以聚苯乙烯-二乙烯苯為載體的多目標免疫親和柱的制備及應用

張家寧，丁　軻，韓　濤，陳湘寧

（北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

以聚苯乙烯-二乙烯苯為載體的多目標免疫親和柱的制備及應用

張家寧，丁軻*，韓濤，陳湘寧

（北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，食品質(zhì)量與安全北京實驗室，農(nóng)產(chǎn)品有害微生物及農(nóng)殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206）

選取3 種不同聚苯乙烯-二乙烯苯基材，通過硝基化、氨基化、活化、偶聯(lián)抗體等步驟制備免疫親和柱，用于4 種鐮刀菌毒素（玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素）的同時純化，并將3 種基材制備的免疫親和柱進行比較。以Cleanert PS型聚苯乙烯-二乙烯苯為基材制備的免疫親和柱與抗體偶聯(lián)的偶聯(lián)率為97.64%，且其空白柱對樣品的吸附作用最小，3 個加標水平下的回收率為66.16%～112.80%，相對標準偏差為3.09%～12.25%，可應用于實際樣品的純化。

聚苯乙烯-二乙烯苯；免疫親和柱；鐮刀菌毒素

鐮刀菌毒素是由真菌毒素產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物［1］，廣泛存在于各種糧食作物（如小麥、玉米等）和加工產(chǎn)品（如麥芽、啤酒和面包等），多見于潮濕環(huán)境貯藏的發(fā)霉糧食中［2-5］。經(jīng)常從受污染的糧食和飼料中被檢出的有［6-11］：T-2毒素［12］、HT-2毒素［13］、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）［14］及玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）［15-16］4 種。對于鐮刀菌毒素中DON、ZEA、T-2及HT-2這4 種毒素同時純化的前處理方法亟待選擇。

免疫親和柱是利用抗原和抗體特異性結(jié)合的特殊固相萃取小柱，能夠有效去除基質(zhì)干擾，選擇性較高［17-19］。在我國，雖然免疫親和固相萃取技術(shù)在許多實驗室已經(jīng)廣泛使用，但固相萃取材料還是主要依靠進口。目前市場上存在的免疫親和柱，其填料大多以Sepharose 4B凝膠多糖基質(zhì)為主，供應廠商單一，使用成本高昂［20-22］。選擇其他基質(zhì)作為填料，成為今后免疫親和柱的研究方向。早在20世紀60年代，就報道了采用有機聚合固相萃取材料，但有機聚合固相萃取材料的迅速發(fā)展并廣為使用是在高交聯(lián)聚苯乙烯-二乙烯苯（polystyrenedivinylbenzene，PS-DVB）材料用于固相萃取之后［23］，對PS-DVB進行各種改性，引入一些特殊的官能團，例如磺酸基等［24］，使得有機聚合固相萃取材料的應用范圍可以與硅膠為基質(zhì)的固相萃取材料媲美。有機聚合固相萃取材料不受pH值的限制，因此可以在全pH值范圍內(nèi)使用。

本實驗旨在將T-2、HT-2、DON和ZEA 4 種常見的鐮刀菌毒素的單克隆抗體同時偶聯(lián)到樹脂類多聚物載體上研究制備一種新型的免疫親和柱，克服多糖類載體機械強度差、pH值應用范圍窄和成本高的缺陷，又能實現(xiàn)4 種真菌毒素的同時純化和同時檢測，擬為解決食品中多種鐮刀菌毒素同時純化問題提供方法借鑒，也為新型基質(zhì)材料免疫親和柱有關(guān)研究的進一步開展提供有益參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

DON、ZEA、T-2、HT-2抗體 北京點石科創(chuàng)科技有限公司；Cleanert PS型PS-DVB 博納艾杰爾科技有限公司；XAD1180 N型PS-DVB 美國羅門哈斯公司；S-TR型PS-DVB 杭州爭光樹脂有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國Fisher公司；體積分數(shù)25%戊二醛溶液（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜-6410三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；Super Series超純水系統(tǒng) 艾科普公司；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 蘇州培英實驗設(shè)備有限公司；UV-2300紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀 美國賽默飛世爾公司；S-4300冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 日本日立高新技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1PS-DVB微球的氨基化

1.3.1.1硝基PS-DVB微球的制備

燒瓶中加入10.0 g PS-DVB微球，加入100 mL去離子水，配制10 g/100 mL的PS-DVB微球乳液。在50 ℃水浴中高速攪拌條件下，加入硫酸與硝酸體積比3∶2（以濃酸為基準）的混合液，反應2 h。將反應混合物注入去離子水中，過濾，并用去離子水洗滌至濾除產(chǎn)物的pH值呈中性，將洗滌后的微球37 ℃真空干燥24 h，得到淡黃色粉末。

1.3.1.2氨基PS-DVB微球的制備

取3.0 g硝基PS-DVB微球于燒瓶中，在75 ℃水浴中高速攪拌條件下，加入2 mol/L KOH溶液180 mL，加入12 g還原劑Na2S2O4，反應4 h。將反應混合物過濾，并用去離子水洗滌至濾除產(chǎn)物的pH值呈中性，將洗滌后的微球37 ℃真空干燥24 h，得到黃色粉末。

1.3.1.3產(chǎn)物的鑒定表征

用冷場發(fā)射高分辨SEM觀察微球形貌；紅外光譜儀測定微球表面官能團性質(zhì)：稱取樣品300 mg，加入300 mg溴化鉀粉末研磨，壓片法測定其紅外光譜。

1.3.2氨基PS-DVB免疫親和柱的制備

1.3.2.1氨基PS-DVB微球的活化

取3.0 g氨基化PS-DVB微球，用8 mL pH 7.0的0.1 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）分散，超聲30 min得到分散性很好的溶液。加入32 mL體積分數(shù)25%戊二醛溶液，在29 ℃水浴鍋中振蕩反應（200 r/min）3 h，停止活化。然后用pH 5.0的0.2 mol/L PBS溶液清洗3 遍，最終將活化后的樹脂材料溶解在5 mL pH 5.0的PBS溶液中，得到0.3 g/mL的樹脂微球分散液。

1.3.2.2氨基PS-DVB微球偶聯(lián)抗體的制備

取DON抗體1.25 mg，T-2、HT-2抗體0.2 mg，ZEA抗體0.3 mg，將上述抗體加入體積分數(shù)50% PBS-甘油溶液（pH 7.0 0.1 mol/L PBS、甘油各250 μL），再取1.3.2.1節(jié)活化過的樹脂微球分散液1 mL（約0.3 g），將兩者混合，25 ℃水浴鍋中振蕩反應12 h。離心取上清液用考馬斯亮藍法，按下式計算偶聯(lián)率。將混合溶液裝入2.5 mL的固相萃取空柱管，制成免疫親和柱。

1.3.3不同PS-DVB微球制備免疫親和柱的比較

分別選取3 種不同PS-DVB微球，其結(jié)構(gòu)和參數(shù)見表1。按1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法制備免疫親和柱，比較其4 種鐮刀菌毒素抗體的偶聯(lián)率及加標回收率。

表1　3種PS-DVB材料參數(shù)Table1　Working parameters of the three kinds of PS-DVB microspheres

1.3.4高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用檢測

為了獲得樣品中提取4 種鐮刀菌毒素準確的定量結(jié)果，建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。高效液相色譜系統(tǒng)由泵、脫氣機、恒溫柱箱和自動采樣器組成。電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，離子源溫度為300 ℃，霧化氣壓力為15 psi。

色譜條件：Agilent ZORBAX Bonus-RP色譜柱（50 mm×2.1 mm，3.5 μm）；柱溫20 ℃；進樣量20 μL。流動相采用乙酸銨溶液（A）-乙腈（B）溶液體系，流速為0.3 mL/min；梯度洗脫條件：0～0.1 min，B為10%；0.1～2 min，B由10%升到50%；2～10 min，B由50%升到80%；10～15 min，B為80%；15～16 min，B由80%降至10%；16～20 min，B保持10%。

質(zhì)譜記錄與分析采用MassHunter工作站采集分析軟件。電離模式、監(jiān)測離子對（m/z）和其他參數(shù)見表2。

表2　4種鐮刀菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)Table2　Instrumental parameter settings for analysis of the four Fusarium toxins

1.3.5實際樣品的純化應用

稱取面粉樣品25.0 g（精確至0.1 g）于500 mL具塞錐形瓶中，加入100 mL體積分數(shù)70%甲醇溶液，浸泡15 min，超聲振蕩40 min，過濾，取16 mL濾液，以2 mL/min的速率過免疫親和柱，再用16 mL H2O以5 mL/min的速率洗滌柱子；用1 mL 體積分數(shù)100%甲醇溶液以1 滴/s的速率洗脫柱子，將洗脫液收集于2 mL的樣液瓶中，再用1 mL H2O以5 mL/min的速率洗滌免疫親和柱，同樣收集于上述樣液瓶中。待檢測，進樣量為50 μL。

2　結(jié)果與分析

2.1微球的表征

2.1.1SEM表征

如圖1a所示，PS-DVB微球具有良好的球形度并且單分散性好，這為其進一步硝基化和氨基化提供了可靠的保證。如圖1b、c所示，Cleanert PS型PS-DVB微球在經(jīng)過氧化性和腐蝕性極強的混合酸硝化及還原劑Na2S2O4處理后，雖然保持了較好的球形度，分散性仍較好，但表面形貌遭到破壞，微球表面從光滑變粗糙。再經(jīng)活化處理后，表面形貌遭到嚴重破壞，但微球的球形度和分散性較好，有利于反應的進行。

圖1　Cleanert PS型PAS-DVB的SEM表征圖Fig.1　SEM characterization of Cleanert PS PAS-DVB

2.1.2紅外光譜表征

圖2　氨基Cleanert PS型PAS-DVB微球的紅外光譜圖Fig.2　Infrared spectrum of Cleanert PS PAS-DVB microspheres

采用KBr制樣法，設(shè)定分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32 次。從圖2可以看出，1 455 cm-1和1 494 cm-1處為苯環(huán)C—C的伸縮振動峰，699 cm-1和759 cm-1為苯環(huán)上C—H鍵的同位相面外彎曲振動吸收峰，3 020 cm-1尖銳峰為烯烴上C—H伸縮振動峰，1 540 cm-1附近C=C伸縮振動吸收。1 029 cm-1和909 cm-1為乙烯基上C—H彎曲振動的重要特征。1 676 cm-1處為C=O伸縮振動峰。3 436 cm-1為—NH2的反對稱伸縮振動峰。紅外光譜結(jié)果說明PS-DVB微球的氨基化是成功的。

2.23種PS-DVB微球制備免疫親和柱的比較

2.2.1偶聯(lián)率及抗體結(jié)合情況比較

以上3 種不同PS-DVB樹脂材料，經(jīng)過相同的處理及制備流程，根據(jù)1.3.2.2節(jié)方法和公式，計算其偶聯(lián)率，Cleanert PS、XAD1180 N、S-TR 3 種不同型號材料制備出的免疫親和柱的偶聯(lián)率分別為97.64%、89.73%、83.02%。根據(jù)3 種樹脂材料的平均粒徑計算平均體積，再根據(jù)每根柱子所填充樹脂材料的總體積，得出每根柱子包含樹脂的顆粒數(shù)，推出全部樹脂顆?？偙砻娣e的大小；結(jié)合總表面積和偶聯(lián)率，反映出每種樹脂結(jié)合抗體的情況。結(jié)果顯示，一根固相萃取空柱管內(nèi)裝填的Cleanert PS、XAD1180 N、S-TR 3 種不同型號材料的總表面積分別為360、50.53、36.64 cm2，總表面積和偶聯(lián)率成正相關(guān)。XAD1180 N和S-TR樹脂的粒徑均較大，Cleanert PS樹脂的粒徑遠小于前兩者，其與抗體偶聯(lián)情況較優(yōu)，但基質(zhì)選擇對免疫親和柱制備及偶聯(lián)情況的影響仍需進一步探索。

2.2.2空白柱吸附情況及回收率的比較

表3　3種免疫親和柱空白柱吸附及回收率情況Table3　Adsorption capacities of IAC and blank columns

將20 mL 4 種鐮刀菌毒素的混合標樣（DON 40 ng/mL，HT-2、T-2 20 ng/mL，ZEA 10 ng/mL）分別過上述3 種樹脂免疫親和柱，洗滌、洗脫，并收集洗脫液分析，做3 次平行。由于此3 種樹脂材料具有孔型或粒徑較大的特點，制備成免疫親和柱，其孔隙和樹脂間縫隙可能會對樣品有吸附作用，影響純化結(jié)果。因此，選擇3 種樹脂做成未連接抗體的空白柱，按上述步驟上樣，測定回收率及相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。如表3所示，其空白柱均對樣品有一定量的吸附，Cleanert PS樹脂為基質(zhì)材料的空白柱對樣品的吸附作用最小，且回收率最大，對4 種鐮刀菌毒素的回收率均能達到80%以上，XAD1180 N和S-TR為基質(zhì)材料的免疫親和柱不僅空白吸附作用大，回收率均較低。

綜合考慮偶聯(lián)率、空白吸附、回收率等條件，Cleanert PS型PS-DVB微球為基質(zhì)材料的免疫親和柱能較好地結(jié)合4 種真菌毒素的抗體，且吸附作用小，回收率較高，可作為制備樹脂免疫親和柱的備選材料，為以后的研究提供借鑒和參考。

2.3實際樣品的純化應用

表4　Cleanert PS型PS-DVB免疫親和柱純化后4 種鐮刀菌毒素的添加回收率Table4　Recoveries of the 4 Fusarium toxins purified by Cleanert PS PS-DVB IAC column

根據(jù)1.3.5節(jié)方法將Cleanert PS型PS-DVB基質(zhì)材料的免疫親和柱應用于實際面粉樣品，做添加回收率實驗。如表4所示，3 個加標水平下的回收率為66.16%～112.80%，RSD為3.09%～12.25%，符合痕量分析的要求，此Cleanert PS型PS-DVB基質(zhì)材料制備的免疫親和柱能用于實際樣品的純化。

3　結(jié) 論

本實驗結(jié)合近年來國內(nèi)外鐮刀菌毒素多目標分析的相關(guān)研究成果，以PS-DVB微球為材料，通過硝基化、氨基化制備成氨基化PS-DVB，以之為基材結(jié)合鐮刀菌毒素抗體，制備成能同時凈化DON、HT-2、T-2、ZEA 4 種鐮刀菌毒素的免疫親和柱，并選擇3 種不同型號的PS-DVB微球作為材料制備免疫親和柱并進行比較。其中，以Cleanert PS型PS-DVB為基質(zhì)材料制備的免疫親和柱與抗體偶聯(lián)的偶聯(lián)率為97.64%，且其空白柱對樣品的吸附作用最小，3 個加標水平下的回收率為66.16%～112.80%，RSD為3.09%～12.25%，符合痕量分析的要求，此Cleanert PS型PS-DVB基質(zhì)材料制備的免疫親和柱能用于實際樣品的純化。

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Preparation and Application of Multi-Target Immunoaffinity Columns with Polystyrene-Divinylbenzene（PS-DVB） as Carrier

ZHANG Jianing, DING Ke*, HAN Tao, CHEN Xiangning
（Beijing Key Laboratory of Agricultural Product Detection and Control of Spoilage Organisms and Pesticide, Beijing Laboratory of Food Quality and Safety, Food Science and Engineering College, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China）

Three kinds of polystyrene-divinylbenzene （PS-DVB） resins were selected to prepare immunoaffinity columns（IAC） through nitration, amination, activation, and antibody coupling for the simultaneous purification of four Fusarium toxins, zearalenone, deoxynivalenol, T-2 and HT-2 toxins. Among these, the coupling ratio of Cleanert PS-type PS-DVB IAC was 97.64% and the absorption of its blank column for samples was the lowest. The recovery of this IAC column at three spiked concentration levels was in the range of 66.16%-112.80%, and the relative standard deviation was between 3.09% and 12.25%. It can be applied to purify actual samples.

polystyrene-divinylbenzene （PS-DVB）； immunoaffinity columns （IAC）； Fusarium toxins

10.7506/spkx1002-6630-201620029

TS201.6

A

1002-6630（2016）20-0172-05

張家寧, 丁軻, 韓濤, 等. 以聚苯乙烯-二乙烯苯為載體的多目標免疫親和柱的制備及應用［J］. 食品科學, 2016, 37（20）：172-176. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620029. http：//www.spkx.net.cn

ZHANG Jianing, DING Ke, HAN Tao, et al. Preparation and application of multi-target immunoaffinity columns with polystyrene-divinylbenzene （PS-DVB） as carrier［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 172-176. （in Chinese with English abstract）DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620029. http：//www.spkx.net.cn

2016-03-09

北京市自然科學基金項目（14L00184）；北京市屬高等學校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目（CIT&TCD20154045）；2016年北京農(nóng)學院學位與研究生教育改革與發(fā)展項目（2016YJS051）

張家寧（1990—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測技術(shù)。E-mail：s631852@163.com

丁軻（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品營養(yǎng)與安全。E-mail：dingk@tom.com