富氫液通過自噬途徑下調(diào)中波紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

張秉新 邢衛(wèi)斌 付國俊 陳紅光

300193天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（張秉新）；天津市第五中心醫(yī)院皮膚科（邢衛(wèi)斌）；河北省滄州市人民醫(yī)院皮膚科（付國?。?；天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科（陳紅光）

富氫液通過自噬途徑下調(diào)中波紫外線誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)

張秉新 邢衛(wèi)斌 付國俊 陳紅光

300193天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科（張秉新）；天津市第五中心醫(yī)院皮膚科（邢衛(wèi)斌）；河北省滄州市人民醫(yī)院皮膚科（付國?。惶旖蜥t(yī)科大學(xué)總醫(yī)院麻醉科（陳紅光）

目的 探討氫氣是否能通過自噬途徑調(diào)節(jié)中波紫外線（UVB）誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)。方法 將培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞分為空白對照組（不做任何處理），氫氣組（僅用富氫培養(yǎng)液培養(yǎng)），1、10、50 mJ/cm2UVB 組，1、10、50 mJ/cm2UVB+氫氣組，50 mJ/cm2UVB+3甲基腺嘌呤（3MA）組，50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素組，50 mJ/cm2UVB+3MA+氫氣組，50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素+氫氣組。細(xì)胞經(jīng)過不同處理培養(yǎng)12 h后，噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞增殖，LDH試劑盒檢測乳酸脫氫酶（LDH），細(xì)胞提取蛋白檢測自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)，上清液用ELISA檢測炎癥因子腫瘤壞死因子（TNF）α、白細(xì)胞介素（IL）-1β、HMGB1和IL-6的水平。結(jié)果 與空白對照組相比，UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞LDH釋放增多，細(xì)胞活力下降，自噬蛋白LC3和Beclin1表達(dá)增加，炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6釋放增加（均P＜0.05）。與UVB組相比，氫氣可減少LDH釋放，提高細(xì)胞活力，自噬蛋白LC3和Beclin1表達(dá)進(jìn)一步增加，炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表達(dá)減少（均P＜0.05）。與50 mJ/cm2UVB組相比，50 mJ/cm2UVB+3MA組炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表達(dá)進(jìn)一步增加（P＜0.05），而50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素組炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表達(dá)減少（P＜0.05）。與50 mJ/cm2UVB+氫氣組相比，50 mJ/cm2UVB+氫氣+3MA組炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表達(dá)增加（P＜0.05）。結(jié)論 UVB照射可以誘發(fā)自噬蛋白表達(dá)增加；富氫液可以下調(diào)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)，而這一過程是通過激活自噬途徑實(shí)現(xiàn)的。

紫外線；自噬；炎癥趨化因子類；氫氣；HaCaT細(xì)胞

紫外線照射是引起光線性皮膚病的因素之一，其中以中波紫外線（UVB）對角質(zhì)形成細(xì)胞的影響最大，能誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如，腫瘤壞死因子 α（TNF-α），白細(xì)胞介素（IL）-6，IL-8，iNOS等，引起皮炎及免疫反應(yīng)［1-2］。細(xì)胞自噬是真核生物普遍存在的自穩(wěn)機(jī)制，在細(xì)胞自我保護(hù)和生存等過程中發(fā)揮作用［3］。細(xì)胞自噬不僅可通過調(diào)控炎癥反應(yīng)發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)［3］，還可調(diào)節(jié)UVB引起的人成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞損傷［4-5］。據(jù)報(bào)道，氫氣可以通過抗炎和調(diào)節(jié)自噬作用發(fā)揮對疾病的治療作用［5-6］。因此，本研究探討氫氣是否可減輕UVB引起的HaCaT細(xì)胞釋放的炎癥因子的表達(dá)，這一過程是否通過自噬的調(diào)節(jié)發(fā)揮作用，進(jìn)而明確氫氣治療疾病的相關(guān)機(jī)制。

資料與方法

一、資料

人HaCaT細(xì)胞來源于美國ATCC細(xì)胞庫。胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、噻唑藍(lán)（MTT）（美國 Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所），β肌動蛋白、LC3和Beclin1抗體、山羊抗人辣根過氧化物酶（HPR）標(biāo)記二抗（美國Abcom 公司），TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6試劑盒（美國RD公司）。紫外線光療儀為上海希格瑪高技術(shù)有限公司產(chǎn)品。3甲基腺嘌呤（3MA）購自美國Sigma公司。

二、方法

1.含氫培養(yǎng)液制備：參考文獻(xiàn)［7］方法，在0.5mPa壓力下加壓暴露4 h，使純氫氣溶解于正常含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中并達(dá)到飽和水平，4℃貯存。富氫液新鮮制備，利用氫電極（丹麥Unisense公司）室溫檢測氫濃度為0.6 mmol/L，且飽和濃度至少可存放1周。為了保證穩(wěn)定的氫氣濃度，含氫培養(yǎng)液至少每周配置1次。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組處理：將HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋到1×106個/ml，接種于6孔培養(yǎng)板，置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組為：①空白對照組，不做任何處理；②氫氣組：未經(jīng)UVB照射的細(xì)胞用富氫培養(yǎng)液培養(yǎng)；③1、10、50 mJ/cm2UVB組：分別用1、10、50 mJ/cm2UVB 照射細(xì)胞；④1、10、50 mJ/cm2UVB+氫氣組：分別用1、10、50 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞+富氫培養(yǎng)液培養(yǎng)；⑤UVB+3MA組：50 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞+3MA（自噬抑制劑）；⑥UVB+雷帕霉素組：50 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞+雷帕霉素（自噬激活劑）；⑦UVB+3MA+氫氣組：50 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞+3MA+富氫培養(yǎng)液培養(yǎng)；⑧UVB+雷帕霉素+氫氣組：50 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞+雷帕霉素+富氫培養(yǎng)液培養(yǎng)。

［8］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，3MA和雷帕霉素（濃度分別為1 mmol/L、0.1 μmol/L）在UVB照射前1 h加入培養(yǎng)基。UVB照射前將培養(yǎng)基吸去，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，加入薄層PBS，以剛好覆蓋細(xì)胞為度。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用1、10、50 mJ/cm2照射劑量分別照射30 s，照射時細(xì)胞與光源間的照射距離為15 cm。照射后立即棄去上覆的PBS，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h，進(jìn)行相關(guān)檢測。

3.LDH檢測：各組細(xì)胞經(jīng)過不同處理并培養(yǎng)12h后，根據(jù)LDH試劑盒說明檢測LDH釋放水平。

4.MTT法檢測細(xì)胞增殖：各組細(xì)胞經(jīng)過不同處理并培養(yǎng)12 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃孵育4 h后棄去上清液，加入200 μl二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩15 min，用酶標(biāo)儀（美國Clinibi公司）選擇490 nm波長測定每孔細(xì)胞的吸光度值（A值），觀察HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞活力變化。

5.Western印跡法檢測自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)：按照上述實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞，留取蛋白，用蛋白酶抑制劑裂解蛋白，收集后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。將蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳1 h，行PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)1 h，血清封閉2 h，加入一抗β肌動蛋白（稀釋度1∶1 000），LC3或Beclin1（稀釋度1∶500）4℃過夜，洗膜，加入二抗HRP（稀釋度1∶5 000）孵育2 h，然后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯像，以目的蛋白條帶積分吸光度值與β肌動蛋白條帶積分吸光度值的比值反映目的蛋白表達(dá)水平。

6.ELISA 檢測炎癥因子 TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6的水平：細(xì)胞按照上述實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)12 h后，收集標(biāo)本，離心取上清液，根據(jù)炎癥因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6檢測試劑盒說明書，采用用ELISA 法檢測 TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6的表達(dá)水平。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：用SPSS18.0軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、氫氣對不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞的LDH和細(xì)胞增殖的影響

與空白對照組相比，低劑量UVB對細(xì)胞無明顯影響（P＞0.05），而 10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB 可明顯誘發(fā)細(xì)胞損傷，LDH增多、細(xì)胞活力降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性變化。給予富氫液處理低劑量UVB照射的細(xì)胞后，與1 mJ/cm2UVB組相比，LDH和MTT無明顯變化（P＞0.05）；給予富氫液處理10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB照射的細(xì)胞后，與同劑量UVB組相比，細(xì)胞LDH釋放減少，細(xì)胞活力增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 氫氣對不同劑量UVB照射的HaCaT細(xì)胞LDH和細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 氫氣對不同劑量UVB照射的HaCaT細(xì)胞LDH和細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：n=6。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與 10 mJ/cm2UVB 組比較，P＜0.05；c：與50 mJ/cm2UVB組比較，P＜0.05

組別 乳酸脫氫酶（%） 噻唑藍(lán)（A值）空白對照組 100±0 1.823±0.073氫氣 98.2±6.1 1.812±0.148 1 mJ/cm2UVB 112.6±11.3 1.721±0.127 10 mJ/cm2UVB 148.5±13.6a 0.984±0.091a 50 mJ/cm2UVB 199.9±16.5a 0.826±0.082a 1 mJ/cm2UVB+氫氣 104.4±10.8 1.791±0.131 10 mJ/cm2UVB+氫氣 122.2±13.8b 1.327±0.107b 50 mJ/cm2UVB+氫氣 164.6±14.3c 1.118±0.087c F值 75.11 114.8 P值＜0.01＜0.01

二、氫氣對不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的影響

與空白對照組相比，1 mJ/cm2UVB雖可引起HaCaT細(xì)胞自噬蛋白LC3和Beclin1輕微升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB可明顯誘發(fā)自噬蛋白LC3和Beclin1表達(dá)呈劑量依賴性增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。給予富氫液處理并經(jīng)不同劑量UVB照射后，與相同劑量UVB組相比，1 mJ/cm2組兩蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB 組自噬蛋白LC3和Beclin1表達(dá)進(jìn)一步增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2，圖 1。

表2 氫氣對不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的影響（±s）

表2 氫氣對不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的影響（±s）

注：n=6。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與 10 MJ/CM2UVB組比較，P＜0.05；c：與50 mJ/cm2UVB組比較，P＜0.05

組別 LC3 Beclin1空白對照組 0.112±0.011 0.109±0.013氫氣 0.123±0.013 0.113±0.011 1 mJ/cm2UVB 0.236±0.034 0.175±0.015 10 mJ/cm2UVB 0.421±0.061a 0.252±0.026a 50 mJ/cm2UVB 0.447±0.073a 0.336±0.031a 1 mJ/cm2UVB+氫氣 0.316±0.032 0.172±0.016 10 mJ/cm2UVB+氫氣 0.686±0.067b 0.361±0.032b 50 mJ/cm2UVB+氫氣 0.702±0.094c 0.419±0.040c F值 121.0 178.3 P值＜0.01＜0.01

圖1 Western印跡法檢測氫氣對不同劑量UVB照射HaCaT細(xì)胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá) 與空白對照組相比，10、50 mJ/cm2UVB可明顯誘發(fā)自噬蛋白LC3和Beclin1表達(dá)呈劑量依賴性增加。給予富氫液處理并經(jīng)不同劑量UVB照射后，與相同劑量UVB組相比，自噬蛋白LC3和Beclin1表達(dá)進(jìn)一步增加。1：空白對照組；2：空白對照組 + 氫氣；3：UVB1；4：UVB2；5：UVB3；6：UVB1+氫氣；7：UVB2+氫氣；8：UVB3+氫氣

三、富氫液通過自噬途徑對UVB照射的HaCaT細(xì)胞炎癥因子的影響

與空白對照組相比，50 mJ/cm2UVB組細(xì)胞炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和HMGB1 釋放明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與50 mJ/cm2UVB組相比，50 mJ/cm2UVB+氫氣組炎癥因子顯著降低，50 mJ/cm2UVB+3MA組各炎癥因子顯著增加，而50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素組則反之，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與50 mJ/cm2UVB+氫氣組相比，50 mJ/cm2UVB+氫氣+3MA組炎癥因子增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），說明3MA翻轉(zhuǎn)了富氫液對UVB照射細(xì)胞的炎癥因子過量釋放的抑制作用。此外，與50 mJ/cm2UVB+氫氣組相比，50 mJ/cm2UVB+氫氣+雷帕霉素組炎癥因子降低。見表3。

表3 氫氣對UVB照射HaCaT細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)變化（±s）

表3 氫氣對UVB照射HaCaT細(xì)胞的炎癥因子的表達(dá)變化（±s）

注：n=6。a：與空白對照組比較，P＜0.05；b：與 50 mJ/cm2UVB 組比較，P＜0.05；c：與 50 mJ/cm2UVB+ 氫氣組比較，P＜0.05

組別 TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L） IL-6（ng/L） HMGB1（μg/L）空白對照組 143.6±15.7 87.6±12.7 57.6±6.3 2.1±0.3 50 mJ/cm2UVB 985.4±89.3a 748.4±88.2a 461.4±53.5a 24.6±2.4a 50 mJ/cm2UVB+3MA 1344.4±121.7b 937.5±101.6b 537.7±49.9b 33.5±2.9b 50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素 682.1±57.8b 471.9±37.6b 248.5±31.1b 15.6±2.1b 50 mJ/cm2UVB+氫氣 593.7±49.1b 411.8±39.9b 262.4±33.2b 13.8±2.0b 50 mJ/cm2UVB+氫氣+3MA 1011.1±111.7c 785.0±89.9c 488.9±51.8c 26.3±2.5c 50 mJ/cm2UVB+氫氣+雷帕霉素 435.3±41.5 348.9±33.1 222.4±25.3 11.8±1.4 F值 209.1 160.5 157.9 201.6 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

討 論

造成皮膚光損傷的紫外線主要為UVB，由角質(zhì)形成細(xì)胞所組成的表皮層是UVB損傷的靶組織，且UVB照射可導(dǎo)致皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖能力下降［7，9］。本實(shí)驗(yàn)通過給予不同劑量的UVB照射HaCaT細(xì)胞后，出現(xiàn)細(xì)胞損傷，LDH釋放增加，細(xì)胞活力降低，且隨著照射劑量的增加，細(xì)胞損傷和細(xì)胞活力下降增加。紫外線還可通過炎癥損傷調(diào)控皮膚的形態(tài)和功能，可誘發(fā)細(xì)胞核和線粒體DNA損傷，并產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子，如IL-1、IL-6等，從而引起細(xì)胞的損傷與修復(fù)功能異常，誘發(fā)皮膚紅斑、老化、光敏性疾病、異常的DNA合成、DNA損傷、免疫抑制等［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，UVB照射可通過增加炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的過量釋放引起HaCaT細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

自噬是清除損傷蛋白和細(xì)胞器的有效形式［11］。研究表明，細(xì)胞可通過激活自噬來抵抗炎癥［12］。LC3參與自噬體的形成，它的多少與自噬小泡數(shù)量成正比，所以LC3的表達(dá)可以反應(yīng)自噬的活性［13］。Beclin1是參與自噬調(diào)控的重要基因，通過與ClassIII/PI3K形成復(fù)合物參與自噬體的形成［14］。本研究中，對HaCaT細(xì)胞系進(jìn)行不同劑量UVB照射，結(jié)果顯示，UVB照射HaCaT細(xì)胞可誘發(fā)自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)，且呈劑量依賴性增加。在進(jìn)一步應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素和抑制劑3MA的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自噬的誘發(fā)可以減少UVB導(dǎo)致的HaCaT細(xì)胞炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的過量釋放，而自噬的抑制則進(jìn)一步增加UVB照射的HaCaT 細(xì) 胞 炎 癥 因 子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和HMGB1的釋放水平，提示通過自噬途徑可調(diào)節(jié)UVB照射的HaCaT細(xì)胞炎癥因子的釋放。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，氫氣通過抗炎等作用發(fā)揮對疾病的治療作用。氫氣及富氫液通過抗炎反應(yīng)、抗氧化和抗凋亡等作用，可減輕小鼠變應(yīng)性皮炎炎癥因子 TNF-α、IL-6、IL-17 和INF-γ 的釋放［7］等。本研究中，氫氣可以降低UVB照射的HaCaT細(xì)胞炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1 的釋放。此外，氫氣還可以增加UVB照射的HaCaT細(xì)胞自噬蛋白LC3和Beclin1的表達(dá)。本文結(jié)果顯示，通過給予UVB照射的HaCaT細(xì)胞雷帕霉素和富氫液處理，細(xì)胞炎癥因子的釋放減少，而給予UVB照射的細(xì)胞3MA和富氫液處理，細(xì)胞的炎癥因子仍舊增加，表明3MA逆轉(zhuǎn)了富氫液對UVB照射HaCaT細(xì)胞的抑制炎癥因子釋放的作用。氫氣可能通過激活自噬，使UVB照射的細(xì)胞經(jīng)過自噬途徑裂解，裂解后細(xì)胞內(nèi)容物釋放并為新細(xì)胞的合成提供原料，而UVB導(dǎo)致的炎癥因子釋放也將隨著細(xì)胞的裂解而減少或終止?？梢姎錃馔ㄟ^自噬蛋白的表達(dá)來反映自噬的激活，為細(xì)胞或組織正常生長提供重要的保障。

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Hydrogen-rich liquid down-regulates the expressions of inflammatory factors by ultraviolet B-induced human HaCaT keratinocytes through the autophagy pathway

Zhang Bingxin,Xing Weibin,Fu Guojun,Chen Hongguang
Department of Dermatology,First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China（Zhang BX）;Department of Dermatology,Tianjin Fifth Centre Hospital,Tianjin 300450,China（Xing WB）;Department of Dermatology,Cangzhou People′s Hospital,Cangzhou 061000,Hebei,China（Fu GJ）;Department of Anesthesiology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China（Chen HG）

ObjectiveTo investigate whether hydrogen can regulate the expressions of inflammatory factors by ultraviolet B （UVB）-induced human HaCaT keratinocytes through the autophagy pathway.MethodsCultured HaCaT keratinocytes were divided into several groups：blank control group receiving no treatment,hydrogen group cultured in hydrogen-rich medium,three UVB groups irradiated with UVB at 1,10,50 mJ/cm2respectively,three UVB+hydrogen groups irradiated with UVB at 1,10,50 mJ/cm2respectively followed by culture in hydrogen-rich medium,UVB+3MA group pretreated with the autophagy inhibitor 3MA for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2,UVB+rapamycin group pretreated with the autophagy activator rapamycin for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2,UVB+3MA+hydrogen group pretreated with 3MA for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2and culture in hydrogen-rich medium,UVB+rapamycin+hydrogen group pretreated with rapamycin for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2and culture in hydrogen-rich medium.After additional culture with or without hydrogen for 12 hours,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,Western-blot analysis to measure the expressions of autophagy-associated protein 1 light chain 3（LC3）and Beclin1,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to measure the supernatant levels of inflammatory factors including tumor necrosis factor （TNF）-α,interleukin（IL）-1β,IL-6 and high mobility group protein B1 （HMGB1）,and a test kit was used to determine the level of lactate dehydrogenase（LDH）.ResultsCompared with the blank control group,the 10-and 50-mJ/cm2UVB groups showed significantly increased release of LDH,expressions of LC3 and Beclin1 and supernatant levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and HMGB1,but decreased cellular proliferative activity（allP＜0.05）.Hydrogen significantly attenuated the release of LDH,down-regulated the supernatant levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and HMGB1,but up-regulated cellular proliferative activity as well as LC3 and Beclin1 expressions in the 10-and 50-mJ/cm2UVB+hydrogen groups compared with the 10-and 50-mJ/cm2UVB groups respectively （allP＜0.05）.In addition,the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and HMGB1 were significantly higher in the 50-mJ/cm2UVB+3MA group than in the 50-mJ/cm2UVB group,and higher in the 50-mJ/cm2UVB+3MA+hydrogen group than in the 50-mJ/cm2UVB+hydrogen group,but lower in the 50-mJ/cm2UVB+rapamycin groupthaninthe50-mJ/cm2UVBgroup（allP＜0.05）.ConclusionUVBradiationcanincreasetheexpressionsofautophagyassociated proteins,and hydrogen-rich medium can down-regulate the expressions of inflammatory factors by UVB-induced HaCaT cells through the autophagy pathway.

Ultraviolet rays;Autophagy;Chemokines;Hydrogen;HaCaT cells

Xing Weibin,Email：xingweibin111@163.com

2015-04-20）

（本文編輯：吳曉初）

邢衛(wèi)斌，Email：xingweibin111@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.010

國家自然科學(xué)基金（81101409、81471842）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81101409,81471842）