乙型肝炎病毒母嬰垂直傳播與Th1/Th2型細(xì)胞因子相關(guān)性研究

栗軍香，沈香榮，鄭麗娟，翟淑景，李紅梅，王文霞，劉艷竹

(1. 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056002；2. 河北省涉縣婦幼保健院，河北 涉縣 056400；3. 五礦邯邢總醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；4. 河北省涉縣中醫(yī)院，河北 涉縣 056400)

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乙型肝炎病毒母嬰垂直傳播與Th1/Th2型細(xì)胞因子相關(guān)性研究

栗軍香1，沈香榮1，鄭麗娟2，翟淑景3，李紅梅2，王文霞2，劉艷竹4

(1. 河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 邯鄲 056002；2. 河北省涉縣婦幼保健院，河北 涉縣 056400；3. 五礦邯邢總醫(yī)院，河北 邯鄲 056001；4. 河北省涉縣中醫(yī)院，河北 涉縣 056400)

目的研究探討乙型肝炎病毒(HBV)母嬰垂直傳播與1型及2型輔助性T細(xì)胞相應(yīng)細(xì)胞因子的相關(guān)性。方法選擇乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)陽性的孕婦87例作為觀察組，并根據(jù)新生兒臍血乙肝五項(xiàng)及HBV DNA檢測結(jié)果，將其中14例檢測陽性發(fā)生胎兒宮內(nèi)感染者為宮內(nèi)感染組，73例檢測陰性未發(fā)生宮內(nèi)感染者為宮內(nèi)未感染組；同時選擇44例正常孕婦作為對照組。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測每組孕婦外周血及新生兒臍血相關(guān)細(xì)胞因子干擾素γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平，比較各組IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6的水平變化及與HBV母嬰垂直傳播的相關(guān)性。結(jié)果宮內(nèi)感染組孕婦血清IFN-γ、IL-12水平較宮內(nèi)未感染組及正常對照組均顯著降低(P均<0.05)，IL-4、IL-6水平則較未感染組及對照組顯著升高(P均<0.05)；而宮內(nèi)未感染組以上各因子水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。各組孕婦血清IFN-γ與IL-12、IL-4與IL-6均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P均<0.05)，IFN-γ與IL-4 、IL-6及IL-12與IL-4及IL-6均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P均<0.05)。各組新生兒臍血中IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論HBsAg陽性孕婦Th1/Th2型細(xì)胞免疫功能紊亂，導(dǎo)致Th1和Th2相關(guān)的細(xì)胞因子免疫水平失衡，IFN-γ、IL-12水平顯著降低，抗病毒能力下降，導(dǎo)致孕婦體內(nèi)HBV清除障礙，從而易引起HBV母嬰垂直傳播而發(fā)生胎兒宮內(nèi)感染。

乙型肝炎病毒；垂直傳播；Th1/Th2型細(xì)胞；細(xì)胞因子；相關(guān)性

乙型肝炎病毒(HBV)感染是世界范圍內(nèi)最常見的傳染病之一，也是一直以來都不能徹底消除的疾病。HBV感染后病情極易反復(fù)和慢性化，很難治愈，逐漸發(fā)展會引起肝硬化、肝癌等嚴(yán)重危及患者生命的并發(fā)癥。母嬰垂直傳播是HBV感染的主要傳播途徑之一。慢性HBV攜帶者約占HBV感染的1/4，而在全部攜帶者中約一半的患者是由母嬰垂直傳播引發(fā)的[1]。WHO推薦新生兒出生后按常規(guī)免疫程序及時注射乙肝疫苗和乙肝免疫球蛋白以阻斷產(chǎn)時、產(chǎn)后HBV的母嬰垂直傳播，然而對于一些攜帶HBV孕婦雖然進(jìn)行了預(yù)防性聯(lián)合免疫治療，其后代中仍有新生兒發(fā)生HBV早期感染，說明他們可能發(fā)生了HBV宮內(nèi)感染?？梢娙绾翁岣吣阁w的細(xì)胞免疫功能和特異性免疫應(yīng)答，對清除其體內(nèi)的感染HBV，阻斷HBV宮內(nèi)感染具有重要意義[2]。肝炎是多種免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子參與免疫異常反應(yīng)性疾病，已知Th1/Th2細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的免疫平衡失調(diào)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，Th1/Th2型細(xì)胞因子免疫平衡失調(diào)與機(jī)體內(nèi)HBV的清除有關(guān)，然而有關(guān)Th1/Th2細(xì)胞因子與HBV母嬰垂直傳播的研究報道較少。Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)可增強(qiáng)機(jī)體抵抗病毒等微生物感染的能力，而Th2型細(xì)胞免疫反應(yīng)則會促進(jìn)感染的進(jìn)展、慢性化，故宿主對感染病毒的清除與否，要看體內(nèi)的免疫反應(yīng)是以Th1型為主還是以Th2型為主[3]。本研究通過檢測孕婦及新生兒Th1/Th2細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子水平，探討干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-12(IL-12)、白細(xì)胞介素-4(IL-4)及白細(xì)胞介素-6(IL-6)與HBV母嬰垂直傳播的相關(guān)性，從而為有效防止HBV母嬰垂直傳播及胎兒宮內(nèi)感染尋找新的途徑和思路。

1　臨床資料

1.1一般資料選擇2014年4月—2015年12月在河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院進(jìn)行產(chǎn)前檢查和分娩的單胎足月HBsAg陽性孕婦87例作為觀察組，年齡20～39歲，孕周36～43周，孕婦肝功能均正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：具有先兆流產(chǎn)或早產(chǎn)史、病原體感染史及其他妊娠合并癥者，近期服用抗病毒或激素藥物者，患有其他病毒性肝炎或非病毒性肝炎及嚴(yán)重全身疾病者，胎兒先天畸形和配偶HBV攜帶者。根據(jù)新生兒臍血乙肝五項(xiàng)及HBV DNA檢測結(jié)果，將14例檢測結(jié)果陽性發(fā)生HBV宮內(nèi)感染者作為宮內(nèi)感染組，將73例檢測結(jié)果陰性未發(fā)生HBV宮內(nèi)感染者作為宮內(nèi)未感染組。并選擇同期分娩的HBsAg陰性的正常孕婦44例作為對照組，年齡19～39歲，孕周36.5～43周。各組孕婦的年齡、孕周、分娩方式差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法

1.2.1樣本采集采集所有孕婦分娩時空腹靜脈血3 mL，血標(biāo)本以3 000 r/min，離心15 min取上清，置于EP管中，于-80 ℃冰箱保存待檢，以檢測血清IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6的水平。在新生兒出生臍帶結(jié)扎切斷后首針乙肝疫苗免疫接種前，留取無菌條件下臍靜脈血2 mL，以3 000 r/min，離心15 min取上清，一部分用于檢測乙肝五項(xiàng)及HBVDNA，其余-80 ℃冰箱保存，待檢測血清IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6的水平。

1.2.2檢測方法新生兒臍血乙肝五項(xiàng)測定采用全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行定量，試劑盒購自武漢眾生生物工程有限公司；采用熒光定量PCR法進(jìn)行臍血HBV DNA的定量檢測，試劑購自珠海賽樂奇生物技術(shù)公司，以上實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。采用雙抗夾心ELISA法測定孕婦外周血及新生兒臍血IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6水平，試劑盒購自美國TPI公司，嚴(yán)格按說明書操作。

1.3HBV母嬰垂直傳播的判斷新生兒出生臍血檢測血清HBsAg、HBV DNA兩項(xiàng)指標(biāo)中任一指標(biāo)陽性即診斷為發(fā)生宮內(nèi)感染；新生兒臍血檢測HBsAg、HBV DNA兩項(xiàng)指標(biāo)均為陰性即未發(fā)生宮內(nèi)感染。

2　結(jié)　　果

2.1各組孕婦血清中IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6的水平比較宮內(nèi)感染組孕婦血清IFN -γ、IL-12 水平均顯著低于宮內(nèi)未感染組及對照組(P均<0.05)，宮內(nèi)未感染組上述兩細(xì)胞因子水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。宮內(nèi)感染組孕婦血清IL-4、IL-6水平均顯著高于宮內(nèi)未感染組及對照組(P均<0.05)，而宮內(nèi)未感染組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1　3組孕婦外周血IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6的 水平比較

注：①與宮內(nèi)感染組比較，P<0.05。

2.2孕婦血清IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6的相關(guān)性分析宮內(nèi)感染組、宮內(nèi)未感染組及對照組三組孕婦血清IFN-γ水平與IL-12水平均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.947，0.925，0.861，P均<0.05)；3組IL-4水平與IL-6水平亦呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.904，0.892，0.854，P均<0.05)；而IFN-γ與IL-4、IL-6水平(r=-0.874，-0.912，-0.903，P均<0.05；r=-0.859，-0.811，-0.763，P均<0.05)及IL-12與IL-4、IL-6水平(r=-0.931，-0.926，-0.915，P均<0.05；r=-0.938，-0.914，-0.902，P均<0.05)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.3各組新生兒血清中IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6水平比較3組新生兒臍血IFN -γ、IL-12、IL-4及IL-6水平比較差異均無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2　3組新生兒臍血IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6 水平比較

3　討　　論

HBV感染人體后，通常不會直接造成組織功能破壞而是引發(fā)一定的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用或免疫復(fù)合物作用而造成機(jī)體細(xì)胞的損害。胎兒期HBV感染往往會發(fā)展為慢性攜帶狀態(tài)，甚至發(fā)展為肝硬化和肝癌[4]。因此，對乙肝表面抗原陽性的產(chǎn)婦采取有效措施避免通過母嬰垂直傳播方式造成其后代的HBV宮內(nèi)感染顯得尤為重要。機(jī)體內(nèi)感染HBV的清除與特異性免疫應(yīng)答有關(guān)，目前認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞系統(tǒng)的免疫平衡紊亂是HBV感染慢性化及母嬰垂直傳播的可能機(jī)制之一，而Th1/Th2細(xì)胞失衡又會影響相應(yīng)的細(xì)胞因子之間的平衡[5]。當(dāng)機(jī)體正常狀態(tài)時，Th1和Th2兩種細(xì)胞因子相互作用而處于動態(tài)平衡，以維持機(jī)體正常的細(xì)胞及體液免疫功能，而以上兩種類型的細(xì)胞因子也是正常妊娠過程中所需要的重要調(diào)節(jié)因子，這種細(xì)胞因子間的動態(tài)平衡一旦被打破，則將會引起疾病的發(fā)生、發(fā)展[6]。IFN-γ水平通常作為Th1細(xì)胞功能的重要特征性指標(biāo)，是由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等分泌的一種重要細(xì)胞因子，具有免疫調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)Th1型細(xì)胞的分化，上調(diào)相應(yīng)的免疫反應(yīng)，可起到抑制病毒復(fù)制及清除病毒的作用。IFN-γ可抑制IL-4的轉(zhuǎn)錄、活化，從而可拮抗IL-4因子的作用。IL-12屬于促炎性細(xì)胞因子，主要功能是介導(dǎo)和增強(qiáng)細(xì)胞免疫反應(yīng)。研究指出IL-12可促進(jìn)Th1細(xì)胞的生成及增加其活性，同時可抑制Th2細(xì)胞的生成，促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子如IFN-γ、IL-2等的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，從而可有效抵抗病毒的感染[7]。IL-4水平是代表Th2 細(xì)胞功能的重要細(xì)胞因子，其可刺激和誘導(dǎo)Th0細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th2細(xì)胞，從而增強(qiáng)Th2型細(xì)胞免疫應(yīng)答[8]。IL-6主要是由Th2細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子，參與機(jī)體的多種免疫生理及病理過程。研究表明慢性乙肝患者血清IL-6水平顯著升高，且與肝炎病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[9]。因此，對以上Th1和Th2兩種相關(guān)細(xì)胞因子的研究對阻斷HBV母嬰垂直傳播具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究中87例HBsAg陽性的孕婦發(fā)生新生兒HBV宮內(nèi)感染率為16.1%。宮內(nèi)感染組孕婦血清IFN -γ、IL-12水平均顯著低于宮內(nèi)未感染組及對照組，而IL-4、IL-6水平均顯著高于宮內(nèi)未感染組及對照組；宮內(nèi)未感染組與對照組比較上述細(xì)胞因子水平差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。這與林海英等[10]研究結(jié)果基本一致。這說明存在HBV宮內(nèi)感染的孕婦其機(jī)體的免疫狀態(tài)失衡，表現(xiàn)為Th2型免疫反應(yīng)占優(yōu)勢而抑制了Th1型免疫反應(yīng)，孕婦Th1/Th2系統(tǒng)的免疫失衡可能是HBV母嬰垂直傳播的重要機(jī)制。Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-6的水平升高使得IFN -γ、IL-12水平下降，機(jī)體的防御能力和抗病毒作用減弱，抑制了Th1細(xì)胞免疫反應(yīng)對HBV的清除，而致使孕婦體內(nèi)病毒載量逐漸升高，而此種情況又可反過來進(jìn)一步加大Th1/Th2細(xì)胞間的失衡，從而導(dǎo)致易發(fā)生胎兒HBV宮內(nèi)感染[11]。本研究顯示，宮內(nèi)感染組、宮內(nèi)未感染組及對照組3組孕婦血清IFN-γ水平與IL-12水平均呈正相關(guān)；3組IL-4水平與IL-6水平亦呈正相關(guān)；而IFN-γ與IL-4、IL-6水平及IL-12與IL-4、IL-6水平均呈負(fù)相關(guān)。說明Th1型和Th2型的同種類型細(xì)胞因子之間是互相促進(jìn)的，隨著IL-12升高，IFN-γ水平升高，而IL-12的抗病毒也是通過誘導(dǎo)IFN-γ阻止HBV的復(fù)制而發(fā)揮作用的。而Th1型和Th2型的不同細(xì)胞因子之間是互相抑制的，隨著IL-4、IL-6水平的升高，IFN-γ、IL-12水平隨之降低，而導(dǎo)致其抗病毒作用減弱，易使胎兒發(fā)生HBV母嬰垂直傳播。另外，本研究結(jié)果顯示，3組新生兒臍血IFN -γ、IL-12、IL-4及IL-6水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。這說明胎兒和新生兒機(jī)體的免疫功能尚未完全發(fā)育成熟，各種免疫細(xì)胞功能低下，抗體及相應(yīng)的細(xì)胞因子缺陷或水平低下，故易發(fā)生病毒感染，且可能會產(chǎn)生免疫耐受而不利于及時有效地清除病毒而極易導(dǎo)致感染的持續(xù)和慢性化?？梢?，對HBV母嬰垂直傳播的預(yù)防關(guān)鍵環(huán)節(jié)是孕婦的防治。通過檢測孕婦血清Th1/Th2型細(xì)胞因子的水平可判斷母體的免疫狀態(tài)及對病毒清除的能力，從而預(yù)測胎兒HBV宮內(nèi)感染的可能性。

綜上所述，Th1/Th2型細(xì)胞因子的免疫失衡與HBV母嬰垂直傳播密切相關(guān)。建議對胎兒及新生兒HBV宮內(nèi)感染的預(yù)防重點(diǎn)應(yīng)放在對孕婦的管理，可通過檢測孕婦外周血IFN-γ、IL-12、IL-4及IL-6等細(xì)胞因子的水平，對胎兒HBV宮內(nèi)感染做出初步的預(yù)測。同時應(yīng)進(jìn)行大樣本的多中心研究，以確定可能發(fā)生胎兒HBV感染的細(xì)胞因子界值水平，進(jìn)一步研究如何通過調(diào)節(jié)孕婦體內(nèi)細(xì)胞因子的水平阻斷HBV母嬰傳播，尋找降低HBV宮內(nèi)感染的新方法。

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2016-03-25