+，介導(dǎo)上皮細(xì)胞上陽離子和中性氨基酸的胞內(nèi)運(yùn)輸（Bro?r，2008），顯示了對(duì)支鏈氨基酸的更大親和力（Sloan和Mager，2013）。正如所提到的，本試驗(yàn)和先前的研究（Pérez-Laspiur等，2009、2004）表明在豬乳腺組織中ATB0，+轉(zhuǎn)錄明顯較高。盡管所有日糧SID BCAA∶Lys比值相似，但哺乳期第7天標(biāo)準(zhǔn)型和不足型日糧動(dòng)脈BCAA∶Lys比值明顯比理想型大，因此，不足型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧動(dòng)脈BCAA∶Lys比值的增加可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ATB0，+增加BCAA相對(duì)于Arg和Lys的競(jìng)爭(zhēng)吸收優(yōu)勢(shì)，從而導(dǎo)致豬乳腺賴氨酸和精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)效率降低。陽離子和中性AA共享氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白y+LAT2，它在豬乳腺細(xì)胞也是高度表達(dá)的（Manjarín等，2011）。相對(duì)于ATB0，+，y+LAT2是陽離子和大分子中性AA之間的必需交換工具，促進(jìn)陽離子氨基酸從細(xì)胞流出（Bro?r，2008）。在這方面，高水平的亮氨酸和纈氨酸可分別抑制賴氨酸攝取，使賴氨酸從大鼠乳腺外植體（Calvert和Shennan，1996；Shennan等，1994）和豬乳腺組織（Guan等，2002）流出增加。因此，除了通過ATB0，+優(yōu)先攝取BCAA，不足型和標(biāo)準(zhǔn)型日糧動(dòng)脈BCAA∶Lys比值的增加可能通過轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白y+LAT2促進(jìn)Lys和Arg從乳腺細(xì)胞外流來交換BCAA，導(dǎo)致豬乳腺賴氨酸和精氨酸運(yùn)輸效率下降。

哺乳期第7天飼喂理想型日糧的豬精氨酸運(yùn)輸效率提高表明精氨酸對(duì)豬乳腺重要的作用。例如，Guan等（2004）報(bào)道，日糧蛋白質(zhì)從24%過量值降低至18%需求量，動(dòng)靜脈精氨酸濃度差增大。Nielsen等（2002）報(bào)道，乳腺攝取精氨酸的增加與窩產(chǎn)仔數(shù)增大相關(guān)。精氨酸被認(rèn)為不能夠限制母豬乳蛋白合成（NRC，1998）。然而，近期研究表明，參與到乳腺組織的眾多功能AA直接與產(chǎn)奶量相關(guān)（Kim和Wu，2009）。精氨酸為血管擴(kuò)張劑一氧化氮合成的底物（Wu和Morris，1998），血液流向乳腺是乳腺AA攝取增加的主要驅(qū)動(dòng)變量，這與Nielsen等（2002）關(guān)于窩產(chǎn)仔數(shù)的研究結(jié)果相一致。然而，本研究中，理想型日糧中精氨酸較高的運(yùn)輸效率，似乎與更大血流無關(guān)。血流量依據(jù)菲克原理（Guan等，2004）估算，奶中平均賴氨酸濃度為0.386%（賴氨酸占純?nèi)榈鞍?.01%，純?nèi)榈鞍渍寄痰?.41%）。Noblet和Etienne（1989）根據(jù)窩增重和仔豬初始體重計(jì)算，不足型、標(biāo)準(zhǔn)型和理想型日糧產(chǎn)奶量分別為每天8095 L、6188 L和5671 L。這些估算值與Guan等（2004）報(bào)道結(jié)果類似，飼喂蛋白不足或過量的日糧，母豬血流量更多。Guan等（2004）認(rèn)為，乳腺通過增加血流量來補(bǔ)償賴氨酸動(dòng)靜脈濃度差下降，促進(jìn)非限制性氨基酸的吸收，從而提高代謝效率，并有可能增加能量需求。因此，不足型日糧可能是能量限制乳蛋白的合成，導(dǎo)致活性AA運(yùn)輸降低。如Mateo等（2008）所述對(duì)于精氨酸提取，保持日糧精氨酸添加可以促進(jìn)母豬產(chǎn)奶和仔豬的生長，因此乳腺組織精氨酸提取增加可以導(dǎo)致乳腺細(xì)胞精氨酸可用性增加。氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CAT-1是精氨酸進(jìn)入乳腺組織的唯一通道。CAT-1對(duì)精氨酸和賴氨酸運(yùn)輸具有高度特異性（Sloan和Mager，1999）。研究表明，乳腺組織中CAT-1 mRNA高豐度表達(dá)（Manjarín等，2011）。另外，精氨酸還參與多胺的合成，多胺是蛋白質(zhì)合成和泌乳的調(diào)節(jié)物質(zhì)（Meininger和Wu，2002；Wu和Morris，1998），脯氨酸是仔豬的一種必需氨基酸（Ball等，1986；Wu等，2011）。

綜上所述，日糧蛋白質(zhì)從17.5%下降至13.5%，并補(bǔ)充晶體氨基酸，從而實(shí)現(xiàn)“理想”氨基酸配方，并沒有影響哺乳期仔豬日增重和編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和乳蛋白的基因mRNA豐度。然而，與17.5%的日糧蛋白相比，泌乳早期（第7天）飼喂13.5%蛋白的日糧乳腺Lys和Arg運(yùn)輸效率增加，血漿BCAA∶Lys比值降低。結(jié)果表明，日糧AA用于窩生長的效率與編碼乳蛋白或AA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄無關(guān)，可能與乳腺細(xì)胞膜上陽離子和支鏈氨基酸之間存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制有關(guān)。這些結(jié)果有助于我們理解飼喂最佳氨基酸平衡的日糧，以及N利用率提高的潛在機(jī)制，為農(nóng)場(chǎng)更好地利用哺乳母豬理想蛋白質(zhì)模型提供依據(jù)。

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S816.7

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1004-3314（2016）15-0032-12