Fmr1基因敲除小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的觀察

胡麗嬋 郭 藝 孫祺章 余國(guó)漢 黃月玲 戴麗軍 黨亞梅 黃 雄陳盛強(qiáng) 黃海櫻

Fmr1基因敲除小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的觀察

胡麗嬋1郭 藝2孫祺章1余國(guó)漢1黃月玲3戴麗軍3黨亞梅1黃 雄1陳盛強(qiáng)2黃海櫻2

1 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院，廣州市惠愛醫(yī)院（廣州510370）2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院（廣州510260）3 廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（廣州510182）

目的 對(duì)不同周齡的KO小鼠與WT小鼠進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)進(jìn)行觀察，探討KO小鼠與WT小鼠的行為差別。方法 采用健康的試驗(yàn)動(dòng)物180只分兩組：①KO組（4、6、8周齡，各周齡30只，雌雄各半，共90只）②WT組（4、6、8周齡，各周齡30只，雌雄各半，共90只）；通過懸尾實(shí)驗(yàn)觀察性別，年齡對(duì)不動(dòng)時(shí)間的影響。結(jié)果同齡KO雌性小鼠比雄性小鼠的靜止時(shí)間差別不大；隨著年齡增大，靜止時(shí)間增長(zhǎng)。同齡同性別的KO鼠比WT鼠的不動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)。P＜0.05；同齡雄性小鼠比雌性小鼠的不動(dòng)時(shí)間短；隨年齡增長(zhǎng)各種系小鼠不動(dòng)時(shí)間增長(zhǎng)，KO鼠的不動(dòng)時(shí)間比WT鼠長(zhǎng)，P＜0.05。結(jié)論 KO小鼠存在抑郁行為表型。

懸尾實(shí)驗(yàn) 脆性X綜合征 抑郁行為

脆性X綜合征（fragile X syndrome，F(xiàn)XS）是最常見的遺傳性智力低下性疾病之一，發(fā)病率僅次于Down綜合征，占非特異性智力低下的2%～6%，在X連鎖智力低下中占40%。其致病基因—FMR1基因（fragile Xmental retardation 1）三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)增導(dǎo)致編碼產(chǎn)物脆性X智力低下蛋白（fragile X mentalretardation protein，F(xiàn)MRP）減少或缺失。FXS患者存在有不同程度的智力低下、記憶力缺失、注意力障礙、視覺運(yùn)動(dòng)整合障礙、癲癇發(fā)作、性格改變、孤獨(dú)、活動(dòng)過度、自閉、感覺過敏、巨睪癥和生殖能力差、特殊面容和焦慮等行為的異常。1992年Verkerk等成功克隆出其致病基因——FMR1?；蚯贸菍⒓?xì)胞基因組中某基因去除或使基因失去活性的技術(shù)。1994年FMR1基因敲除小鼠的出現(xiàn)是FXS研究的一個(gè)里程碑。國(guó)外早有研究表明：Fmr1基因敲除小鼠（Fmr1 knockoutmice，KO鼠）具有類似于脆性X綜合癥的臨床表現(xiàn)，故其為研究人類FXS的理想模型。Fmr1基因敲除鼠缺乏正常的Fmr1蛋白，表現(xiàn)巨睪癥、記憶力缺失、行為異常和智力低下、生殖能力差。目前，F(xiàn)XS小鼠模型的行為學(xué)研究主要集中在學(xué)習(xí)記憶能力、活動(dòng)、社會(huì)關(guān)系、焦慮、運(yùn)動(dòng)能力、感覺刺激特異反應(yīng)等方面。懸尾實(shí)驗(yàn)是將動(dòng)物頭部向下懸掛，動(dòng)物為克服不正常體位，首先產(chǎn)生以逃避為導(dǎo)向的劇烈掙扎運(yùn)動(dòng)，在經(jīng)過努力仍不能擺脫困境后，出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，顯示“行為絕望”狀態(tài)［1-4］。絕望行為反映了一種被稱之為“行為絕望狀態(tài)”。這種行為絕望類似于人類抑郁癥的成分［5-7］，不動(dòng)狀態(tài)潛伏期可以作為FST評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抑郁樣絕望行為一致性的穩(wěn)定參數(shù)。本研究主要探討KO鼠是否有抑郁樣絕望行為，希望進(jìn)一步揭示FXS的行為學(xué)，試圖為深入臨床研究脆性X綜合征患者的行為表型及護(hù)理治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Fmr1基因敲除型（KO）純合子（-/-）及其野生型（WT）純合子（+/+）FVB近交系小鼠是荷蘭伊拉斯塔斯大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)及遺傳學(xué)研究中心Oostra BA教授贈(zèng)送，由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)及繁殖。本研究實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的操作及飼養(yǎng)程序符合廣東省和廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理飼養(yǎng)規(guī)范，遵照醫(yī)學(xué)倫理原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 懸尾實(shí)驗(yàn)裝置及其分析系統(tǒng)，購(gòu)買自四川成都泰盟科技有限公司。TST技術(shù)指標(biāo)：自動(dòng)觀測(cè)通道數(shù)：小鼠6道；采樣率：最大30 fps；圖像分辨率：640×480；單道尺寸：小鼠：300 mm（L）×200 mm（W）×350 mm（H）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 通過將小鼠尾巴末端約1cm處用膠布固定在磁鐵上，使其頭向下懸掛，同時(shí)要注意保證小鼠在懸掛時(shí)身體除了尾巴和儀器接觸外其他部位不能與懸尾儀接觸，記錄處于該環(huán)境的動(dòng)物產(chǎn)生絕望的不動(dòng)狀態(tài)過程中的一系列參數(shù)，主要觀察指標(biāo)：靜止時(shí)間、活動(dòng)時(shí)間、靜止時(shí)間百分比、活動(dòng)時(shí)間百分比。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法 所有結(jié)果均用表示，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析；KO與WT鼠曠場(chǎng)行為比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，KO或WT鼠3個(gè)組間比較采用單因素方差分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠鑒定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)前采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)鑒定FMR1基因敲除型小鼠（KO小鼠）和野生型小鼠（WT小鼠），以確保KO小鼠和WT小鼠準(zhǔn)確性，減少誤差。KO和WT小鼠基因PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1。經(jīng)PCR在KO小鼠擴(kuò)增出約為800 bp的DNA片斷；在WT小鼠擴(kuò)增出約為468 bp的DNA片斷。

圖1 KO和WT小鼠Fmr1基因片斷PCR擴(kuò)增結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)前要先采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)對(duì)KO小鼠和WT小鼠進(jìn)行基因型鑒定，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種正確。

2.2 懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果 該實(shí)驗(yàn)用時(shí)為5分鐘，觀測(cè)窗寬100，觀測(cè)窗高140，降噪?yún)?shù)10，活動(dòng)閾值15。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量為30只四周齡KO小鼠，其中雄雌各半和30只四周齡WT小鼠，其中雄雌各半；30只六周齡KO小鼠，其中雄雌各半和30只六周齡WT小鼠，其中雄雌各半；30只八周齡KO小鼠，其中雄雌各半和30只八周齡WT小鼠，其中雄雌各半。同組小鼠進(jìn)行不同實(shí)驗(yàn)應(yīng)相隔2天。經(jīng)過圖像運(yùn)動(dòng)解析儀、圖像采集分析儀自動(dòng)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)狀況得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過整理分析，各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：同齡同性別的KO鼠比WT鼠的靜止時(shí)間長(zhǎng)（P＜0.05）。同齡KO雌性小鼠比雄性小鼠的靜止時(shí)間長(zhǎng)，但差別不大（P＞0.05）。隨年齡增長(zhǎng)各種系小鼠靜止時(shí)間時(shí)間增長(zhǎng)，但KO鼠的靜止時(shí)間仍比WT鼠長(zhǎng)（P＜0.05）。

3 討 論

脆性X綜合征（fragile X syndrome）是脆性X綜合癥（FXS）由于缺乏FMRP蛋白的表達(dá)導(dǎo)致智能減退和多動(dòng)癥。

懸尾實(shí)驗(yàn)，是一種抗抑郁藥物活性篩選非常靈敏的行為學(xué)檢測(cè)方法，也可用于抑郁癥病理生理機(jī)制的研究。因其快速、方便，自1985年提出至今，被廣為接受和應(yīng)用。目前普遍認(rèn)為，這種行為絕望類似于人類抑郁癥的成分。早期懸尾實(shí)驗(yàn)，以人工計(jì)時(shí)居多，工作量大，客觀性不強(qiáng)，不能定量分析動(dòng)物的掙扎強(qiáng)度。隨著信息、計(jì)算機(jī)、電子工程等技術(shù)和藥理學(xué)的交叉融合，其自動(dòng)化測(cè)量方法也逐漸發(fā)展起來。我們所用的懸尾實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采集由圖像運(yùn)動(dòng)解析儀，圖像采集分析儀自動(dòng)檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)狀況，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過程的自動(dòng)化，可以提取客觀定量數(shù)據(jù)，避免了人工計(jì)數(shù)引入的主觀誤差和對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的干擾，增加了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的客觀性、可靠性。比以往人工觀察更加靈敏，客觀。可以更加全面地評(píng)價(jià)動(dòng)物活動(dòng)特點(diǎn)，且實(shí)驗(yàn)不存在時(shí)間效應(yīng)，即一天當(dāng)中不同時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果是基本一致的。

社交異常、焦慮是FXS患者常見的表現(xiàn)［8-9］。本實(shí)驗(yàn)對(duì)4～8周齡的KO與WT鼠進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)行為觀察，發(fā)現(xiàn)同齡同性別的KO鼠比WT鼠的靜止時(shí)間長(zhǎng)。同齡KO雌性小鼠比雄性小鼠的靜止時(shí)間長(zhǎng)，但差別不大。隨年齡增長(zhǎng)各種系小鼠靜止時(shí)間時(shí)間增長(zhǎng)，但KO鼠的靜止時(shí)間仍比WT鼠長(zhǎng)。提示KO鼠這種行為絕望類似于人類抑郁癥的成分，具有抑郁癥樣行為。與國(guó)外的［10-11］研究結(jié)果一致，因此對(duì)FXS患者的治療不單要給與藥物，還要在護(hù)理上密切注意情緒的觀察和關(guān)懷。

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Observation of tail suspension test in Fm r1 gene knockoutm ice

Hu Lichan，Sun Qizhang，Yu Guohan，et al.The Brain Hospital affiliated to Guangzhou Medical University，Guangzhou 510370，China
Guoyi，Chen Shengqiang，Huang Haiying，etal.Instituteof Neuroscience of the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China
Huang Yueling，Dai Lijun.The Laboratory Animal Research Center of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510182，China

Objective To observe tail suspension test in Fmr1 gene knockoutmice and to explore whether there are differences inmobility of KO and WTmice. Methods 180 testmice were divided into two groups：①KO group（4，6，8 weeks old，each age group ofmice is30，male and female in half，a total of90）②WT group（4，6，8 weeks old，each group ofmice is30，male and female on half，a total of90）.Through forced swimming testand tail suspension test to observe gender，age effect on immobility time. Resu lts With the same age of the same sex，the KO mice's immobility time was longer than WTmice's.P＜0.05.With the same age，the male mice's immobility time was shorter than femalemice's.With the age increase，the immobility time of KO mice was longer than WT mice.P＜0.05. Conclusion Fmr1 gene knockoutmice have anxiety and depressive behavior.

Fragile X Syndrome；Tail suspension test；Depressive behavior

10.3969/j.issn.1000-8535.2016.04.003

2016-04-01）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013B021800075，2015A0030302090）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014Y2-00046）；廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目（B1533015）；廣東市衛(wèi)生局科技項(xiàng)目（20141A10020，20151A011080）

郭藝，E-mail：chenshengq66@gmail.com