MiR-146a在長波紫外線誘導人皮膚成纖維細胞光老化中作用機制的研究

李曉 李巍 楊清華 李之珩 古桂雄

215003蘇州大學附屬兒童醫(yī)院兒童保健科（李曉、古桂雄），皮膚科（李巍），普通外科（楊清華），實驗室（李之珩）

·論著·

MiR-146a在長波紫外線誘導人皮膚成纖維細胞光老化中作用機制的研究

李曉 李巍 楊清華 李之珩 古桂雄

215003蘇州大學附屬兒童醫(yī)院兒童保健科（李曉、古桂雄），皮膚科（李?。?，普通外科（楊清華），實驗室（李之珩）

目的 探討長波紫外線（UVA）誘導人皮膚成纖維細胞（HSF）光老化中miR-146a的表達情況，以及上調(diào)miR-146a表達對其靶基因Smad4及細胞光老化的影響。方法 以10 J/cm2UVA照射HSF（UVA照射組），分別在0、3、7、14 d提取RNA，實時定量PCR檢測miR-146a的表達量。通過慢病毒轉染上調(diào)miR-146a的表達（miR-146a過表達組），在7 d、14 d后用熒光顯微鏡觀察轉染效率，并通過實時定量PCR驗證細胞內(nèi)miR-146a表達量?？瞻讓φ战M為正常培養(yǎng)的HSF（不做任何處理），miR-146a過表達組為慢病毒轉染HSF后，再用UVA照射。MTT法檢測空白對照組、UVA照射組、miR-146a過表達組、miR-146a過表達組細胞增殖吸光度（A值），實時定量PCR檢測各組細胞內(nèi)老化相關基因p53、p16和p21 mRNA的表達，Western印跡法檢測各組細胞內(nèi)Smad4蛋白表達。采用重復測量的方差分析、析因設計的方差分析進行統(tǒng)計學分析。結果 重復測量的方差分析顯示，隨培養(yǎng)時間的延長，UVA照射組和空白對照組miR-146a的表達量均逐漸下降（F=213.840，P<0.01）；UVA照射組表達量低于空白對照組（F=52.55，P<0.01），且照射時間越長，下調(diào)越明顯。慢病毒轉染HSF后，細胞內(nèi)均有較高的熒光表達，miR-146a過表達組在第7天（10.31±0.17）與第14天時（9.65±0.19）的miR-146a表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但較空白對照組（分別為8.33±0.13和7.86±0.11）顯著增高，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=42.49，P<0.01）。析因設計的方差分析顯示，UVA照射對細胞增殖活性有抑制作用（P<0.01），UVA照射組、UVA+miR-146a組細胞增殖均分別低于空白對照組、miR-146a過表達組（P<0.01）；慢病毒轉染上調(diào)miR-146a的表達對細胞增殖活性也有影響（P<0.01），但miR-146a過表達組與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），UVA+miR-146a組顯著高于UVA照射組（P<0.01）。實時定量PCR和Western印跡法結果顯示，UVA照射可上調(diào)p21、p53、p16 mRNA的表達（均P<0.01），同時對細胞內(nèi)Smad4蛋白表達有促進作用（P<0.01）；UVA照射組、UVA+miR-146a組p21、p53、p16 mRNA和Smad4蛋白表達均分別高于空白對照組、miR-146a過表達組（均P<0.01），而miR-146a過表達組與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（均P>0.05），UVA+miR-146a組均顯著低于UVA照射組（均P<0.01）。結論 在UVA誘導光老化的HSF中，miR-146a的表達受到抑制，上調(diào)其表達能夠抑制Smad4的表達，促進光老化細胞增殖，起到抗細胞光老化的作用。

成纖維細胞；紫外線；皮膚衰老；微RNAs；Smad4蛋白質(zhì)；miR-146a

微RNAs（miRNAs）在人類基因中僅占1%～5%，卻能調(diào)控至少30%人類蛋白編碼基因和大約60%mRNA。我們前期對長波紫外線（UVA）誘導成纖維細胞光老化中差異表達的miRNA進行了基因芯片篩選，發(fā)現(xiàn) miR-146a的表達出現(xiàn)下調(diào)［1］。MiR-146a 是miRNAs家族成員之一，參與細胞增生、免疫、炎癥等多種生物學過程［2］。Targetscan軟件分析顯示，作為miR-146a的靶點基因，Smad4是信號轉導蛋白Smads的功能活動中心，編碼的信號轉導蛋白在組織的發(fā)育、再生及修復中起重要作用［3］。本研究中，我們建立了UVA照射誘導的原代人皮膚成纖維細胞（HSF）的光老化模型［1］，檢測HSF中miR-146a和Smad4的表達，并用慢病毒轉染上調(diào)miR-146a的表達，觀察其對細胞增殖和光老化的影響，探討其內(nèi)在的分子機制。

資料與方法

一、標本來源

本研究方案經(jīng)蘇州大學附屬兒童醫(yī)院倫理委員會審核批準，按“知情同意，自愿參加”的原則，在本院泌尿外科中收集3～12歲健康兒童包皮環(huán)切術后皮膚標本，家屬簽署知情同意書。

二、主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國Gibco公司）；UVA輻射儀（SH4 A型，上海希格瑪高技術有限公司，波長320～400 nm，輻射強度25 mW/cm2）、噻唑蘭（MTT）、分散酶、膠原酶、β 肌動蛋白、Smad4鼠單克隆抗體（美國Sigma公司）；Trizol（美國Invitrogen公司）；增強化學發(fā)光試劑（ECL）（美國Bethyl公司）；山羊抗小鼠IgG抗體（上海碧云天生物技術有限公司）；miR-146a慢病毒載體、慢病毒轉染試劑盒（上海吉凱基因化學技術有限公司）；兔抗人Smad4多克隆抗體、實時定量PCR試劑盒、SYBR熒光染料試劑（日本TaKaRa公司）；ABI7300實時定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司）。

三、細胞培養(yǎng)

包皮塊用含雙抗的PBS漂洗3次，清除皮下脂肪和血管，剪成3 mm×1 mm的皮條，37℃下用分散酶消化3～4 h，分離表皮與真皮。將真皮剪成碎沫狀，在膠原酶作用下37℃消化2～4 h。用200目篩網(wǎng)過濾，離心后將細胞重懸于含10%胎牛血清和1%青霉素+鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于亞融合狀態(tài)對數(shù)生長期細胞以0.02%EDTA和0.25%胰酶消化傳代，10代以內(nèi)的細胞用于后續(xù)實驗。

四、實驗分組與處理

將培養(yǎng)的HSF分為4組：①空白對照組：不做任何處理；②UVA照射組：照射UVA，分別于照射第 0、3、7、14天提取 UVA照射組和空白對照組HSF的總RNA，實時定量PCR檢測miR-146a的表達量；③miR-146a過表達組：慢病毒轉染HSF，并于轉染后第7、14天用熒光顯微鏡觀察轉染效率，并通過實時定量PCR驗證細胞內(nèi)miR-146a表達量；④UVA+miR-146a組：慢病毒轉染HSF后，用UVA照射，照射方法同UVA照射組。

UVA照射步驟：吸去細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，再加入少量PBS覆蓋底面，培養(yǎng)皿于冰水中照光。以寬譜UVA照射，照射劑量為10 J/cm2，連續(xù)照射14 d［1］。照射后棄去 PBS，重新加入培養(yǎng)基。

慢病毒轉染HSF：miR-146a慢病毒表達載體的構建和鑒定由南京吉凱生物技術有限公司設計完成，并按照慢病毒轉染手冊轉染HSF。

五、RT-PCR 檢測 p53、p21、p16 mRNA 及 miR-146a的表達

采用Trizol試劑盒提取各組總RNA。按反轉錄試劑盒說明書配制反應體系，總體積20 μl，37℃反轉錄15min，85℃5s使反轉錄酶失活，即獲得cDNA，置-20℃冰箱中保存。用染料法（SYBR GreenⅠ）進行相對定量分析。PCR反應體系共20 μl，包括SYBR 10 μl，ROX Reference Dye（× 50）0.4 μl，雙蒸水6 μl，上游和下游引物各 0.8 μl，cDNA 2 μl。各引物序列見表1，引物由南京迪瑞生物技術有限公司合成。兩步法實時定量PCR：95℃5 s；95℃5 s，60℃30 s，40個循環(huán)。每循環(huán)1次就收集1個熒光強度數(shù)據(jù)，建立實時擴增曲線，其產(chǎn)物熒光強度與其表達量，即模板中目的基因的豐度呈正相關。以β肌動蛋白作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達值。每個樣品設3個復孔，結果取平均值。

六、MTT法檢測細胞增殖活性

各組成纖維細胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，倒掉舊培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶消化，待細胞變圓成單個，加入完全培養(yǎng)液輕輕吹打，使其成單細胞懸液。收集細胞至離心管中，280×g離心5 min。棄去上清液，沉淀加入培養(yǎng)基懸浮混勻，調(diào)整細胞密度為5×104/ml～10×104/ml。96孔板中每孔加入細胞懸液100 μl，使每孔細胞數(shù)為 5× 103～ 10 × 103。混勻后置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每組設5個復孔。取出96孔板，吸去上清液，更換新的培養(yǎng)基，每孔加 5 g/L MTT 溶液 20 μl，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 h，傾去上清液，每孔加入 DMSO 150 μl，在水平搖床上充分振蕩10 min，酶標儀490 nm下測定各孔A值，A值越高說明細胞增殖活性越強。

表1 PCR引物序列

七、Western印跡法檢測Smad4蛋白的表達量

根據(jù)實驗設計的分組，即空白對照組、UVA照射組、miR-146a過表達組、UVA照射+miR-146a過表達組，以10 J/cm2UVA照射成纖維細胞連續(xù)14 d建立光老化模型，培養(yǎng)以后收集細胞，用預冷PBS洗滌3次，將細胞重懸于裂解液中，冰浴30 min，使細胞充分裂解。然后4℃8 000×g離心5 min，收集上清液進行蛋白質(zhì)定量。各組取等量蛋白質(zhì)，經(jīng)10%SDS-PAGE分離后，半干轉膜至PVDF膜上，封閉后與一抗結合，4℃搖床過夜；TBST洗滌后與二抗結合反應，同上洗滌，用ECL發(fā)光顯色，以β肌動蛋白作為對照。

八、統(tǒng)計學分析

結 果

一、UVA照射HSF對miR-146a表達的影響

照射前，UVA照射組HSF miR-146a表達量與空白對照組差異無統(tǒng)計學意義；UVA照射第3、7、14天，UVA照射組miR-146a表達量持續(xù)下調(diào)，且低于同時間空白對照組（均P＜0.05）。見圖1。重復測量的方差分析顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，miR-146a表達量逐漸下降（F=213.840，P＜0.01）；UVA 照射組miR-146a表達量較對照組出現(xiàn)下調(diào)（F=52.55，P＜0.01），且照射時間越長，下調(diào)越明顯；培養(yǎng)時間與分組之間存在交互作用，即兩組miR-146a表達量隨時間的變化趨勢不同（F=21.241，P＜0.01）。

二、慢病毒介導miR-146a的過表達及實時定量PCR驗證

慢病毒載體轉染HSF后，第7天和14天時細胞內(nèi)均有較強的熒光表達（圖2）。實時定量PCR結果顯示，miR-146a過表達組在第7天（10.31±0.17）與第14天時（9.65±0.19）的miR-146a表達量差異無統(tǒng)計學意義（F=1.989，P>0.05），但較空白對照組（分別為8.33±0.13和7.86±0.11）顯著增高，組間差異有統(tǒng)計學意義（F=42.49，P<0.01），且時間與分組無交互作用（F=0.054，P>0.05）。

三、上調(diào)miR-146a表達對細胞增殖的影響

MTT結果顯示，空白對照組、UVA照射組、miR-146a過表達組、UVA+miR-146a組細胞增殖（A值）分別為 0.8072± 0.0505、0.2518± 0.0595、0.7957±0.0805和0.5959±0.0281。析因設計的方差分析顯示，UVA照射對細胞增殖活性有抑制作用（F=128.033，P<0.01）；慢病毒轉染上調(diào)miR-146a的表達對細胞增殖活性也有影響（F=24.838，P<0.01），UVA照射和慢病毒轉染上調(diào)miR-146a的表達有交互作用（F=28.392，P<0.01）。UVA照射的單獨效應分析顯示：UVA照射組、UVA+miR-146a組細胞增殖均分別低于空白對照組、miR-146a過表達組（P<0.01）；慢病毒轉染上調(diào)miR-146a表達的單獨效應分析顯示：miR-146a過表達組細胞增殖A值與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），UVA+miR-146a組細胞增殖A值顯著高于UVA照射組（P<0.01）。

圖1 UVA照射人皮膚成纖維細胞對miR-146a表達的影響

圖2 miR-146a慢病毒轉染成纖維細胞后第7、14天熒光表達情況（×100） 轉后第7、14天時細胞內(nèi)均有較強的熒光表達，表明miR-146a慢病毒轉染成功

四、上調(diào)miR-146a表達對老化相關基因的影響

析因設計的方差分析顯示，UVA照射可上調(diào)細胞老化相關基因p21、p53、p16 mRNA的表達（F=444.909、275.110、127.228，均 P<0.01），慢病毒轉染miR-146a后，則可下調(diào)各基因mRNA的表達（F=41.141、28.178、25.932，P<0.01），UVA 照射與慢病毒轉染上調(diào)miR-146a的表達有交互作用（F=41.785、43.101、29.413，均 P<0.01）。各單獨效應分析顯示：UVA 照射組、UVA+miR-146a組 p21、p53、p16 mRNA的表達均分別高于空白對照組、miR-146a過表達組（均P<0.01）；而miR-146a過表達組p21、p53、p16 mRNA的表達與空白對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（均 P>0.05），UVA+miR-146a組 p21、p53、p16 mRNA的表達均顯著低于UVA照射組（均P<0.01）。見圖 3。

五、miR-146a作用于靶基因Smad4的效應

圖3 UVA照射14 d后各組成纖維細胞老化相關基因p21、p53、p16 mRNA表達 a：與UVA照射組相比，miR-146a慢病毒轉染成纖維細胞并UVA照射后，各老化相關蛋白表達顯著降低（P<0.01）

Western印跡結果顯示，空白對照組、UVA照射組、miR-146a過表達組、UVA+miR-146a組Smad4的表達量分別為 0.24±0.055、1.74±0.238、0.22±0.26和0.88±0.207。見圖4。析因設計的方差分析顯示，UVA照射對細胞內(nèi)Smad4蛋白表達有促進作用（F=133.981，P<0.01）；慢病毒轉染對 Smad4表達也有影響（F=22.139，P<0.01），UVA照射和慢病毒轉染上調(diào)miR-146a表達有交互作用（F=20.076，P<0.01）。各單獨效應分析顯示，UVA照射組、UVA+miR-146a組細胞內(nèi)Smad4蛋白表達量均分別高于空白對照組、miR-146a過表達組（P<0.01）；而miR-146a過表達組細胞內(nèi)Smad4蛋白表達量與空白對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），UVA+miR-146a組細胞內(nèi)Smad4蛋白表達量顯著低于UVA照射組（P<0.01）。

圖4 Western印跡法檢測UVA照射14 d后各組人皮膚成纖維細胞Smad4蛋白表達 1：空白對照組；2：UVA照射組；3：miR-146a過表達組；4：UVA+miR-146a組

討 論

光老化是一個復雜的過程，由多種基因和生長因子調(diào)控。UVA照射在光老化的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用，且長期UVA照射可誘發(fā)皮膚癌［4］。MiRNAs通過作用于特定的靶基因發(fā)揮作用，在轉錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達［5］，并已被用于疾病的診斷、治療和預后［6］。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在細胞光老化中出現(xiàn)下調(diào)［1］。MiR-146是miRNAs家族中的一員，包括兩個進化保守的miRNA基因：miR-146a和miR-146b。兩者的成熟序列僅在3′端存在兩個堿基的差異，功能大致相同。MiR-146是第1個被發(fā)現(xiàn)在免疫系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)作用的miRNA，表達于T細胞、B細胞、單核細胞及巨噬細胞等［7］。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a作用于Numb的mRNA可以增加小鼠黑素瘤細胞的增殖能力，而Numb是Notch信號的抑制因子［8］。

本研究結果顯示，UVA可以誘導HSF中miR-146a的下調(diào)，提示其在光老化的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要的作用。用慢病毒轉染成纖維細胞，上調(diào)miR-146a的表達，經(jīng)過UVA照射誘導細胞光老化后，發(fā)現(xiàn)miR-146a表達的上調(diào)能促進光老化細胞的增殖活性，并能抑制老化相關基因p53、p16和p21 mRNA的表達。推測miR-146a具有抗光老化作用。

本課題組前期通過生物信息學方法預測miR-146a可能作用的靶基因［1］，并通過Western印跡法進行驗證，結果顯示，無UVA照射時，miR-146a對Smad4表達無作用；有UVA照射時，miR-146a對Smad4具有一定調(diào)控作用，能夠抑制Smad4的表達。導致這種現(xiàn)象的可能原因是無UVA照射時，Smad4的表達處于基礎水平，而miR-146a在應急條件下才發(fā)揮作用。Smad4是信號轉導蛋白Smads的功能活動中心，編碼的信號轉導蛋白主要參與轉化生長因子β（TGF-β）超家族信號在細胞內(nèi)的轉導。TGF-β是一種多功能多肽，在組織的發(fā)育、再生及修復中起重要作用。TGF-β還是一種具有多功能活性的細胞因子，可以調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和凋亡，對多種細胞因子有重要影響［9-10］。研究表明，miR-146a可通過作用于Smad4影響TGF-β通路，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖和分化［11］。另有研究表明，Smad4可以抑制腫瘤細胞的增殖，如胰腺癌［3］、胃癌［12］等。

綜上所述，本研究證實，miR-146a在UVA誘導的光老化細胞中出現(xiàn)顯著的表達下調(diào)，上調(diào)其表達則能降低老化相關蛋白的表達，增加光老化細胞的增殖能力，從而可以抗光老化。而miR-146a的調(diào)控作用極有可能是通過作用于靶基因Smad4來實現(xiàn)的。由此推斷，miR-146a在光老化的發(fā)生和發(fā)展中具有調(diào)控靶基因的作用，這可能為將來治療光老化提供藥物靶點。

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Role of miR-146a in ultraviolet A-induced photoaging of human skin fibroblasts and its mechanism

Li Xiao,Li Wei,Yang Qinghua,Li Zhiheng,Gu Guixiong

Department of Child Health Care,Children′s Hospital of Soochow University,Suzhou 215003,China （Li X,Gu GX）;Department of Dermatology,Children′s Hospital of Soochow University,Suzhou 215003,China （Li W）;Department of General Surgery,Children′s Hospital of Soochow University,Suzhou 215003,China（Yang QH）;Laboratory of Children′s Hospital of Soochow University,Suzhou 215003,China（Li ZH）

Objective ToinvestigatemiR-146a-Smad4expressionduringultravioletA（UVA）-inducedphotoaging of human skin fibroblasts （HSFs）,and to evaluate effects of up-regulation of miR-146a expression on its target gene Smad4 and cell photoaging.Methods HSFs were isolated from the prepuce,and subjected to primary culture and maintained up to 10thpassage.Then,the HSFs were classified into 4 groups:blank control group receiving no treatment,UVA group irradiated with 10 J/cm2UVA,miR-146a group transfected with a lentiviral vector expressing miR-146a,UVA+miR-146a group transfected with the lentiviral vector expressing miR-146a followed by UVA radiation.Real time PCR was performed to measure miR-146a expression in HSFs in the UVA group on day 0,3,7 and 14 after UVA radiation.Fluorescence microscopy was carried out to estimate transfection efficiency on day 7 and 14 in the miR-146a group after transfection,and real time PCR was performed to quantify miR-146a expression in these cells.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was conducted to evaluate proliferative activity of HSFs,real time PCR to quantify mRNA expressions of photoaging-related genes p53,p21 and p16,and Western blot analysis to measure Smad4 protein expression in these cells.Statistical analysis was carried out by using repeated-measures analysis of variance and factorial design analysis of variance.Results Repeated-measures analysis of variance showed that the expression of miR-146a decreased over time in both the UVA group and blank control group（F=213.840,P ＜ 0.01）,and significantly lower in the UVA group than in the blank control group （F=52.55,P＜0.01）,with the difference between the two groups increasing over time.After transfection with the lentiviral vector expressing miR-146a-Smad4,HSFs showed a strong fluorescence intensity of miR-146a.The expression level of miR-146a was significantly higher in the miR-146a group than in the blank control group on day 7 and 14 after transfection（10.31±0.17 vs.8.33±0.13 on day 7,9.65±0.19 vs.7.86±0.11 on day 14,F=42.49,P＜0.01）,but insignificantly different between day 7 and 14 in the miR-146a group （P＞0.05）.Factorial design analysis of variance showed that UVA radiation had an inhibitory effect on the proliferative activity of HSFs（P＜0.01）,whichwassignificantlylowerinthe UVAgroup than in the blank controlgroup（P ＜0.01）,and lower in the UVA+miR-146a group than in the miR-146a group （P＜0.01）.The lentivirus-mediated up-regulation of miR-146a expression also affected cellular proliferative activity （P＜0.01）,which was significantly higher in the UVA+miR-146a group than in the UVA group（P ＜ 0.01）,but insignificantly different between the miR-146a group and blank control group（P ＞ 0.05）.Real time PCR and Western blot analysis both revealed that UVA radiation could increase the expressions of p53,p21 and p16 mRNAs as well as Smad4 protein（allP ＜ 0.01）.Concretely speaking,the expressions of p53,p21,p16 mRNAs and Smad4 proteinwereallsignificantlyhigherintheUVAgroupthanintheblankcontrolgroup （allP＜0.01）,andhigherintheUVA+miR-146a group than in the miR-146a group （allP＜0.01）,but significantly lower in the UVA+miR-146a group than in the UVA group（allP＜0.01）,and insignificantly different between the blank control group and miR-146a group（allP＞0.05）.Conclusion The expression of miR-146a is inhibited in UVA-induced photoaged HSFs,and its up-regulation may counteract cell photoaging by suppressing Smad4 expression in,and promoting proliferation of,photoaged HSFs.

Fibroblasts;Ultraviolet rays;Skin aging;MicroRNAs;Smad4 protein;miR-146a

s:Li Wei,Email:carfield1981@126.com;Gu Guixiong,Email:szggx000@163.com

李巍，Email：carfield1981@126.com；古桂雄，Email：szggx000@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.011

國家自然科學基金（81301380）；江蘇省自然科學基金（BK2012168）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81301380）;Natural Science Foundation of Jiangsu Province of China（BK2012168）

2015-05-18）

（本文編輯：周良佳 顏艷）