大腸桿菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表達、純化及晶體學研究

馬銀良，劉爽，崔亞琦，康現(xiàn)江，劉秀華

(河北大學生命科學學院，河北保定　071002 )

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大腸桿菌O157中肽聚糖水解酶MpaA的克隆、表達、純化及晶體學研究

馬銀良，劉爽，崔亞琦，康現(xiàn)江，劉秀華

(河北大學生命科學學院，河北保定071002 )

采用分子克隆方法將來源于大腸桿菌O157的mpaA基因構建入pET-21b(+)表達載體.誘導MpaA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中高效表達，通過Ni親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析三步法純化得到高純度蛋白.使用氣象擴散法進行蛋白質晶體生長的初步篩選與優(yōu)化，得到MpaA蛋白質單晶，并使用X射線衍射儀進行衍射數據的收集與處理.MpaA晶體分辨率為0.26 nm，屬于P31空間群，晶胞參數為a=5.989 3 nm，b=5.989 3 nm，c=12.987 0 nm，β=90.000 °.MpaA晶體衍射數據的收集為后續(xù)結構解析和催化機制的闡明提供了基礎.

大腸桿菌O157；肽聚糖水解酶；MpaA；晶體

肽聚糖是微生物細胞壁不可缺少的組成成分，在維持細胞形態(tài)、保持細胞完整性和抗高滲透壓等方面具有重要作用[1-3].肽聚糖骨架是由N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid，MurNAc)和N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine，GlcNAc)以β-1,4糖苷鍵交替連接而形成的線狀聚糖鏈.在MurNAc上以共價鍵形式連接一短肽側鏈L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP(或L-Lys)-D-Ala.一般而言，在革蘭氏陽性細菌中，短肽分子上的第3個氨基酸是Lys，而在革蘭氏陰性細菌中，短肽上的第3個氨基酸殘基往往是meso-DAP(2,6-diaminopimelic acid,2,6-二氨基庚二酸)[2].

細菌肽聚糖處于不斷組裝與解聚的動態(tài)過程，在細胞生長、分裂和發(fā)育過程中進行重建[4].對于大多數革蘭氏陰性菌而言，在每一代細胞中40%～50%的肽聚糖在水解之后，其產物都能夠被循環(huán)再利用重新形成肽聚糖[5-6].在營養(yǎng)元素匱乏時，肽聚糖的循環(huán)再生則可為整個細胞分裂周期的完成提供必須的基礎營養(yǎng)元素，并使之進入靜止生長期.此外，在微生物之間存在碳氮源競爭時，肽聚糖的循環(huán)再利用對于微生物生存具有重要意義[5].

在大腸桿菌的肽聚糖循環(huán)再生過程中共涉及11種肽聚糖水解酶.這些酶能夠回收肽聚糖降解產物，用于肽聚糖的重新合成，或被細胞用作能源[5].肽聚糖水解酶MpaA含有262個氨基酸，負責切割中間降解產物胞壁質三肽(L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP)中γ-D-Glu與meso-DAP之間的酰胺鍵，釋放L-Ala-D-Glu和DAP[3，7].二肽產物L-Ala-D-Glu在差向異構酶YcjG和肽酶PepD作用下轉化成L-Ala和L-Glu[8-9].在營養(yǎng)元素匱乏時，這些氨基酸產物能夠被細胞作為能源使用，從而能夠存活下來[5,10].MpaA專一性底物是胞壁質三肽(L-Ala-γ-D-Glu-meso-DAP)，非特異性底物是L-Ala-γ-D-Glu-L-Lys-MurNAC三肽和γ-D-Glu-(L)- meso-DAP二肽；MpaA并不能夠識別胞壁質四肽、二糖-肽或UDP-MurNAc-肽等前體分子[10].到目前為止，MpaA的底物特異性已被廣泛研究，但差異性產生的原因是未知的，分子水平的催化反應機制也是未知的.鑒于此，本研究成功克隆、表達、純化了大腸桿菌O157中的MpaA，對其進行了初步晶體學研究，從而為其三維結構的解析、催化機理的闡明奠定了基礎.

1　材料與方法

1.1材料

pET-21b(+)質粒，大腸桿菌O157：H7str.Sakai基因組，大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)為本實驗室保存.質粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購于TIANGEN公司；pfu DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于寶生物(大連)有限公司；限制性內切酶購于NEB公司和寶生物(大連)有限公司；PCR引物 (表1)、重組質粒測序由北京寶銳通公司完成；蛋白胨和酵母提取物購自OXOID公司.蛋白質純化系統(tǒng) AKTA explorer 100、親和層析基質Ni-NTA His-Band resin、離子交換柱Source 15Q及分子篩預裝柱 Superdex-200 increase 均購于GE Healthcare公司.

表1　引物設計

1.2mpaA基因的克隆與表達載體構建

目標基因(Gene ID:912455)使用PCR方法擴增后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測及膠回收，使用限制性內切酶NdeI和XhoI雙酶切，與經同樣酶切后的pET-21b(+)表達載體進行連接，并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞.挑取多個轉化子進行重組蛋白表達檢測，將蛋白有陽性表達的轉化子提取質粒，進行質粒PCR檢測，當蛋白質表達及質粒PCR檢測均為陽性時可確定為陽性克隆子，并送測序.

1.3MpaA蛋白質的大量表達與純化

挑取陽性克隆接種于50 mL含有氨芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；按照1%的接種比例將菌液接入1 000 mL含有相應抗生素的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)；當菌體密度達到 OD600為0.8時，降溫至15 ℃，1 h后，加入IPTG至終濃度為0.15 mmol/L，誘導重組蛋白表達；誘導10 h之后，4 ℃、4 500 r/min離心15 min，收集菌體.將菌體細胞懸浮在40 mL 重懸溶液(20 mmol/L Tris-HCl buffer pH 8.0，200 mmol/L NaCl)中，在冰水混合物條件下用超聲波法破碎細胞.細胞裂解液經14 500 r/min、4 ℃下離心45 min，收集上清液.首先，含有可溶性蛋白的上清液經Ni親和層析柱進行純化.Ni親和層析柱預先用重懸溶液平衡，上樣后用wash buffer(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，15 mmol/L imidazole)除去非特異性吸附的雜蛋白；使用elution buffer(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl，250 mmol/L imidazole)洗脫目的蛋白MpaA.然后，將可溶性的蛋白使用溶液A(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)稀釋4倍，上樣到已使用溶液 A平衡好的離子交換柱 Source 15Q上，使用溶液A與溶液B(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，1 mol/L NaCl)進行150 mL的線性梯度洗脫.收集目標蛋白并濃縮.凝膠過濾層析柱 Superdex-200 increase 預先用溶液C(25 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L NaCl)平衡，將濃縮蛋白樣品上樣，收集目標蛋白峰.SDS-PAGE電泳檢測蛋白質的純度及性狀.所有的蛋白純化步驟均在4 ℃進行.

1.4MpaA蛋白結晶、衍射、數據分析

蛋白質晶體生長條件的初篩采用20 ℃坐滴氣象擴散法，使用Hampton research 公司的Index1-96、Crystal Screen、Crystal Screen 2試劑盒和Emerald公司的Wizard I、WizardII、WizardIII試劑盒，共336個條件.使用48孔坐滴板，池液100 μL，1 μL蛋白與1 μL 池液混合.在獲得晶體初步生長條件基礎上，通過改變結晶緩沖液中沉淀劑的濃度對MpaA晶體進行優(yōu)化，得到衍射分辨率較高的蛋白質單晶，從而進行衍射數據的收集、處理及結構解析.在收集衍射數據時，MpaA蛋白質單晶在晶體防凍液(體積分數為20%的甘油)中浸泡30 s，置于X光機，于-173 ℃條件下收集衍射數據.衍射數據的收集在上海同步輻射光源(SSRF)線站BL17U1完成.衍射數據使用軟件HKL2000進行處理[11].

2　結果

2.1pET-21b-MpaA表達載體構建

mpaA基因的PCR擴增產物經質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，在750 bp處可見特異性的PCR產物條帶，與mpaA基因理論值吻合，且無其他雜帶.該PCR產物經DNA凝膠回收、NdeI和XhoI雙酶切，連接至同樣雙酶切的pET-21b(+)載體上，并轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中.篩選出蛋白表達、質粒PCR檢測均為陽性的轉化子送出測序，測序結果表明插入基因序列正確、無突變.

2.2重組蛋白MpaA的表達與純化

通過在液體LB培養(yǎng)基中大規(guī)模培養(yǎng)陽性克隆子pET-21b-mpaA，并誘導目的蛋白表達.在15 ℃條件下，MpaA可溶性表達.使用Ni親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析三步法來純化MpaA蛋白.經Ni親和層析柱洗脫下來的蛋白質溶液，進一步使用離子交換柱Source 15Q進行純化，呈現(xiàn)單一蛋白質洗脫峰，峰形對稱且尖銳，無肩膀峰的存在，蛋白無明顯損失(數據未顯示).收集該蛋白質洗脫峰，濃縮至2 mL，高速離心后上樣至Superdex-200 increase層析柱，洗脫結果如圖1a所示，該蛋白質洗脫峰平滑、對稱，說明MpaA蛋白性狀良好、處于均一狀態(tài).SDS-PAGE凝膠電泳分析結果如圖1b所示.SDS-PAGE凝膠電泳檢測顯示蛋白分子質量為29 ku，與預測理論值大小相等，MpaA蛋白純度達到98%以上，質量濃度達到10 mg/L，可用于蛋白晶體的生長.

圖1　MpaA蛋白的分子篩層析圖譜(a)與SDS-PAGE檢測(b)Fig.1　Gel-filtration chromatography profile of MpaA(a)and SDS-PAGE analysis of MpaA after chromatography(b)

2.3MpaA蛋白結晶、衍射及數據分析

MpaA晶體初篩2 d后，在Crystal screen 的18號條件(0.2 mol/L 乙酸鎂、0.1 mol/L 二鉀砷酸鈉和200 g/L PEG 8 000)長出小塊狀晶體.調整優(yōu)化沉淀劑和鹽濃度，在條件為0.15 mol/L乙酸鎂、0.1 mol/L二鉀砷酸鈉和170 g/L PEG 8 000時，晶體長成0.15 mm×0.15 mm×0.1 mm，如圖2a所示，能夠用于X射線衍射.MpaA晶體分辨率為0.26 nm(圖2b)，晶體衍射數據分析結果見表2.晶體空間群是P31，晶胞參數為a=5.989 3 nm，b=5.989 3 nm，c=12.987 0 nm，β=90.000 °.

圖2　MpaA蛋白質晶體(a)和X光衍射圖譜(b)Fig.2　Crystallization(a) and diffraction pattern(b) of MpaA

空間群a,b,c/nmα,β,γ/(°)鑲嵌度/(°)分辨率范圍/nm總衍射點數P315.9893,5.9893,12.987090.000,90.000,120.0001.39～1.855.00～0.26(0.269～0.26)87355非重復衍射點數完整度/%冗余度I/σ(I)Rmerge1596199.97(99.74)5.47(5.57)21.3(5.5)0.099(0.467)

括號內的數據代表的是最高分辨率殼層的數據.

3　討論

肽聚糖水解酶MpaA在肽聚糖循環(huán)再生系統(tǒng)發(fā)揮功能，負責切割中間產物胞壁質三肽中γ-D-Glu與meso-DAP之間的酰胺鍵.釋放的氨基酸產物或被用作原料重新合成肽聚糖，或被微生物在營養(yǎng)元素匱乏時用作能源.本研究克隆和表達了來源于致病微生物大腸桿菌O157中的肽聚糖水解酶MpaA，經三步驟純化后對其進行晶體生長研究和初步晶體學分析，期望能夠解析MpaA的三維結構，進而從結構生物學角度來揭示MpaA的底物特異性原因和催化反應機制.在克隆mpaA基因時，考慮到mpaA基因來源于大腸桿菌O157，使用NCBI中的Blast軟件進行搜索驗證，在大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)中也含有該基因.為避免假陽性結果的產生，在篩選基因mpaA陽性克隆子時，先進行重組蛋白的誘導表達檢測，對蛋白誘導表達呈現(xiàn)陽性的克隆子提取其質粒，當質粒的PCR檢測也呈現(xiàn)陽性時即可確認為陽性克隆子，送出測序確認克隆成功.在蛋白質MpaA分離純化過程中，依次使用Ni親和層析、離子交換及凝膠過濾層析三步驟.離子交換和凝膠過濾層析結果均顯示出MpaA蛋白洗脫峰單一，對稱且平滑，說明了MpaA蛋白性狀良好、狀態(tài)均一；結合SDS-PAGE檢測結果表明，MpaA蛋白能夠用于后繼的晶體生長實驗.在晶體生長條件初步篩選過程中，336個結晶溶液條件中僅有少數幾個條件有蛋白質晶體長出，充分說明了蛋白質晶體生長需要做大量篩選的必要性.通過對結晶溶液中乙酸鎂和PEG 8000的濃度分別優(yōu)化至0.15 mol/L和 170 g/L時，得到大小適中、能夠用于X線衍射的蛋白質單晶,分辨率為0.26 nm.在使用液氮速凍晶體的過程中，為防止冰晶的產生，在結晶溶液中添加甘油作為防凍劑，其終體積分數為20%.經衍射實驗證實，20%的甘油不影響晶體的分辨率.此前，國外研究學者Maqbool等人已克隆、表達、純化了來源于大腸桿菌O157的MpaA，遺憾的是該MpaA蛋白質不長晶體.不得已，Maqbool課題組成員對MpaA的同源蛋白Vh_MpaA進行了結構生物學研究[10].盡管具有近似催化功能的同源蛋白質結構可以為解釋MpaA的催化機理提供一定的幫助，但最終需要測定其自身的結構才能夠更好地回答重要的科學問題.這是因為蛋白質功能的行使必須依賴于其正確的三維結構的形成.本文的研究工作為正確解釋MpaA的催化機理奠定了良好的基礎.目前，本課題組正嘗試利用分子置換法解析MpaA三維結構.MpaA三維結構的解析不僅能夠在分子水平闡明其催化反應機制，而且也能夠為新型抗感染小分子藥物的設計提供結構學數據.

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(責任編輯：趙藏賞)

Cloning，expression，purification and crystallization of murein-tripeptide amidase MpaA from Escherichia coli O157

MA Yinliang，LIU Shuang，CUI Yaqi，KANG Xianjiang，LIU Xiuhua

(College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China)

The genempaAfromEscherichiacoliO157 was inserted into pET-21b(+)vector using molecular cloning method.The recombinant protein MpaA was overexpressed inE.coliBL21(DE3)competent cells，and purified to homogeneity sequentially via a three-step protocol consisting of Ni-chelating affinity column，ion-exchange column and size-exclusion column chromatography.Crystallization search and optimization for MpaA were carried out using the sitting-drop vapour-diffusion method.The MpaA crystal diffracted to 0.26 nm resolution and belonged to the space group P31，with unit-cell parametersa=5.989 3 nm，b=5.989 3 nm，c=12.987 0 nm andβ=90.000 °.Preliminary crystallographic analysis builds up a good foundation for the structural determination and catalytic mechanism of MpaA.

EscherichiacoliO157;peptidoglycan hydrolase;MpaA;crystal

10.3969/j.issn.1000-1565.2016.04.013

2015-10-16

國家自然科學基金資助項目(31300056)；河北省自然科學基金資助項目(C2014201039)；河北省教育廳優(yōu)秀青年基金資助項目(YQ2014007)；河北大學自然科學基金資助項目(2011-220)

馬銀良(1989—)，男，河北邢臺人，河北大學在讀碩士研究生.E-mail:mayinliang@outlook.com

劉秀華(1981—)，女，河北泊頭人，河北大學副教授，主要從事蛋白質結構與功能研究.

E-mail:xiuhualiu@hbu.edu.cn

Q71

A

1000-1565(2016)04-0412-05