普萘洛爾及異丙腎上腺素對體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子表達的影響

朱雅琳 侯巍 帕麗達·阿布利孜

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科

·論著·

普萘洛爾及異丙腎上腺素對體外培養(yǎng)嬰兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖和血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子表達的影響

朱雅琳 侯巍 帕麗達·阿布利孜

830054烏魯木齊，新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚科

目的 探討普萘洛爾及異丙腎上腺素在體外對嬰兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖及血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、人堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達的影響。方法 將體外培養(yǎng)的2～3代增殖期嬰兒血管瘤內(nèi)皮細胞分為普萘洛爾組和異丙腎上腺素組，其中普萘洛爾組分別換濃度為10、15、20 mg/L普萘洛爾工作液（10、15、20 mg/L普萘洛爾組）、空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）和含0.16%DMSO EGM-2培養(yǎng)基（DMSO組）培養(yǎng)，而異丙腎上腺素組分別換5、10、20 mg/L異丙腎上腺素工作液（5、10、20 mg/L異丙腎上腺素組）和空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）培養(yǎng)。采用MTT法測定24、48、72、96 h時各組血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖情況，ELISA法測定培養(yǎng)24、48 h時各組細胞培養(yǎng)上清液中VEGF、VEGF-2、bFGF的濃度。 結(jié)果 培養(yǎng)24、48 h時，10、15、20 mg/L普萘洛爾組血管瘤內(nèi)皮細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義（H值分別為1.152、2.643，均P＞0.05）；72、96 h時，20 mg/L普萘洛爾組血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖明顯低于空白組（P＜0.05），而空白組、DMSO組及10、15 mg/L普萘洛爾組間差異均無統(tǒng)計學意義。各濃度普萘洛爾、異丙腎上腺素作用24 h時均對VEGF、VEGF-2、bFGF水平有一定影響。48 h時，15、20 mg/L普萘洛爾組VEGF水平均較空白組顯著下降，同時10、15、20 mg/L普萘洛爾組VEGF-2、bFGF水平也均較空白組顯著下降（P＜0.05）；而5、10、20 mg/L異丙腎上腺素組VEGF水平均較空白組顯著升高（P＜0.05），20 mg/L異丙腎上腺素組VEGF-2、bFGF水平均顯著高于空白組及5、10 mg/L異丙腎上腺素組（P＜0.05）。結(jié)論 一定濃度普萘洛爾作用于增殖期嬰兒血管瘤內(nèi)皮細胞一定時間后能夠抑制細胞生長，而異丙腎上腺素反之，兩者對細胞因子表達的影響作用也相反，因此推斷普萘洛爾治療嬰兒血管瘤的機制可能與β腎上腺素能受體及其下游信號轉(zhuǎn)導影響相關細胞因子表達相關。

血管瘤；內(nèi)皮細胞；普萘洛爾；異丙腎上腺素；成纖維細胞生長因子2；內(nèi)皮生長因子

目前血管瘤的發(fā)病機制尚不清楚，主要有遺傳和基因突變學說、胎盤絨毛膜細胞異位學說、內(nèi)皮祖細胞或干細胞學說、血管發(fā)生失衡理論等［1-7］。自2008年始，大量研究和臨床資料顯示，普萘洛爾對血管瘤有明顯療效［8-11］。近期有報道認為，異丙腎上腺素在體外能促進血管生成［12］，但機制不清。普萘洛爾和異丙腎上腺素均作用于β腎上腺素受體，前者為受體阻斷劑，后者為受體激動劑。β腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到人們重視。此外，內(nèi)皮細胞增殖失控已成為血管瘤發(fā)病機制研究的一個重要方面，其中，血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等促血管生成因子在患兒體內(nèi)及組織中高表達，是增生期血管瘤的主要發(fā)病機制［13-15］，而VEGF是作用最強的一種［16-18］。本研究使用一定濃度的普萘洛爾及異丙腎上腺素作用于體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細胞，比較二者對體外培養(yǎng)環(huán)境下的血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的影響，同時用ELISA分別測定兩種藥物作用前后VEGF、VEGF-2、bFGF的變化，研究普萘洛爾治療嬰兒血管瘤的機制以及β受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用。

材料和方法

1.樣本來源：血管瘤標本來自臨床手術切除的額部增殖期血管瘤，患兒女，9個月?；純焊改妇橥?。

2.主要試劑與儀器：EBM-2培養(yǎng)基、EGMTM-2MV BulletKitTM（瑞士Lonza公司），0.25%胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、含雙抗 PBS（美國 HyClone公司），20%胎牛血清（美國Gibco公司），兔抗人血漿血管性血友病因子（vwf）多克隆抗體、聚合HRP標記抗兔IgG、兔抗人VEGFR-2抗體（武漢博士德生物工程有限公司），抗人CD31 FITC、鼠IgG1 K同型對照FITC（美國 eBioscience公司），MTT、DMSO（美國Sigma公司），AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物）。酶標儀、CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司），熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），MACSQuant流式細胞儀（德國MiltenyiBiotec公司）。VEGF、VEGF-2、bFGF的ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

3.普萘洛爾對細胞生長曲線的影響：首先配制含普萘洛爾的培養(yǎng)基，用DMSO溶解普萘洛爾，用EGM-2培養(yǎng)基稀釋成 10、15、20 mg/L工作液，DMSO終濃度為0.16%，0.22 μm濾器過濾分裝。血管瘤內(nèi)皮細胞的原代培養(yǎng)及鑒定見文獻［19］。取2代細胞消化離心并計數(shù)，均勻鋪入96孔板，每孔2×104個，加入 EGM-2 培養(yǎng)基 200 μl，孵育 24 h，待細胞貼壁后換液。將細胞隨機分為5組，分別換濃度為10、15、20 mg/L普萘洛爾工作液，空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）和含0.16%DMSO EGM-2培養(yǎng)基（DMSO組），每組均設4個復孔。放入CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于 24、48、72、96 h 用 MTT 法［19］測定其吸光度（A值），觀察細胞形態(tài)學改變。以時間做橫坐標，平均A值為縱坐標，分別做每個濃度的細胞平均A值折線圖。

4.普萘洛爾及異丙腎上腺素對體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細胞VEGF、VEGF-2、bFGF的影響：取2～3代增殖期血管瘤內(nèi)皮細胞，在6孔板中調(diào)整細胞密度為3×105/ml，每孔2 ml。隨后將6孔板放置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后換液。將細胞分為普萘洛爾組和異丙腎上腺素組，其中普萘洛爾組又分為5組，分別換濃度為10、15、20 mg/L普萘洛爾工作液、空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組）和含0.16%DMSOEGM-2培養(yǎng)基（DMSO組），每組8個復孔。異丙腎上腺素組分為4組，分別換EGM-2培養(yǎng)基稀釋而成的5、10、20 mg/L異丙腎上腺素工作液和空白EGM-2培養(yǎng)基（空白組），每組8個復孔。各組在作用24、48 h時，取細胞培養(yǎng)上清液，采用 ELISA法分別檢測各組 VEGF、VEGF-2、bFGF的水平。

5.統(tǒng)計方法：采用SPSS17.0軟件，由于A值數(shù)據(jù)非正態(tài)，多組A值的比較采用多組獨立樣本的Kruskal-WallisH檢驗。細胞因子濃度計量資料采用±s表示，計量資料均進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，方差齊使用單因素方差分析，兩兩比較為SNK法，方差不齊則使用Dunnett方法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細胞的影響：普萘洛爾作用前，各孔細胞貼壁生長良好，20 mg/L普萘洛爾作用96 h后，細胞形態(tài)呈圓形及類圓形，細胞間距增大，細胞變稀疏（圖1）。10、15、20mg/L普萘洛爾分別作用24～96h（圖2），24～48h時，空白組、DMSO 組及 10、15、20 mg/L普萘洛爾組間血管瘤內(nèi)皮細胞增殖情況差異無統(tǒng)計學意義（H值分別為1.152、2.643，均 P ＞ 0.05）；72、96 h 時，各組血管瘤內(nèi)皮細胞增殖情況不全相同（H值分別為13.521、11.329，均P＜0.05）。進一步兩兩比較，72 h時空白組與DMSO組細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義，其余各濃度普萘洛爾組細胞增殖活性隨普萘洛爾濃度的升高而下降，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；96 h時空白組與DMSO組細胞增殖差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），10、15 mg/L普萘洛爾組較空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而20 mg/L組細胞增殖活性明顯低于空白組（P＜0.05）。

2.不同濃度普萘洛爾對體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細胞 VEGF、VEGF-2、bFGF 水平的影響（表 1）：空白組和DMSO組VEGF、VEGF-2、bFGF水平在24、48 h時差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10、15、20 mg/L 普萘洛爾作用24 h時，各組VEGF含量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；15、20 mg/L普萘洛爾組均較空白組和10 mg/L普萘洛爾組VEGF-2水平下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而 15、20 mg/L普萘洛爾組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10、15、20 mg/L 普萘洛爾組bFGF水平均明顯低于空白組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而這3組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 10、15、20 mg/L普萘洛爾作用24～96 h對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的影響24、48 h時，空白組、二甲基亞砜（DMSO）組與 10、15、20 mg/L 普萘洛爾組血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖無明顯差別，但在72、96 h時各組A值不全相同

表1 普萘洛爾作用血管瘤內(nèi)皮細胞24、48 h后細胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

表1 普萘洛爾作用血管瘤內(nèi)皮細胞24、48 h后細胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

注：n=8。a：與空白組比較，P ＜ 0.05；b：與 10 mg/L 普萘洛爾組比較，P ＜ 0.05

組別24 h 48 h VEGF VEGF-2 bFGF VEGF VEGF-2 bFGF空白組 251.00±44.34 83.82±1.21 10.27±0.34 702.40±91.79 110.50±3.88 14.46±0.30二甲基亞砜組 228.70±12.75 85.14±2.55 11.59±0.49 659.60±95.88 100.60±3.59 14.58±0.32 10 mg/L普萘洛爾組 212.00±38.81 81.90±1.96 5.43±0.63a 621.20±32.08 81.83±3.16a 8.01±0.59a 15 mg/L普萘洛爾組 262.50±134.90 73.65±0.60ab 5.70±0.34a 484.30±53.17a 71.21±0.83ab 7.97±0.61a 20 mg/L普萘洛爾組 211.70±23.79 71.21±2.32ab 5.07±0.22a 535.90±5.36a 69.42±1.37ab 8.02±0.33a F值 1 236.23 872.23 182.11 8 922.34 2 251.22 159.21 P值 ＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

作用48 h時，15、20 mg/L普萘洛爾組VEGF水平均較空白組顯著下降（P＜0.05），而10 mg/L普萘洛爾組VEGF水平與空白組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；10、15、20 mg/L 普萘洛爾組 VEGF-2、bFGF水平均較空白組下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中15、20 mg/L普萘洛爾組較10 mg/L組VEGF-2水平低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3.不同濃度異丙腎上腺素對體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細胞 VEGF、VEGF-2、bFGF 水平的影響（表 2）：5、10、20 mg/L異丙腎上腺素作用于體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細胞24 h時，20 mg/L異丙腎上腺素組較空白組、5 mg/L異丙腎上腺素組VEGF水平升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與10 mg/L異丙腎上腺素組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），空白組與5 mg/L組差異亦無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；5、10、20 mg/L 異丙腎上腺素組VEGF-2水平均較空白組顯著升高（P＜0.05），且VEGF-2水平隨異丙腎上腺素濃度的增加而顯著增加（P＜0.05）；20 mg/L異丙腎上腺素組bFGF水平較空白組、5、10 mg/L異丙腎上腺素組顯著升高（P＜0.05），而后3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

作用 48 h 時，5、10、20 mg/L 異丙腎上腺素組VEGF水平均較空白組顯著升高（P＜0.05），而前3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；20 mg/L異丙腎上腺素組VEGF-2、bFGF水平均顯著高于空白組、5、10 mg/L異丙腎上腺素組（P＜0.05），而后3組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

討 論

普萘洛爾是一種β腎上腺素受體阻斷劑，能夠特異性地阻斷β1和β2腎上腺素受體。臨床上，普萘洛爾常被用于兒童偏頭痛、心律失常、甲狀腺功能亢進以及法洛四聯(lián)癥等疾病的治療。2008年，Léauté-Labrèze發(fā)現(xiàn)普萘洛爾可以治療嬰幼兒血管瘤［8］，但其機制不清。血管瘤中血管內(nèi)皮細胞的異常增殖及消退期凋亡主要認為與局部微環(huán)境的變化（血管形成因子與血管形成抑制因子失衡等）及內(nèi)皮細胞自身的轉(zhuǎn)化有關，其中內(nèi)皮細胞增殖失控的機制成為血管瘤發(fā)病機制研究的一個重要方面，表現(xiàn)為增殖期促進內(nèi)皮細胞增殖、血管形成的因子過度表達，血管形成抑制因子低表達，而后者在消退期高表達。

本研究采用普萘洛爾處理體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細胞，24～48 h各濃度普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細胞無明顯影響，72～96 h低濃度（10、15 mg/L）普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細胞仍無明顯影響，而高濃度（20 mg/L）普萘洛爾明顯抑制血管瘤內(nèi)皮細胞的增殖。細胞形態(tài)學觀察也顯示，20 mg/L普萘洛爾可抑制血管瘤內(nèi)皮細胞的生長。我們前期的研究［19］顯示，β腎上腺素受體激動劑異丙腎上腺素作用血管瘤內(nèi)皮細胞24～72 h內(nèi)，對細胞增殖的影響不大，但在96 h后隨異丙腎上腺素濃度的增高，細胞增殖活性增強，提示異丙腎上腺素對血管瘤內(nèi)皮細胞的生長有促進作用，與普萘洛爾的作用恰恰相反，因此推斷β腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

表2 異丙腎上腺素作用血管瘤內(nèi)皮細胞24、48 h后細胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

表2 異丙腎上腺素作用血管瘤內(nèi)皮細胞24、48 h后細胞培養(yǎng)上清液血管內(nèi)皮細胞生長因子（VEGF、VEGF-2）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）含量（±s，ng/L）

注：n=8。a：與空白組比較，P ＜ 0.05；b：與 5 mg/L 異丙腎上腺素組比較，P ＜ 0.05；c：與 10 mg/L 異丙腎上腺素組比較，P ＜ 0.05

48 h VEGF VEGF-2 bFGF VEGF VEGF-2 bFGF空白組 228.70±12.75 95.82±1.51 11.59±0.49 384.20±98.70 110.50±3.88 14.58±0.32 5 mg/L異丙腎上腺素組 230.70±18.12 97.93±1.96a 11.48±0.25 439.10±87.95a 111.40±4.23 12.95±0.39 10 mg/L異丙腎上腺素組 323.60±19.88 105.40±1.92ab 11.81±0.23 537.30±108.90a 110.70±4.38 13.65±1.01 20 mg/L異丙腎上腺素組 383.70±84.93ab 117.80±2.11abc 19.33±0.33abc 609.60±95.88a 142.50±5.26abc 22.80±1.62abc F值 3 766.56 2 796.21 286.22 8 241.22 2 119.36 273.21 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 24 h組別

目前發(fā)現(xiàn)的一系列促血管生成因子中，VEGF是作用最強的一種。VEGF是一種能促進內(nèi)皮細胞分裂增殖、增加血管通透性的糖蛋白，可與特定的受體即內(nèi)皮細胞生長因子受體（VEGFR）結(jié)合發(fā)揮作用。VEGFR-2與血管瘤的發(fā)生和發(fā)展有非常密切的關系［13］，主要分布于血管內(nèi)皮細胞、淋巴管內(nèi)皮細胞、巨核細胞、造血干細胞等。VEGFR-2與VEGF結(jié)合可促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移，抑制其凋亡，增加血管通透性。bFGF分布廣泛，是強烈的內(nèi)皮細胞和管壁結(jié)締組織的促生長因子，可能是參與血管瘤生長的主要因子，被認為是血管瘤生長的重要標志之一。血管內(nèi)皮細胞和肥大細胞是血管瘤組織中bFGF合成的主要細胞［14］。本研究中普萘洛爾和異丙腎上腺素對于VEGF、VEGF-2、bFGF這3種細胞因子的影響作用相反，即普萘洛爾抑制3種細胞因子的分泌，而異丙腎上腺素則相反，刺激3種細胞因子的分泌，進一步證明了β腎上腺素受體在嬰兒血管瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。

綜上，兩種藥物是通過阻斷或激動β腎上腺素受體，進而影響下游的轉(zhuǎn)導信號，引起級聯(lián)反應，影響血管瘤內(nèi)皮細胞分泌 VEGF、VEGF-2、bFGF，導致細胞增殖、分化，血管形成過程受到影響，呈現(xiàn)兩種藥物對細胞增殖的抑制或促進效應，但是否還存在其他的作用途徑，例如是否對β腎上腺素受體的表達存在影響等，還有待進一步研究。

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In vitroeffects of propranolol and isoproterenol on proliferation of cultured infantile hemangioma endothelial cells and expressions of vascular endothelial growth factors and basic fibroblast growth factor

Zhu Yalin,Hou Wei,Paride Abliz

Department of Dermatology,First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University,Urumqi 830054,China

Objective To evaluatein vitroeffects of propranolol and isoproterenol on proliferation of infantile hemangioma endothelial cells（IHECs）as well as expressions of vascular endothelial growth factors（VEGF and VEGF-2）and human basic fibroblast growth factor（bFGF）.Methods The second-third passage endothelial cells derived from the proliferative phase of infantile hemangioma were divided into propranolol and isoproterenol groups.The propranolol group was further classified into 5 groups to be treated with propranolol solutions at concentrations of 10,15,20 mg/L,EGM-2 medium （blank control group 1）,or EGM-2 medium containing 0.16%DMSO （DMSO group）,while the isoproterenol group was classified into 4 groups to be treated with isoproterenol solutions at concentrations of 5,10,20 mg/L or EGM-2 medium（blank control group 2）.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity in these propranolol groups at 24,48,72 and 96 hours separately,enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）to measure VEGF,VEGF-2 and bFGF levels in culture supernatants of IHECs at 24 and 48 hours separately.Results The proliferative activity of IHECs showed no significant differences between 10-,15-and 20-mg/L propranolol groups at either 24 or 48 hours（H=1.152,2.643,respectively,bothP＞0.05）,or between the blank control group 1,DMSO group,and 10-and 15-mg/L propranolol groups at either 72 or 96 hours,but significantly decreased in the 20-mg/L propranolol group compared with the blank control group 1 at 72 and 96 hours（bothP＜0.05）.The 24-hour treatments with propranolol or isoproterenol at the above concentrations all affected the expressions of VEGF,VEGF-2 and bFGF to different degrees.At 48 hours,there was a significant decrease in VEGF levels in 15-and 20-mg/L propranolol groups,as well as in VEGF-2 and bFGF levels in 10-,15-and 20-mg/L propranolol groups compared with the blank control group 1 （allP＜0.05）,but a significant increase in VEGF levels in 5-,10-and 20-mg/L isoproterenol groups compared with the blank control group 2 （allP ＜ 0.05）,as well as in VEGF-2 and bFGF levels in the 20-mg/L isoproterenol group compared with the blank control group 2,5-and 10-mg/L isoproterenol groups （allP ＜ 0.05）.Conclusions The treatment with propranolol at certain concentrations for certain durations can suppress the growth of,as well as expressions of VEGF,VEGF-2 and bFGF in,endothelial cells derived from the proliferative phase of infantile hemangioma,whereas that with isoproterenol has opposite effects.The therapeutic mechanism of propranolol in infantile hemangioma may be associated with expressions of β-adrenergic receptors and their downstream signal transductionrelated cytokines.

Hemangioma;Endothelial cells;Propranolol;Isoproterenol;Fibroblast growth factor 2;Endothelial growth factors

Paride Abliz,Email:palidae@aliyun.com

帕麗達·阿布利孜，Email：palidae@aliyun.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.03.002

2015-05-25）

（本文編輯：周良佳 顏艷）