茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚的合成與細(xì)胞毒性

馮衛(wèi)培，王應(yīng)杏，劉思遠(yuǎn)，王書香，李勝輝

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定　071002)

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茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚的合成與細(xì)胞毒性

馮衛(wèi)培，王應(yīng)杏，劉思遠(yuǎn)，王書香，李勝輝

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 藥物化學(xué)與分子診斷教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定071002)

以茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟、二鹵代烷和哌啶或吡咯、嗎啉、二丁胺為原料，合成了10種新型茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚(4A-4J)，并以HeLa、A549和MCF-7細(xì)胞株為模型，采用MTT法評價(jià)了其體外細(xì)胞毒性. 結(jié)果表明:4A、4B、4E、4F和4J對3種細(xì)胞株的毒性均高于順鉑；其中，4A、4B和4F的細(xì)胞毒性比順鉑高2～6倍.肟醚鏈長度和末端基團(tuán)對其細(xì)胞毒性有較大的影響. 隨肟醚鏈長度的增大，細(xì)胞毒性降低；末端基團(tuán)為吡咯時(shí)細(xì)胞毒性較高. 細(xì)胞周期、凋亡實(shí)驗(yàn)表明4A引起G0/G1和G2/M期阻滯，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡. 說明吡咯修飾的茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚是有潛力的抗腫瘤先導(dǎo)化合物.

茚(1,2-b)喹喔啉-11-酮肟衍生物;肟醚; 細(xì)胞毒性

腫瘤已成為威脅人類生命的第一殺手[1]，抗腫瘤藥物一直是藥物研究的熱點(diǎn)[2]. 喹喔啉衍生物(如玫瑰樹堿[3]、依利醋銨[4]、11-取代茚喹喔啉衍生物[5]等)因其良好的抗腫瘤活性引起了人們的重視[6]，但他們的毒性限制了其應(yīng)用. 肟醚能夠改善藥物分子的溶解性和生物利用度，已被用于抗腫瘤藥物研究. 例如，喜樹堿[7]、吲哚[2,1-b]喹喔啉[8]及吲哚[1,2-c]喹喔啉[9]等的肟醚衍生物均表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性. 為發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤藥物, 設(shè)計(jì)合成了系列茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚，對其細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià), 探討肟醚鏈的長度和末端基因的結(jié)構(gòu)對其細(xì)胞毒性的影響，并采用細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)探討其毒性機(jī)制.

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑與儀器

牛血清購于杭州市四季青生物工程材料有限公司，低糖DMEM培養(yǎng)基 Gibco和胰蛋白酶購于美國Amresco公司，瓊脂糖購于美國Sigma公司. 其他試劑均為分析純.

Perkin-Elmer Model-683型紅外光譜儀，Bruker AVANCE 600核磁共振波譜儀，apex ultra 7.0T US+型高分辨質(zhì)譜儀, Moleular Devices VersaMax全波長酶標(biāo)儀, SANYO MCO-20AIC型CO2恒溫培養(yǎng)箱.

1.2化合物的合成與表征

將茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟(2.47 g，10 mmol)和氫氧化鈉(0.40 g，10 mmol)置于裝有回流冷凝管的反應(yīng)瓶中，加入60 mL四氫呋喃，攪拌溶解. 再加入二鹵代烷(30 mmol)，回流反應(yīng)12 h. 冷卻、濃縮、蒸除溶劑，硅膠柱分離(V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=4∶1為淋洗劑)，真空干燥后得黃色固體3a-3c. 將1 mmol的3a-3c、10 mmol哌啶(或吡咯、嗎啉、二丁胺)和10 mL四氫呋喃攪拌溶解，回流反應(yīng)8 h. 冷卻后濃縮，硅膠柱分離(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=25∶1為淋洗劑)，真空干燥得黃色固體4A-4J. 合成路線見式1.

式1　茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚4A-4J的合成Scheme 1　Synthetic route for 11-substituted indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime ethers 4A-4J

1.3體外細(xì)胞毒性評價(jià)

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及溶液配制

將3種腫瘤細(xì)胞HeLa、 A549和MCF-7在含有體積分?jǐn)?shù)10%的牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中孵育(體積分?jǐn)?shù)5% CO2，37 ℃).

將化合物溶解在DMSO中，配制成5 mmol/L儲存液待用.取一定量的母液，并用培養(yǎng)基稀釋成不同濃度的溶液(1.0, 10, 100和500 μmol/L)，使DMSO的體積分?jǐn)?shù)低于0.1%.

1.3.2體外細(xì)胞毒性的測定

取處于對數(shù)生長期的HeLa、A549和MCF-7細(xì)胞懸浮液(2×104/mL)加入到96孔培養(yǎng)板中(90 μL /孔)，于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h. 待細(xì)胞貼壁后，加入濃度為0.1、1和10 μmol/L的4A-4J(10 μL/孔，每種化合物設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，不含藥物組作空白. 孵育48 h后，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入100 μL的DMSO，室溫下震蕩10 min，用酶標(biāo)儀在490 nm波長下測定OD值. 進(jìn)一步采用Logit法計(jì)算50%生長抑制濃度IC50值.

1.3.3細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)

將生長狀態(tài)良好的HeLa細(xì)胞(2×104/mL)接種于96孔培養(yǎng)板中(100 μL/孔). 待細(xì)胞貼壁后, 向各孔中加入4A(終濃度：0.1、1.0、5.0和10.0 μmol/L)，不含4A組作空白，孵育48 h. 用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液. 加入體積分?jǐn)?shù)70%預(yù)冷乙醇1 mL，于4 ℃過夜。通過離心的方式用PBS洗滌3遍，除上清液. 每管加入PI染液500 μL使其終質(zhì)量濃度為4 μg/mL, 室溫染色30 min，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測, 結(jié)果采用Modfit 3.2軟件進(jìn)行分析.

1.3.4細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將HeLa細(xì)胞按1.3.3操作方法處理，加入不含EDTA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶，收集細(xì)胞于離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌，將細(xì)胞懸浮于500 μL緩沖液中，加入Annexic V-FITC染液使其終質(zhì)量濃度為100 ng/mL，置于暗處反應(yīng)10 min，再加入5 μL PI染液，輕輕振搖，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測.

2　結(jié)果與討論

2.1化合物的合成

以茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮(1)為原料，經(jīng)肟化、醚化和胺化反應(yīng)得到4A-4J. 將1與鹽酸羥胺在苯和乙醇的混合溶液中加熱回流，得61%收率的2. 將2 與過量的二鹵代烷和氫氧化鈉在THF中回流得到81%～86%收率的3a-3c. 將3a-3c與哌啶或吡咯、嗎啉、二丁胺在THF中發(fā)生取代反應(yīng)得到53%～82%收率的4A-4J.

2.2體外細(xì)胞毒性

以HeLa、A549和MCF-7為模型, 采用MTT法測定了化合物2、4A-4J和順鉑的IC50值(表1). 結(jié)果表明: 4A-4J對3種細(xì)胞系均表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性(IC50< 20 μmol/L); 4F對A549和MCF-7的細(xì)胞毒性為順鉑的5倍; 4A和4B對HeLa的毒性為順鉑的2倍；4A、4B、4F和4J對A549的細(xì)胞毒性為順鉑的2、5、5和2倍；4A、4B、4F和4J對MCF-7的細(xì)胞毒性為順鉑的3、6、5和3倍. 端基胺修飾的肟醚鏈的引入增強(qiáng)了其細(xì)胞毒性. 4A-4J對HeLa和MCF-7的細(xì)胞毒性高于2. 端基結(jié)構(gòu)對其毒性有影響. 具有相同側(cè)鏈長度和不同端基的4A-4D(碳鏈長度為2)對HeLa的細(xì)胞毒性順序?yàn)?A ≈ 4B > 4C > 4D，對A549的細(xì)胞毒性順序?yàn)?B > 4A > 4C > 4D，對MCF-7的細(xì)胞毒性順序?yàn)?B > 4A > 4C ≈ 4D. 具有相同側(cè)鏈長度和不同端基的4E-4H(碳鏈長度為4)，對HeLa和A549的細(xì)胞毒性順序?yàn)?F > 4E > 4G > 4H. 端基為吡咯的化合物表現(xiàn)出較高的細(xì)胞毒性. 側(cè)鏈長度對毒性有影響. 具有不同側(cè)鏈長度和相同端基的4A、4E、4I對He La、A549和MCF-7的細(xì)胞毒性順序?yàn)?A > 4E > 4I.

表1　化合物4A-4J的細(xì)胞毒性

2.3化合物4A對于HeLa細(xì)胞周期的影響

為探討化合物對腫瘤細(xì)胞的損傷機(jī)制，采用PI染色法檢測4A對HeLa細(xì)胞周期的影響, 結(jié)果見圖1. 分別用0.1、1.0、5.0 和 10.0 μmol/L濃度的4A處理，G0/G1期在細(xì)胞周期中所占比例分別為56.46%、58.94%、59.50%、57.33%、68.83%；G2/M期在細(xì)胞周期中所占比例分別為7.35%、8.01%、13.13%、23.33%、29.42%；亞G0/G1期在細(xì)胞周期中所占比例分別為36.19%、33.05%、27.37%、19.34%、1.75%. 隨4A濃度的增大，G0/G1和G2/M期在細(xì)胞周期中所占比例呈增加趨勢, 而亞G0/G1期(S期)在細(xì)胞周期中所占比例逐漸降低. 結(jié)果表明，4A使腫瘤細(xì)胞主要阻滯在G0/G1和G2/M期.

a.空白組；b、c、d、e.分別用0.1、1.0、5.0 和 10.0 μmol/L的4A處理.圖1　PI單染檢測細(xì)胞周期Fig.1　Detection of the cell cycle by PI single staining method

2.4化合物4A對于HeLa細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步探討4A的毒性機(jī)制，利用Annexin V/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如表2所示. 當(dāng)4A的濃度分別為0、5.0和10.0 μmol/L時(shí), 早期凋亡比例分別為2.58%、31.25%和55.62%. 隨4A濃度的增大，早期凋亡比例顯著增加.結(jié)果表明， 4A可能是通過引起腫瘤細(xì)胞早期凋亡產(chǎn)生細(xì)胞毒性的.

表2　Annexin V/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

3　結(jié)論

合成了系列茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟衍生物，采用MTT法對其體外細(xì)胞毒性進(jìn)行了評價(jià). 4A-4J對HeLa、A549和MCF-7具有較高的細(xì)胞毒性;4B對3種細(xì)胞系的細(xì)胞毒性分別為順鉑的2、5和6倍. 胺基化肟醚鏈的引入增強(qiáng)了其體外細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性隨側(cè)鏈長度的增長而降低；端基為吡咯時(shí)，化合物的毒性高于端基為哌啶、嗎啉、二丁胺的化合物. 細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)表明4A引起G0/G1和G2/M期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡. 因此, 吡咯修飾的茚[1,2-b]喹喔啉-11-酮肟醚可作為潛在的抗腫瘤先導(dǎo)化合物.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Synthesis and cytotoxicity of indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime ethers

FENG Weipei, WANG Yingxing, LIU Siyuan, WANG Shuxiang, LI Shenghui

(Key Laboratory of Medicinal Chemistry and Molecular Diagnosis of Ministry of Education, College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071002, China)

Ten novel indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime ethers (4A-4J) were synthesized by indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime, saturated dihalide, and piperidine or pyrrole, morpholine, and dibutylamine. Their cytotoxicity against HeLa, A549 and MCF-7 cell lines was evaluated by MTT assay. The results indicated that compounds 4A,4B,4E,4F, and 4J showed higher cytotoxicty than cisplatin against HeLa, A549, and MCF-7 cell lines. Among them, 4A, 4B and 4F exhibited 2 to 6 folds higher cytotoxicty than cisplatin. Both the length of oxime ether chain and the nature of the terminal group have important effects on the cytotoxicity. The cell cycle and apoptosis assays indicated that 4A could change the cells cycle ratio, and induce apoptosis. Our results suggest that indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime ether modified by pyrrole is a potential anti tumor precursor compound.

indeno[1,2-b]quinoxalin-11-one oxime derivatives; oxime ether; cytotoxicity

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.02.007

2015-10-25

河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(12966418D)；河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2015201213)

馮衛(wèi)培(1987—)，男，河北南和人，河北大學(xué)在讀碩士研究生. E-mail:yukancaihong@163.com

王書香(1965—)，男，河北大城人，河北大學(xué)教授，主要從事抗腫瘤藥物研究. E-mail:wsx@hbu.edu.cn

李勝輝(1973—)，男，河北元氏人，河北大學(xué)教授，主要從事抗腫瘤藥物研究.E-mail:lish@hbu.edu.cn

O62

A

1000-1565(2016)02-0148-07