梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性

張瑞麗 王千秋

214002無(wú)錫，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市第二人民醫(yī)院皮膚科（張瑞麗）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所臨床性病防治室（王千秋）

梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性

張瑞麗 王千秋

214002無(wú)錫，南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫市第二人民醫(yī)院皮膚科（張瑞麗）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所臨床性病防治室（王千秋）

目的 探討梅毒螺旋體膜重組蛋白Tpp47對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性影響的調(diào)控機(jī)制。方法 用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）構(gòu)建細(xì)胞單層模型，重組蛋白Tpp47（rTpp47）直接與HUVEC單層模型混合培養(yǎng)，或RhoA/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理后再用rTpp47刺激HUVEC單層模型，以煮沸滅活的rTpp47處理HUVEC單層模型為陰性對(duì)照組，采用ELISA檢測(cè)各組培養(yǎng)1、4 h時(shí)辣根過(guò)氧化物酶（HRP）流量，培養(yǎng)12 h用熒光染料羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞骨架系統(tǒng)，共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白排列變化。用Western印跡檢測(cè)rTpp47與煮沸滅活的rTpp47分別處理HUVEC單層模型后細(xì)胞RhoA的表達(dá)水平。結(jié)果 rTpp47刺激HUVEC單層模型1 h時(shí)HRP流量（0.81±0.10）高于陰性對(duì)照組（0.39±0.09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而此時(shí)Y-27632預(yù)處理組HRP流量（0.51±0.10）與單用rTpp47刺激組及陰性對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。培養(yǎng)4 h時(shí)，單用rTpp47刺激組HRP流量顯著增加（2.31±0.14），且高于Y-27632預(yù)處理組（1.21±0.12）及陰性對(duì)照組（0.73±0.12），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而Y-27632預(yù)處理組與陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。rTpp47刺激HUVEC后，與煮沸滅活的rTpp47作用HUVEC相比，細(xì)胞中RhoA表達(dá)增加。同時(shí)，rTpp47刺激細(xì)胞中骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白重排，在胞質(zhì)中形成應(yīng)力纖維，抑制劑Y-27632可部分抑制F肌動(dòng)蛋白重排。結(jié)論 梅毒螺旋體膜重組蛋白Tpp47可通過(guò)RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。

蒼白密螺旋體；內(nèi)皮，血管；通透性；臍靜脈；肌動(dòng)蛋白；Tpp47；RhoA/ROCK信號(hào)通路

血管炎癥反應(yīng)在梅毒發(fā)病機(jī)制中起重要作用，梅毒螺旋體膜蛋白誘導(dǎo)的炎癥是導(dǎo)致血管炎癥改變的主要因素［1］。梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47是螺旋體的主要膜抗原之一，前期［2］研究中，我們發(fā)現(xiàn)，重組蛋白Tpp47（rTpp47）可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(dá)及促進(jìn)單核細(xì)胞趨化因子分泌。研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的調(diào)節(jié)、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中起到重要的作用［3-4］。該信號(hào)通路在血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)中被活化，細(xì)胞間連接及細(xì)胞骨架系統(tǒng)改變部分依賴于RhoA信號(hào)傳導(dǎo)［5］。本研究中，我們構(gòu)建了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）單層模型，通過(guò)觀察rTpp47對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性、RhoA蛋白表達(dá)及細(xì)胞骨架系統(tǒng)的影響，進(jìn)一步探討rTpp47在血管炎癥反應(yīng)中的作用。

資料和方法

一、主要試劑與儀器

辣根過(guò)氧化物酶（HRP）檢測(cè)試劑盒、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、抗RhoA抗體（美國(guó)Cell Signaling公司），DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），羅丹明-鬼筆環(huán)肽、Matrigel基質(zhì)、多聚甲醛、RhoA/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632（美國(guó)Sigma公司），Transwell小室（美國(guó)Coning公司），激光共聚焦專用培養(yǎng)皿（美國(guó)BD公司）。原代培養(yǎng)的HUVEC由第三軍醫(yī)大學(xué)全軍胸外中心贈(zèng)送，單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞本實(shí)驗(yàn)室保存，rTpp47由深圳市菲鵬生物股份有限公司贈(zèng)送，已去除內(nèi)毒素，純度＞90%。Eppendorf AG低速離心機(jī)、Eppendorf 5810R低溫高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），Labconco超凈工作臺(tái)（美國(guó)Labconco公司），Thermo Scientific1500酶標(biāo)儀（芬蘭熱電公司），熒光顯微鏡、EX70倒置顯微鏡及共聚焦激光掃描顯微鏡FV-1000（日本Olympus公司）。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及HUVEC單層模型構(gòu)建：HUVEC培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（含0.05%青鏈霉素雙抗），置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)，選狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取50 μl稀釋的Matrigel基質(zhì)鋪于Transwell小室的上室，37℃放置2 h。洗滌Matrigel 2次，加入細(xì)胞懸液（4×104個(gè)細(xì)胞）100 μl，下室加入 DMEM 培養(yǎng)基 600 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育7～10 d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞已經(jīng)融合，向Transwell小室及下室中各加培養(yǎng)基，使內(nèi)外池液面差＞0.5 cm，4 h后觀察液面差。若液面差仍＞0.5 cm，則為4 h滲漏實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，選取4 h滲漏實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性的孔板用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.ELISA法測(cè)定HUVEC單層通透性：向HUVEC單層模型的Transwell小室中加入rTpp47，使其終濃度為400 μg/L，以煮沸滅活的rTpp47為陰性對(duì)照組，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。取 100 μg/L HRP 溶液 100 μl加入Transwell小室，下室中加入不含HRP的無(wú)酚紅DMEM培養(yǎng)基600μl，分別于培養(yǎng)1、4h時(shí)取下室培養(yǎng)基50μl于96孔板中，加入四甲基聯(lián)苯胺100μl/孔，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量樣本HRP吸光度A值，HRP是測(cè)定血管內(nèi)皮通透性的代表性大分子物質(zhì)。另一組實(shí)驗(yàn)中，RhoA/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理HUVEC單層模型30 min后，再加入rTpp47刺激HUVEC單層模型，按上述步驟檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處樣本HRP吸光度A值。

3.Western印跡檢測(cè)RhoA表達(dá)：將HUVEC接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，換新鮮培養(yǎng)基（不含青鏈霉素雙抗），加入rTpp47，使終濃度為400 μg/L，以煮沸滅活的rTpp47為陰性對(duì)照組，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，超聲裂解。裂解上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳。蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（1∶1 000）兔抗鼠RhoA抗體，4℃緩慢振蕩過(guò)夜。洗膜3次，加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗（1∶8 000），37℃緩慢振蕩1 h。ECL化學(xué)發(fā)光法試劑作用于硝酸纖維素膜5 min，曝光膠片。Quantity One軟件分析記錄每條蛋白電泳帶的灰度值，GAPDH蛋白為內(nèi)參照，比較條帶灰度值進(jìn)行定性分析。

4.細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白表達(dá)：將HUVEC接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。加入rTpp47，使終濃度為400μg/L，以煮沸滅活的rTpp47為陰性對(duì)照組，每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。4%甲醛室溫固定15 min，洗細(xì)胞3次，加入0.05%TritonX-100/PBS室溫破膜1min，加入1%BSA100μl室溫封閉細(xì)胞20～30min，加入10 μmol/L熒光染料羅丹明-鬼筆環(huán)肽工作液100μl，37℃培養(yǎng)2h，共聚焦顯微鏡下觀察骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白排列變化。另1組實(shí)驗(yàn)中，RhoA/ROCK信號(hào)通路特異性抑制劑Y-27632預(yù)處理接種于激光共聚焦專用培養(yǎng)皿上的HUVEC 30 min后，再加入rTpp47刺激HUVEC，后續(xù)步驟同上，共聚焦顯微鏡下觀察骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白排列變化。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、rTpp47對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響

圖1 rTpp47對(duì)HUVEC單層通透性的影響 a：P＜0.05；b：P＞0.05

rTpp47刺激HUVEC單層模型1 h時(shí)HRP流量為（0.81±0.10），通路抑制劑Y-27632預(yù)處理組HRP流量為（0.51±0.10），陰性對(duì)照組為（0.39±0.09），SNK-q統(tǒng)計(jì)分析顯示rTpp47組HRP流量顯著高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通路抑制劑Y-27632預(yù)處理組與單用rTpp47組及陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。rTpp47刺激HUVEC單層模型4 h時(shí)HRP流量（2.31±0.14）較同時(shí)期陰性對(duì)照組（0.73±0.12）差距明顯加大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Y-27632預(yù)處理組HRP流量（1.21±0.12）顯著低于單用rTpp47組（2.31±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與陰性對(duì)照組（0.73± 0.12）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。rTpp47刺激HUVEC單層模型1 h時(shí)HRP流量為（0.81±0.10），顯著高于陰性對(duì)照組（0.39±0.09，P＜0.05），4 h時(shí)HRP流量（2.31±0.14）較同時(shí)期陰性對(duì)照組（0.73±0.12）差距明顯加大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通路抑制劑Y-27632預(yù)處理組1 h時(shí)HRP流量（0.51±0.10）與單用rTpp47刺激組（0.81±0.10）及陰性對(duì)照組（0.39±0.09）相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；4 h時(shí)，Y-27632預(yù)處理組HRP流量（1.21±0.12）明顯低于單用rTpp47刺激組（2.31±0.14），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與陰性對(duì)照組（0.73±0.12）相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示rTpp47可顯著提高HUVEC對(duì)大分子物質(zhì)的通透性，Y-27632可部分抑制rTpp47誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性。見圖1。

二、rTpp47對(duì)細(xì)胞骨架系統(tǒng)重排的影響

激光共聚焦顯微鏡顯示，陰性對(duì)照組HUVEC內(nèi)的F肌動(dòng)蛋白主要富集于細(xì)胞膜的周邊，分布均勻（圖2A），rTpp47刺激后，細(xì)胞周邊的F肌動(dòng)蛋白明顯減少，胞質(zhì)中出現(xiàn)密集的應(yīng)力纖維（圖2B）。Y-27632預(yù)處理組HUVEC中應(yīng)力纖維少于單用rTpp47刺激組，但稍多于陰性對(duì)照組（圖2C）。提示rTpp47可刺激F肌動(dòng)蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)，Y-27632可部分抑制rTpp47誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架系統(tǒng)改變。

圖2 rTpp47對(duì)細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白重排的影響 2A：陰性對(duì)照組，F(xiàn)肌動(dòng)蛋白主要富集于細(xì)胞膜周邊，胞質(zhì)中應(yīng)力纖維較少；2B：Y-27632預(yù)處理組，胞質(zhì)中見少量應(yīng)力纖維；2C：rTpp47刺激組，胞質(zhì)中見大量應(yīng)力纖維

圖3 Western印跡檢測(cè)rTpp47對(duì)RhoA蛋白表達(dá)的影響

三、rTpp47對(duì)RhoA蛋白表達(dá)的影響

Western印跡檢測(cè)rTpp47刺激后HUVEC中RhoA蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，rTpp47刺激組HUVEC中的RhoA蛋白表達(dá)水平顯著高于于陰性對(duì)照組，提示rTpp47可促進(jìn)RhoA蛋白表達(dá)。見圖3。

討 論

血管內(nèi)皮屏障是由內(nèi)皮細(xì)胞單層和基膜組成的一層半選擇性通透屏障，它控制著血管內(nèi)外物質(zhì)交換。炎癥介質(zhì)、病原微生物及其代謝成分均可損傷內(nèi)皮屏障功能，使其通透性增高，血漿蛋白滲出，引起組織、器官水腫和功能障礙，血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)是血管內(nèi)皮屏障功能障礙的基礎(chǔ)［6-7］。梅毒螺旋體介導(dǎo)的炎癥和免疫反應(yīng)是梅毒發(fā)病的基礎(chǔ)，主要由位于螺旋體外膜及細(xì)胞周質(zhì)的膜蛋白發(fā)揮作用。對(duì)多種梅毒螺旋體膜蛋白的研究結(jié)果顯示，膜蛋白可激活炎癥細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子，造成組織損傷或誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，為主要的炎癥激動(dòng)劑［8-9］。前期研究中，我們用rTpp47刺激HUVEC，結(jié)果顯示rTpp47可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、分泌黏附分子及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與淋巴細(xì)胞之間的粘附，提示Tpp47在梅毒的血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)發(fā)生中可能起重要作用。我們利用HUVEC構(gòu)建細(xì)胞單層模型，觀察Tpp47對(duì)血管內(nèi)皮通透的影響。我們選擇HRP作為示蹤劑，檢測(cè)Tpp47對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞大分子物質(zhì)通透性的影響，結(jié)果顯示，rTpp47刺激HUVEC單層后，HRP流量顯著增加，說(shuō)明Tpp47可提高HUVEC單層通透性。

血管內(nèi)皮通透性主要由內(nèi)皮細(xì)胞間連接產(chǎn)生的黏附力與細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架所產(chǎn)生的張力共同維持［10-11］。生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的兩種肌動(dòng)蛋白處于平衡狀態(tài)，當(dāng)受到外界信號(hào)刺激后，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)游離的G肌動(dòng)蛋白單體會(huì)結(jié)合形成聚合狀態(tài)的F肌動(dòng)蛋白，并且通過(guò)自身螺旋形成微絲，這一過(guò)程稱為細(xì)胞骨架重排，F(xiàn)肌動(dòng)蛋白重排可使內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間裂隙產(chǎn)生，血管內(nèi)皮通透性增加［12］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)rTpp47可誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白重組。肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞-細(xì)胞之間的緊密連接和粘附連接有密切聯(lián)系，rTpp47誘導(dǎo)細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞間出現(xiàn)縫隙，血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高。

研究發(fā)現(xiàn)，RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞骨架重組中起重要作用［13-14］。本研究Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rTpp47可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中RhoA蛋白的表達(dá)，進(jìn)而激活RhoA/ROCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。當(dāng)Rho激酶被激活時(shí)，活化的Rho激酶一方面失活LIM激酶介導(dǎo)的cofilin（一種分割肌動(dòng)蛋白的蛋白質(zhì)）而調(diào)制肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。另一方面通過(guò)磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亞單位抑制肌球蛋白磷酸酶活性，以及直接磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC）的調(diào)節(jié)輕鏈增加MLC磷酸化。Y-27632是RhoA下游效應(yīng)器ROCK的特異抑制劑，可與ROCK催化位點(diǎn)結(jié)合而抑制激酶活性［15］。我們用Y-27632預(yù)處理HUVEC單層模型后發(fā)現(xiàn)，Y-27632可部分減輕rTpp47誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高及細(xì)胞骨架蛋白F肌動(dòng)蛋白重排，提示RhoA/ROCK信號(hào)通路參與rTpp47誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變。

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Treponema pallidummembrane protein Tpp47 regulates the permeability of vascular endothelial cells via the RhoA/ROCK signal pathway:an experimental study

Zhang Ruili,Wang Qianqiu
Department of Dermatology,Wuxi No.2 People′s Hospital,Wuxi 214002,Jiangsu,China （Zhang R）;Department of Sexually Transmitted Disease Clinical Management,Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China（Wang QQ）

ObjectiveTo investigate mechanisms underlying the regulation of the permeability of vascular endothelial cells by theTreponema pallidummembrane protein Tpp47.MethodsHuman umbilical vascular endothelial cell（HUVEC）monolayers were established as a model,and were directly cultured with the presence of recombinant Tpp47 protein （rTpp47-treated group）,or boiled and inactivated rTpp47 （negative control group）.Some HUVEC monolayers,which were pretreated with the RhoA/ROCK signal pathway inhibitor Y-27632 for 30 minutes and then cultured with the presence of rTpp47,served as the pretreatment group.After 1-and 4-hour additional culture,enzymelinked immunosorbent assay（ELISA）was performed to estimate the permeability of these cell monolayers to horseradish peroxidase （HRP）.After 12 hours of culture,rhodamine-phalloidin was used to stain cytoskeletal proteins,and confocal laser scanning microscopy was performed to observe the arrangement of the cytoskeletal protein F-actin.Western-blot analysis was conducted to measure the expressions of RhoA in HUVECs treated with rTpp47 or inactivated rTpp47.ResultsThe supernatant level of HRP（expressed as the absorbance value at 450 nm）was significantly higher in the rTpp47-treated group than in the negative control group（0.81±0.10 vs.0.39±0.09,P＜0.05）,but no significant difference was observed between the pretreatment group （0.51±0.10）and rTpp47-treated group or negative control group（bothP＞0.05）after 1-hour culture.Similarly,the rTpp47-treated group showed significantly increased levels of HRP compared with the pretreatment group and negative control group（2.31±0.14 vs.1.21±0.12 and 0.73±0.12,bothP＜ 0.05）,while there was no significant difference between the pretreatment group and negative control group after 4-hour culture.The expression of RhoA in HUVECs treated with rTpp47 was significantly higher than that in those treated with inactivated rTpp47.Confocal laser scanning microscopy showed that rTpp47 treatment led to the rearrangement of F-actin in HUVECs followed by the formation of stress fibers in cytoplasm,while Y-27632 could partly inhibit the rearrangement of F-actin.ConclusionThe recombinantTreponema pallidummembrane protein Tpp47 can regulate the permeability of vascular endothelial cells through the RhoA/ROCK signal pathway.

Treponema pallidum;Endothelium,vascular；Permeability；Umbilical veins；Actins;Tpp47;RhoA/ROCK signaling pathway

Wang Qianqiu,Email:doctorwqq@163.com

2015-04-24）

（本文編輯：吳曉初）

王千秋，Email：doctorwqq@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.01.005

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