中國少數(shù)民族全基因組DNA高通量提取及其樣本庫建立

張一鳴，王俊麗，黃婧婧，張榮榮，彭耀

(中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京　100081)

?

中國少數(shù)民族全基因組DNA高通量提取及其樣本庫建立

張一鳴，王俊麗，黃婧婧，張榮榮，彭耀

(中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京100081)

為保存中國不同民族基因組遺傳資源，建立中國少數(shù)民族全基因組DNA樣本庫.按照臨床采血標準，遵守知情同意原則，采集不同民族志愿者外周血2 mL，采用全自動核酸提取設備高通量提取DNA，經(jīng)質量控制后編號入庫，建立了包含545例樣本的中國少數(shù)民族全基因組DNA樣本庫.本研究將為研究人類起源、環(huán)境與遺傳背景相互作用提供物質基礎，為探索疾病病因、診斷技術和治療策略提供資源保障.

少數(shù)民族；全基因組；DNA樣本庫

中國是一個多民族國家，擁有世界1/5的人口，是全世界人類遺傳資源最豐富的國家.復雜的進化歷程，使56個民族在遺傳表型及表觀上存在較大的差異.中華民族呈現(xiàn)出豐富的人類遺傳多樣性，成為人類進化研究不可或缺的重要人群.人類遺傳多樣性是探討人類進化與遷徙進程、環(huán)境與遺傳信息交互作用、健康與致病因子的主要資源和工具.因此建立中國少數(shù)民族全基因組DNA樣本庫，既是研究中華民族起源、不同民族群體相互關系、環(huán)境與遺傳背景相互作用的物質基礎，也是促進人口健康、維護人口安全、控制重大疾病以及推動醫(yī)藥創(chuàng)新的重要資源保障[1].

本研究采用磁珠提取方法[2]，利用高通量核酸提取設備，進行全基因組DNA提取，由于人類遺傳資源受到倫理學約束的特殊性，本項工作從血液樣品采集到DNA樣本庫的建立都遵守國際和國內相關公約和法律規(guī)定，對資源信息的保密性、用戶分級、信息的共享方式進行相應界定[3]，最終實現(xiàn)高速、高效、高質量的中國少數(shù)民族全基因組DNA樣本庫的建立.

1　材料和方法

1.1主要儀器

天隆磁珠核酸提取儀(NP968Eppendorf)，天隆核酸提取預封裝試劑盒(Ex-DNA全血基因組3.0)，蛋白核酸測定儀(BioPhotometer Plus)，中科美菱超低溫冰箱(DW-HL388)，瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)(BIO-RAD)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD).

1.2 血樣采集

遵從知情同意的原則，通過問卷調查，篩選3代之內無外族遺傳交流的健康無遺傳病史的中國各民族志愿者.按臨床采血標準，采集受試者外周靜脈血2 mL，按照人類遺傳資源標準編碼統(tǒng)一編號，-80 ℃低溫暫存以備提取全基因組DNA.

1.3全基因組DNA提取

基于磁珠法基因組DNA提取原理，在蛋白酶K干粉中加入1 mL蛋白酶K稀釋液，顛倒混勻10次，使其完全溶解，配制蛋白酶K溶液.從試劑盒中取出真空包裝的預封裝96孔深孔板，顛倒混勻數(shù)次使磁珠重懸，去掉真空包裝，輕甩孔板，使試劑及磁珠均集中于孔板底部，小心撕去鋁箔封口膜，避免孔板振動，防止液體濺出.

于96孔深孔板的槽位1、7列中分別加入200 μL血液樣品、15 μL蛋白酶K溶液、60 μL核酸釋放劑，程序按表1步驟進行自動化提取，自動化程序結束后，將槽位6、12列的洗脫產物移至無核酸酶離心管中，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆?

通過質量分數(shù)為0.6%的瓊脂糖凝膠電泳，上樣量4 μL，電壓50 V，電泳時間40 min，鑒定提取DNA完整性.

表1　DNA提取步驟

1.4DNA濃度、純度測定

通過蛋白核酸測定儀測定提取DNA的濃度、純度.經(jīng)質量控制，剔除濃度、純度低樣本.

1.5全基因組DNA樣本庫建立

將每例DNA樣本分成2份，分別編號，于-80 ℃低溫保存.將各個樣本的DNA信息、血樣提供志愿者的知情同意書、民族調查表、體檢表等紙質材料整理歸類編案入檔保存，并將所有紙質材料整理成電子版以備查閱.

2　結果

2.1DNA 提取

共提取601例人類基因組DNA，部分DNA樣本瓊脂糖凝膠電泳如圖1～3所示，由于DNA抽提過程中產生機械剪切力會造成DNA斷裂，通常得到片段的大小都在23 kb左右，所以本研究提取DNA符合建立DNA樣本庫標準.

圖1　部分藏族DNA樣本瓊脂糖凝膠電泳 圖2　部分蒙古族DNA樣本瓊脂糖凝膠電泳 Fig.1　　　　Agarose gel electrophoresis of partial DNA sample Fig.2　Agarose gel electrophoresis of partial DNA sample of 　　　of Tibetan peopleMongolian people

圖3　部分維吾爾族DNA樣本瓊脂糖凝膠電泳Fig.3　Agarose gel electrophoresis of partial DNA sample of Uygur people

2.2DNA濃度及純度測定

通過核酸測定儀檢測所提取DNA樣本的質量濃度、純度，剔除質量較差樣本.部分樣本質量濃度、純度檢測結果如表2所示，DNA樣本質量濃度較高，均在60 ng/μL以上；OD260/OD280均高于1.80，表明所提取DNA中含極少量蛋白質、酚類雜質；OD260/OD230均高于2.0，表明所提取DNA幾乎不受碳水化合物(糖類)、鹽類或有機溶劑污染.OD340均為0，表明所提取DNA無懸浮雜質干擾.綜上，所得DNA質量濃度高，樣品純，符合建立DNA樣本庫標準.

表2　部分DNA樣本質量濃度及純度檢測結果

2.3DNA樣本庫建立

本研究建立了包含藏族、蒙古族、維吾爾族等37個民族及穿青人、摩梭人在內的545例樣本的全基因組DNA樣本庫.各類樣本數(shù)量、性別比例、年齡分布如表3所示，其中女性樣本數(shù)量占63.85%，15～20歲的樣本數(shù)量占79.45%.

表3　樣本統(tǒng)計信息

3　討論

人類遺傳多樣性體現(xiàn)在不同人類種族、民族群體及個體之間的基因組和表型差異.人類遺傳資源是極其珍貴、不可替代的戰(zhàn)略資源.近年來，伴隨著生命科學的蓬勃發(fā)展和生物技術的日新月異，針對人類遺傳資源保護、管理和應用的國際化競爭日漸激烈.因此，人類遺傳資源的保護將成為決定未來各國生命科技與產業(yè)競爭成敗的大本大宗[4].

中國的人類遺傳多樣性研究經(jīng)過多年努力，從初期對人群的描述性觀察，到全基因組多態(tài)位點乃至全基因組序列的掃描分析，近20多年間已取得卓越進展.通過短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat,STR)標記手段[5]，Chu等[6]分析了中國28個民族群體樣本中的3個常染色體STR數(shù)據(jù)，構建了32個東亞人群系統(tǒng)樹，證明了中國南北人群存在差異，民族群體間存在基因交流.通過單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)標記手段[7]，劉烜等[8]調查了貴州4個少數(shù)民族的Y-SNP多態(tài)性及單倍型，并分析其父系遺傳結構.通過Y染色體遺傳標記，Ke等[9]首先證明了東亞人起源于歐洲.之后他們又對東亞南北方40個代表群體進行了系統(tǒng)的SNP和STR比較分析，證明非洲起源的東亞現(xiàn)代人最早由東亞南部向北方遷徙[10-11].東亞大陸最早的現(xiàn)代人大規(guī)模由南向北的遷徙大約發(fā)生在距今6萬年前，現(xiàn)在的東亞人群中只有少數(shù)群體保存了那次史前遷徙的遺傳印記[12].另外他們還通過高密度Y-染色體單倍群及STR基因分型，構建了精細的Y染色體單倍群進，證明了東亞人群史前遷徙的“北線”假說[13].

中國少數(shù)民族基因庫是研究中國人類起源、進化和遷移、民族源流及不同民族群體相互關系、環(huán)境與遺傳背景相互作用的最好依據(jù).更為重要的是，遺傳多樣性是腫瘤、心血管疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病等多種疾病遺傳易感性的生物基礎，同時也是在疾病治療中不同群體或個體對藥物及生物制劑有不同反應的主要原因[14-15].因此，中國少數(shù)民族基因庫在疾病基因鑒定、基因診斷和基因治療、藥物篩選等疾病防治中具有重大的現(xiàn)實意義，不僅可以完善中國人類遺傳多樣性資源的保護和利用制度，還將推進科學領域對疾病病因、診斷技術和治療策略的研究，推動中國的生物技術飛速發(fā)展.

本研究利用高通量核酸提取設備通過磁珠法提取人類全基因組DNA，是將生物科學和納米材料科學相結合的高新技術產品應用于中國少數(shù)民族血液樣本提取和DNA樣本庫的建立.實驗所需血液樣品微量，DNA提取效率高，純度好.本研究初步建立了中國少數(shù)民族全基因組DNA樣本庫，為實現(xiàn)中華民族遺傳資源的保護奠定基礎.

[1]楊昭慶，禇嘉祐.中國人類遺傳多樣性研究進展[J].遺傳，2012,34(11)：1351-1364.DOI: 10.3724/SP.

YANG Zhaoqing, CHU Jiayou. The research progress of human genetic diversity in China[J]. Hereditas, 2012,34(11)：1351-1364.DOI：10.3724/SP.

[2]王平康，駱延，王光志，等.磁珠法快速提取鑒定 DNA 的實驗研究[J].生物學通報，2006,41(6):50-51.

WANG Pingkang, LOU Yan, WANG Guangzhi, et al. Study on rapid extraction and identification of DNA by magnetic bead method [J]. Bulletin of Biology, 2006,41(6):50-51.

[3]科學技術部，衛(wèi)生部.人類遺傳資源管理暫行辦法[Z].國辦發(fā)(1998)36 號，1998.

[4]曹宗富.人類遺傳資源整合與共享的初步研究[D].北京：中國協(xié)和醫(yī)科大學，2008.

CAO Zongfu. Preliminary study on integration and sharing of human genetic resources [D].Beijing: Peking Union Medical College, 2008.

[5]EDWARDS A L,CIVITELLO A,HAMMOND H A,et al.DNA typing and genetic mapping with trimeric and tetrameric tandem repeats[J].The American Journal of Human Genetics,1991,49(4):746.

[6]CHU J Y,HUANG W,KUANG S Q,et al.Genetic relationship of populations in China[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1998,95(20):11763-11768.DOI:10.1073/pnas.95.20.11763.[7]LANDER E S.The new genomics:global views of biology [J].Science,1996,274(5287):536-539.DOI:10.1126/science.274.5287.536.

[8]劉烜，單可人，齊曉嵐，等.貴州布依族，仡佬族，仫佬族，毛南族,壯族Y-SNP 的初步研究[J].遺傳，2006,28(11):1350-1354.DOI:10.1360/yc-006-1350.

LIU Xuan, SHAN Keren, QI Xiaolan, et al. Y-SNP analysis of Bouyei, Gelao, Mulao, Maonan, and Zhuang populations in Guizhou[J]. Hereditas, 2006, 28(11): 1350-1354.DOI: 10.1360/yc-006-1350.

[9]KE Y,SU B,SONG X,et al.African origin of modern humans in East Asia:a tale of 12,000 Y chromosomes[J].Science,2001,292(5519):1151-1153.DOI:10.1126/science.1060011.

[10]SHI H,DONG Y,WEN B,et al.Y-chromosome evidence of southern origin of the East Asian-specific haplogroup O3-M122[J].The American Journal of Human Genetics,2005,77(3):408-419.DOI:10.1086/444436.

[11]WEN B,LI H,LU D,et al.Genetic evidence supports demic diffusion of Han culture[J].Nature,2004,431(7006):302-305.DOI:10.1038/nature02878.

[12]SHI H,ZHONG H,PENG Y,et al.Y chromosome evidence of earliest modern human settlement in East Asia and multiple origins of Tibetan and Japanese populations[J].BMC Biology,2008,6(1):45.DOI:10.1186/1741-7007-6-45.

[13]ZHONG H,SHI H,QI X,et al.Extended Y chromosome investigation suggests postglacial migrations of modern humans into East Asia via the northern route[J].Molecular Biology and Evolution,2011,28(1):717-727.DOI:10.1093/molbev/msq247.

[14]TAN X,MOYER A M,FRIDLEY B L,et al.Genetic variation predicting cisplatin cytotoxicity associated with overall survival in lung cancer patients receiving platinum-based chemotherapy[J].Clinical Cancer Research,2011,17(17):5801-5811.DOI:10.1158/1078-0432.

[15]王曉玲，范中杰，黃建鳳，等.PON基因簇潛在功能多態(tài)位點與冠心病的關聯(lián)研究[J].遺傳學報，2005,32(7):675-681.

WANG Xiaoling, FAN Zhongjie, HUANG Jianfeng, et al. Study on relationship between potential polymorphic loci of PON gene cluster and coronary disease[J]. Acta Genetica Sinica, 2005, 32(7): 675-681.

(責任編輯：趙藏賞)

High-throughput extraction and establishment of sample bank of the genome-wide DNA of different Chinese ethnic minorities

ZHANG Yiming,WANG Junli,HUANG Jingjing,ZHANG Rongrong,PENG Yao

(College of Life and Environmental Sciences,Minzu University of China,Beijing 100081,China)

To preserve genetic resources of different Chinese ethnic groups’ genomes and establish the sample bank of the genome-wide DNA,2 mL peripheral blood was collected from each volunteer of different ethnic minorities according to the clinical blood collection standards and complying with the principle of informed consent.Automatic nucleic acid extraction machine was used to conduct high-throughput extraction of all blood samples,and the samples were numbered and put in the bank after passing quality control.The established sample bank of the genome-wide DNA includes 545 samples from ethnic minorities.The bank will provide material basis for the research of anthropogenesis and interaction of environment and genetic background;it will also serve as a resource for disease treatment and diagnostics.

ethnic minorities;genome-wide;DNA sample bank

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.02.010

2015-06-25

國家重大科學儀器設備開發(fā)專項(2012YQ03026108)；高等學校學科創(chuàng)新引智計劃資助項目(B08044)；一流大學一流學科建設項目(YLDX01013)

張一鳴(1986-)，男，遼寧本溪人，中央民族大學在讀博士研究生.E-mail：61705358@qq.com

王俊麗(1964-)，女，河北新樂人，中央民族大學教授，博士生導師，主要從事植物細胞工程及資源利用研究.

E-mail:wangjunli1698@163.com

Q39

A

1000-1565(2016)02-0169-06