基于恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)高靈敏度檢測(cè)端粒酶活性

周曉毓，張佳玉，周曼，賈紅霞

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定　071002)

?

基于恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)高靈敏度檢測(cè)端粒酶活性

周曉毓，張佳玉，周曼，賈紅霞

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002)

端粒酶延伸產(chǎn)物是具有(ggttag)n重復(fù)序列的DNA.設(shè)計(jì)1條與2個(gè)重復(fù)序列相匹配的特異性的DNA探針-(ctaacc)2使其與端粒酶延伸產(chǎn)物雜交，形成雙鏈DNA.過量的DNA探針被磁性石墨烯吸附，通過磁分離去除.利用恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(IEXPAR)對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物捕捉的DNA探針進(jìn)行快速的擴(kuò)增.用與雙鏈DNA特異性結(jié)合的SYBR Green I染料對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè).在優(yōu)化條件下，可以檢測(cè)到低至50個(gè)癌細(xì)胞中的端粒酶活性.實(shí)現(xiàn)了恒溫?cái)U(kuò)增條件下端粒酶活性的高靈敏度檢測(cè).

端粒酶活性；恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)；磁性石墨烯；實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

端粒酶是由RNA和蛋白質(zhì)組成的一種核糖核蛋白酶,具有反轉(zhuǎn)錄活性.端粒DNA是位于染色體DNA末端特殊的具有重復(fù)序列的DNA，對(duì)染色體DNA起到保護(hù)作用.端粒酶中RNA序列與端粒DNA序列互補(bǔ).端粒酶與端粒DNA結(jié)合后，會(huì)以自身的RNA序列為模板，使端粒DNA不斷復(fù)制[1,2].端粒酶活性在正常細(xì)胞(除了永生細(xì)胞，像造血細(xì)胞、干細(xì)胞、生殖細(xì)胞等)中很難被檢測(cè)到，它一般在腫瘤細(xì)胞中被激活.腫瘤細(xì)胞的強(qiáng)大活力與端粒酶密切相關(guān).通過檢測(cè)端粒酶的活性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤、癌癥的早期診斷.同時(shí)以端粒酶為靶標(biāo)分子，研究有效的端粒酶抑制劑，對(duì)開發(fā)抗腫瘤藥物具有重要意義.即使在癌細(xì)胞中，端粒酶的活性也很低，所以對(duì)端粒酶活性的檢測(cè)需要高靈敏度的分析方法.目前廣泛應(yīng)用的方法是基于PCR擴(kuò)增的端粒重復(fù)序列放大技術(shù)(TRAP)[3-5]，即先用端粒酶底物(telomerase substrate，TS)的DNA序列與端粒酶和dNTPs反應(yīng)，生成長(zhǎng)鏈端粒重復(fù)序列的DNA，該DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行電泳分離和檢測(cè).由于端粒酶延伸產(chǎn)物的3′ 端是大量的重復(fù)序列，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列不同長(zhǎng)度的DNA，這給電泳分離后的定量檢測(cè)造成困難，由此給操作帶來很大不便.之后，Szatmari[6-7]等對(duì)TRAP方法進(jìn)行了改進(jìn)，最后可得到長(zhǎng)度一致的PCR產(chǎn)物,但是PCR擴(kuò)增本身的一些缺點(diǎn)，如過程比較復(fù)雜，需要準(zhǔn)確的控溫，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)等仍然存在.

近年來人們一直努力研究建立不需要PCR擴(kuò)增反應(yīng)的端粒酶活性分析方法，如表面等離子體共振[8]、電化學(xué)分析[9-10]、量子點(diǎn)共振能量轉(zhuǎn)移[11]、端粒酶誘導(dǎo)生成金屬納米線[12]、具有催化性能的分子信標(biāo)[13]等.但由于缺乏有效的DNA放大步驟，這些方法的靈敏度都達(dá)不到TRAP的水平.恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)[14](isothermal exponential amplification reaction,IEXPAR)是一種基于聚合酶和切口酶共同作用的快速的核酸擴(kuò)增方法.IEXPAR可以在恒溫條件下對(duì)短鏈DNA(10～20個(gè)堿基)進(jìn)行有效、快速的指數(shù)擴(kuò)增.一般IEXPAR在十幾分鐘內(nèi)可對(duì)目標(biāo)分子放大106～109倍，在十幾分鐘內(nèi)能夠達(dá)到PCR過程幾個(gè)小時(shí)的擴(kuò)增效果.

磁性石墨烯對(duì)單鏈DNA具有較強(qiáng)的吸附能力，而對(duì)雙鏈DNA吸附較弱[15].本方法利用這一性質(zhì)，在端粒酶延伸產(chǎn)物與其特異性DNA探針雜交之后，在溶液中加入磁性石墨烯，通過磁分離，將過量的DNA探針去除.然后利用IEXPAR反應(yīng)對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物捕捉的DNA探針進(jìn)行快速擴(kuò)增，彌補(bǔ)了端粒酶活性檢測(cè)方法中恒溫檢測(cè)缺乏有效的擴(kuò)增手段，檢測(cè)靈敏度低的缺陷.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

StepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀(Applied Biosystems，美國(guó))用于IEXPAR反應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光測(cè)量.2720熱循環(huán)儀(Applied Biosystems，美國(guó))用于控制端粒酶延伸反應(yīng)和雜交反應(yīng)溫度.

DNA(聚丙烯酰胺電泳純化)和PBS 購(gòu)于上海生物工程公司.磁性石墨烯購(gòu)于Nanoinnova Technologies 公司.Vent (exo-) DNA聚合酶和Nt.BstNBI切口酶購(gòu)于New England Biolabs(美國(guó)).SYBR Green Ⅰ 熒光染料(20×，DMSO溶劑)購(gòu)于廈門生物技術(shù)公司.CHAPS細(xì)胞裂解緩沖溶液購(gòu)于Millipore Co.Ltd.(美國(guó)).實(shí)驗(yàn)中所用的水均為二次去離子水.

1×PBS:137 mmol/L NaCl，10 mmol/L 磷酸鹽緩沖，2.7 mmol/L KCl，pH 7.4.

端粒酶延伸反應(yīng)緩沖溶液(自己配制)：20 mmol/L Tris-HCl,1.5 mmol/L MgCl2,70 mmol/L KCl,1 mmol/L EGTA,體積分?jǐn)?shù)為0.05% Tween-20.

1×Nt.BstNBI切口酶緩沖溶液:50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，100 μg/mL BSA,pH 7.9.

1×Vent (exo-) DNA聚合酶緩沖溶液:20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.8，10 mmol/L KCl，10 mmol/L (NH4)2SO4，2 mmol/L MgSO4，體積分?jǐn)?shù)為0.1%的Triton X-100,pH 8.8.

1.2實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1端粒酶提取過程

Hela細(xì)胞從培養(yǎng)基中分離，以冷的1×PBS緩沖溶液洗滌3次，然后以2 000 r/min在4 ℃離心10 min.分離出的細(xì)胞加入冷的CHAPS細(xì)胞裂解緩沖溶液，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×104/μL，在冰上放置30 min，然后于4 ℃，12 000 r/min離心30 min.含有端粒酶的上層溶液放置在 -80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?

1.2.2端粒酶延伸過程

一定量的端粒酶提取液,0.16 μmol/L端粒酶延伸反應(yīng)引物(TS primer)，200 μmol/L 的dNTPs在端粒酶延伸反應(yīng)緩沖溶液中混合均勻，反應(yīng)體積為20 μL.將此混合液置于2720熱循環(huán)儀中，37 ℃ 孵育1 h進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng)，90 ℃ 10 min使端粒酶變性失活，終止延伸.

1.2.3端粒酶延伸產(chǎn)物與特異性DNA探針雜交及雜交產(chǎn)物的分離

取端粒酶延伸后的反應(yīng)溶液5 μL，加入5 μmol/L DNA 探針，在1×PBS緩沖溶液中進(jìn)行雜交.雜交體系為10 μL.在2720熱循環(huán)儀中95 ℃高溫變性10 min,45 ℃復(fù)性雜交20 min,降至室溫待用.向雜交反應(yīng)溶液中加入10 μL 12 mg/mL 磁性石墨烯(1×PBS懸浮)不斷振蕩,反應(yīng)20 min.溶液中過量未雜交的單鏈DNA探針，而端粒酶延伸產(chǎn)物與特異性DNA探針形成的雙鏈DNA，不易被磁性石墨烯吸附，仍然存在于溶液中.磁分離，將過量未雜交的DNA探針除去.取上清液(含有端粒酶延伸產(chǎn)物與特異性DNA探針形成的雙鏈DNA)用于恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(IEXPAR).

1.2.4恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)端粒酶活性

將含有端粒酶延伸產(chǎn)物與特異性DNA探針形成的雙鏈DNA的上清液稀釋10倍，取1 μL稀釋液與擴(kuò)增模板DNA X′-Y′、Y′-Y′、dNTPs在Nt.BstNBI切口酶緩沖溶液中混合，作為Part A.Vent (exo-) DNA聚合酶、Nt.BstNBI切口酶及SYBR Green Ⅰ熒光染料在Vent (exo-) DNA聚合酶緩沖溶液中混合，作為Part B.將Part A和Part B混合后立即放入實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng).IEXPAR反應(yīng)溫度為55 ℃，并實(shí)時(shí)測(cè)量其熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線.IEXPAR反應(yīng)溶液最終體積為10 μL，含有0.1 μmol/L擴(kuò)增模板DNA X′-Y′，0.4 μmol/L 擴(kuò)增模板DNA Y′-Y′，400 μmol/L dNTPs，1.6 U/μL Nt.BstNBI切口酶，0.44 U/μL Vent (exo-) DNA聚合酶，0.5×Nt.BstNBI切口酶緩沖溶液，0.5×Vent (exo-) DNA聚合酶緩沖溶液和0.4× SYBR GreenⅠ熒光染料.

2　結(jié)果與討論

2.1端粒酶活性檢測(cè)原理

基于恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(IEXPAR)的放大作用和磁性石墨烯的分離作用檢測(cè)端粒酶活性的原理如圖1所示.將端粒酶延伸反應(yīng)引物(TS primer)與從Hela細(xì)胞提取的人端粒酶(human telomerase)在dNTPs存在條件下進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng).端粒酶延伸產(chǎn)物中含有大量的端粒重復(fù)序列-(ggttag)n.在延伸后的反應(yīng)溶液中加入過量的與端粒重復(fù)序列匹配的DNA探針(DNA probe)進(jìn)行雜交.然后，在雜交溶液中加入磁性石墨烯(magnetic graphene).由于石墨烯對(duì)單鏈DNA具有強(qiáng)烈的吸附作用，而對(duì)雙鏈DNA的吸附作用很弱，所以未雜交的DNA探針均被石墨烯吸附，而與端粒酶延伸產(chǎn)物雜交形成雙鏈的DNA探針仍留在溶液中.磁分離后，取上清溶液用于IEXPAR反應(yīng).控制IEXPAR反應(yīng)的溫度大于DNA探針雙鏈的解鏈溫度，所以雜交的DNA探針被釋放出來，可以引發(fā)IEXPAR反應(yīng).

該IEXPAR反應(yīng)采用了2個(gè)DNA擴(kuò)增模板和2步擴(kuò)增反應(yīng).DNA探針與模板X′-Y′的3′-端相結(jié)合，在DNA聚合酶(DNA polymerase)和dNTPs存在時(shí)，DNA探針將沿?cái)U(kuò)增模板X′-Y′(amplified template X′-Y′)進(jìn)行延伸反應(yīng)形成雙鏈DNA.X′-Y′中的3′-CTCAG-5′是切口酶(nicking enzyme)特異性識(shí)別的序列，Nt.BstNbⅠ切口酶將識(shí)別它對(duì)應(yīng)的雙鏈結(jié)構(gòu)并從其后4個(gè)堿基處將引物延伸DNA鏈切斷，釋放出一個(gè)短鏈DNA Y.剩余的引物DNA鏈將繼續(xù)不斷的延伸并被切除，釋放出更多的Y，形成線性放大的機(jī)制.另一方面，DNA Y的序列與第2個(gè)擴(kuò)增模板DNA Y′-Y′(amplified template Y′-Y′)的3′-端序列匹配，所以Y將與Y′-Y′的3′-端雜交并產(chǎn)生沿Y′-Y′的延伸反應(yīng)，最后形成雙鏈DNA.Y′-Y′ 的中間具有與X′-Y′相同的切口酶識(shí)別位點(diǎn)，且Y′-Y′ 3′-端與5′-端的序列相同，所以形成的雙鏈DNA中引物延伸DNA鏈將被切口酶切斷并不斷釋放出短鏈DNA Y，Y繼續(xù)與其他的Y′-Y′雜交、延伸、被切斷，再釋放出Y，由此形成指數(shù)放大機(jī)制.以SYBR GreenⅠ作為熒光染料，實(shí)時(shí)測(cè)量該IEXPAR反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度變化.

圖1　端粒酶活性檢測(cè)原理Fig.1　Schematic representation of telomerase activity assay

2.2實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

首先利用合成的含有10個(gè)端粒重復(fù)序列的端粒酶延伸產(chǎn)物(synthetic telomerase elongated product,STEP：5'-aatccgtcgagcagagtt-(agggtt)10)作為檢測(cè)樣品對(duì)該方法中的實(shí)驗(yàn)條件，如聚合酶用量、切口酶用量和磁性石墨烯用量進(jìn)行了優(yōu)化.

2.2.1DNA聚合酶用量的優(yōu)化

STEP用量為0.4 μmol/L，石墨烯用量為12 mg/mL，切口酶用量為1.6 U/μL，改變DNA聚合酶的用量，其他實(shí)驗(yàn)條件如實(shí)驗(yàn)步驟所述，對(duì)空白和樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的測(cè)定.圖2所示，DNA聚合酶用量越多，空白和樣品出現(xiàn)熒光信號(hào)的時(shí)間越短.但樣品和空白的POI值(point of inflection，對(duì)應(yīng)于熒光強(qiáng)度曲線斜率最大點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間)在DNA聚合酶為0.44 U/μL時(shí)差別達(dá)到最大，所以選擇DNA聚合酶用量為0.44 U/μL.

a.樣品；b.空白.聚合酶用量：A.0.36 U/μL;B.0.40 U/μL;C.0.44 U/μL;D.0.48 U/μL.圖2　DNA聚合酶的用量對(duì)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的影響Fig.2　Influence of the amount of Vent (exo-) DNA polymerase on the real-time fluorescence curve

2.2.2切口酶用量的優(yōu)化

STEP用量為0.40 μmol/L，石墨烯用量為12 mg/mL，DNA聚合酶的用量為0.44 U/μL，改變切口酶用量，其他實(shí)驗(yàn)條件如實(shí)驗(yàn)步驟所述，對(duì)空白和樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的測(cè)定.圖3所示，切口酶用量越多，空白和樣品出現(xiàn)熒光信號(hào)的時(shí)間逐漸增加,但樣品和空白的POI值在切口酶為1.6 U/μL時(shí)差別達(dá)到最大，所以選擇切口酶用量為1.6 U/μL.

a.樣品；b.空白.切口酶的用量：A.1.2 U/μL;B.1.4 U/μL;C.1.6 U/μL;D.1.8 U/μL.圖3　切口酶用量對(duì)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的影響Fig.3　Influence of the amount of Nt.BstNBI nicking enzyme on the real-time fluorescence curve

2.2.3磁性石墨烯用量的優(yōu)化

STEP用量為0.4 μmol/L，DNA聚合酶的用量為0.44 U/μL，切口酶用量為1.6 U/μL，改變磁性石墨烯的用量，其他實(shí)驗(yàn)條件如實(shí)驗(yàn)步驟所述，對(duì)空白和樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度的測(cè)定.圖4所示,當(dāng)時(shí)磁性石墨烯使用12 mg/mL時(shí)樣品和空白的POI值達(dá)到最大，所以選擇磁性石墨烯用量為12 mg/mL.

a.樣品；b.空白.磁性石墨烯的用量：A.6 mg/mL；B.12 mg/mL；C.18 mg/mL；D.24 mg/mL.圖4　磁性石墨烯用量對(duì)實(shí)時(shí)熒光信號(hào)的影響Fig.4　Influence of the amount of magnetic graphene on the real-time fluorescence curve

2.3線性范圍與檢出限

根據(jù)以上確立的最佳實(shí)驗(yàn)條件，研究了不同濃度合成的端粒酶延伸產(chǎn)物-STEP的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線(圖5).結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線的POI值與STEP濃度在2×10-11～ 4×10-9mol/L內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(圖6)，其線性回歸方程為POI = -126.8-21.11 lgcSTEP，線性相關(guān)系數(shù)R為0.998 3.

STEP的濃度(mol/L)a.0;b.2×10-11；c.4×10-11；d.2×10-10；e.4×10-10；f.2×10-9；g.4×10-9.圖5　不同濃度STEP的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線Fig.5　Real-time fluorescence curves produced by STEP with different concentrations

圖6　STEP引發(fā)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線的 POI值與STEP濃度負(fù)對(duì)數(shù)值之間的線性關(guān)系Fig.6　Relationship between the POI value of the real-time fluorescence curves produced by STEP and the negative logarithm of the concentration of STEP

2.4實(shí)際樣品檢測(cè)

按實(shí)驗(yàn)過程所述，從Hela細(xì)胞中提取端粒酶.使用不同數(shù)量的端粒酶(以細(xì)胞個(gè)數(shù)計(jì)數(shù))進(jìn)行端粒酶延伸反應(yīng)，得到實(shí)際樣品的端粒酶延伸產(chǎn)物，按照建立的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)量.圖7所示,該方法可以檢測(cè)到50個(gè)Hela細(xì)胞中端粒酶的活性.控制實(shí)驗(yàn)(圖7b)是將從2 000個(gè)Hela細(xì)胞中提取的端粒酶加熱到90 ℃失活后按測(cè)定端粒酶活性的相同步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn).控制實(shí)驗(yàn)溶液與空白溶液(圖7a：無端粒酶加入)產(chǎn)生的實(shí)時(shí)熒光曲線非常相近，與樣品溶液(圖7f：2 000個(gè)Hela 細(xì)胞提取的端粒酶)產(chǎn)生的實(shí)時(shí)熒光曲線具有顯著差別，證明該端粒酶活性檢測(cè)方法的可靠性.而且實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線的POI值與相應(yīng)的癌細(xì)胞個(gè)數(shù)(amount of Hela cells)有較好的線性關(guān)系(圖8)，其線性回歸方程為POI = 49.66-0.0098A，線性相關(guān)系數(shù)R為-0.995 8.

圖7　從不同數(shù)量Hela細(xì)胞中提取的端粒酶引發(fā)的 圖8　端粒酶引發(fā)的實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線的 POI值與癌細(xì)實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度曲線 　胞個(gè)數(shù)之間的線性關(guān)系Fig.7　Real-time fluorescence curves produced by telomerase Fig.8　Relationship between the POI value of the real-timeextracted from different amount of Hela cellsfluorescence curves produced by telomerase and the amount of Hela cells

3　結(jié)論

利用恒溫指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)(IEXPAR)對(duì)端粒酶延伸產(chǎn)物特異性的DNA探針進(jìn)行放大，研究建立了靈敏的端粒酶活性檢測(cè)的方法.該方法可檢測(cè)到低至50個(gè)Hela細(xì)胞中的端粒酶活性，且通過控制實(shí)驗(yàn)證明了該端粒酶活性檢測(cè)方法的可靠性.該方法不需要熱循環(huán)，無需任何標(biāo)記，反應(yīng)時(shí)間短，分析成本低，檢測(cè)效率高，為端粒酶在恒溫條件下的高靈敏度檢測(cè)開辟了新的途徑.

[1]FENG J,FUNK W D,WANG S S,et al.The RNA component of human telomerase [J].Science,1995,269:1236-1240.

[2]COHEN S B,GRAHAM M E,LOVRECZ G O,et al,Protein composition of catalytically active human telomerase from immortal cells [J].Science,2007,315:1850-1853.DOI:10.1126/science.1138596.

[3]KIM N W,WU F.Advances in quantification and characterization of telomerase activity by the telomeric repeat amplification protocol (TRAP) [J].Nucleic Acids Res,1997,25:2595-2597.

[4]HOU M,XU D W,BJORKHOLM M,et al.Real-time quantitative telomeric repeat amplification protocol assay for the detection of telomerase activity [J].Clinical Chemistry,2001,47:519-524.

[5]WEGE H,CHUI M S,LE H T,et al.SYBR Green real-time telomeric repeat amplification protocol for the rapid quantification of telomerase activity [J].Nucleic Acids Res,2003,31:e3.DOI:10.1093/nar/gng003.

[6]SZATMARI I,ARADI J.Telomeric repeat amplification,without shortening or lengthening of the telomerase products:a method to analyze the processivity of telomerase enzyme [J].Nucleic Acids Res,2001,29:e3.

[7]SZATMARI I,TOKES S,DUNN C B,et al.Modified telomeric repeat amplification protocol:a quantitative radioactive assay for telomerase without using electrophoresis [J].Anal Biochem,2000,282:80-88.DOI:10.1006/abio.2000.4589.

[8]MAESAWA C,INABA T,SATO H,et al.A rapid biosensor chip assay for measuring of telomerase activity using surface Plasmon resonance [J].Nucleic Acids Res,2003,31:e4.DOI:10.1093/nar/gng004.

[9]SATO S,KONDO H,NOJIMA T,et al.Electrochemical telomerase assay with ferrocenylnaphthalene diimide as a tetraplex DNA-specific binder [J].Anal Chem,2005,77:7304-7309.DOI:10.1021/ac0510235.

[10]ESKIOCAK U,OZKAN A D,OZSOZ M,et al.Label-free detection of telomerase activity using guanine electrochemical oxidation signal [J].Anal Chem,2007,79:8807-8811.DOI:10.1021/ac071014r.

[11]PATOLSKY F,GILL R,WEIZMANN Y,et al.Lighting-up the dynamics of telomerization and DNA replication by CdSe-ZnS quantum dots [J].J Am Chem Soc,2003,125:13918-13919.DOI:10.1021/ja035848c.

[12]WEIZMANN Y,PATOLSKY F,POPOV I,et al.Telomerase-generated templates for the growing of metal nanowires [J].Nano Lett,2004,4:787-792.DOI:10.1021/nl049939z.

[13]XIAO Y,PAVLOV V,NIAZOV T,et al.Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity [J].J Am Chem Soc,2004,126:7430-7431.DOI:10.1021/ja031875r.

[14]VAN NESS J,VAN NESS L K,GALAS D J,Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides [J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100:4504-4509.DOI:10.1073/pnas.0730811100.

[15]LEE J,PARK II-S,JUNG E,et al.Direct，sequence-specific detection of dsDNA based on peptide nucleic acid and graphene oxide without requiring denaturation [J].Biosensors And Bioelectronics,2014,62:140-144.DOI:10.1016/j.bios.2014.06.028.

(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Sensitive detection of telomerase activity based on isothermal exponetial amplification reaction

ZHOU Xiaoyu,ZHANG Jiayu,ZHOU Man,JIA Hongxia

(College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Telomerase elongated product has many repeat sequences-(ggttag)n.A specific DNA probe-(ctaacc)2which is matched with two repeat sequences is used to hybridize with telomerase elongated product.Excess DNA probes are attached to magnetic graphene and removed by magnetic separation.The DNA probes hybridized with telomerase elongated product is rapidly amplified by isothermal exponential amplification reaction (IEXPAR).SYBR Green I is utilized for real-time fluorescent detection of IEXPAR products.Under the optimal conditions,the telomerase activity in only 50 cancer cells can be easily detected.Sensitive detection of telomerase activity under isothermal condition is achieved.

telomerase activity;isothermal exponential amplification reaction;magnetic graphene;real-time fluorescence detection

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.02.008

2015-11-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(21405032)；教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(20121301120006)

周曉毓(1990—)，女，河北阜城人，河北大學(xué)在讀研究生.E-mail: love_zhouxy@126.com

賈紅霞(1980—)，女，河北宣化人，河北大學(xué)講師，博士，主要從事生化分析及光譜分析研究.

E-mail: jia123renren@126.com

O65

A

1000-1565(2016)02-0155-07