高效液相色譜法測定補腦安神片中二苯乙烯苷含量

王紅，楊慈海，宋軍

（1.湖北省荊州市婦幼保健院，湖北荊州434020；2.湖北省荊門市食品藥品監(jiān)督檢驗所，湖北荊門448124）

高效液相色譜法測定補腦安神片中二苯乙烯苷含量

王紅1，楊慈海2，宋軍2

（1.湖北省荊州市婦幼保健院，湖北荊州434020；2.湖北省荊門市食品藥品監(jiān)督檢驗所，湖北荊門448124）

目的建立測定補腦安神片中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O- -D-葡萄糖苷含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法色譜柱為Lichrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動相為乙腈-水（20∶80），流速為1 mL/min，檢測波長為320 nm。結(jié)果2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O- -D-葡萄糖苷進樣量在0.209 2～3.347 2 g范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好（r=0.999 9），平均回收率為98.89%，RSD=0.76%（n=6）。結(jié)論該方法簡便、準(zhǔn)確，可用于補腦安神片中制何首烏的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；補腦安神片；二苯乙烯苷；含量測定

補腦安神片由當(dāng)歸、制何首烏、女貞子、酸棗仁（生、炒各半）、黃精（蒸）、茯苓、合歡皮、墨旱蓮、朱砂、遠志、桑葉等11味中藥精制而成，具有補肝益腎，養(yǎng)血安神的功效，用于肝腎不足所致頭痛眩暈、心悸不寧、失眠多夢、健忘。國家藥品標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀和顯微鑒別，無含量測定項［1］。補腦安神片方中，何首烏有增強免疫和保肝護腎的作用［2］，為君藥?，F(xiàn)代藥理研究表明，其主要有效成分二苯乙烯苷具有抗氧化及清除自由基、抗興奮性毒性、調(diào)節(jié)Bcl-2蛋白及海馬基因表達等多種功效，能直接或間接發(fā)揮腦保護作用［3-4］。本研究中參照2010年版《中國藥典（一部）》及文獻［5-10］，對處方中制何首烏中所含有效成分2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷采用高效液相色譜（HPLC）法進行了含量測定，效果好，方法簡單可行，可作為提高該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的參考依據(jù)。

1　儀器與試藥

Ultimate 3000型高效液相色譜儀、Ultimate 3000 Diode Array Detector型紫外檢測器及Chromeleon色譜工作站（美國Dionex公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）；AS20500A型超聲波清洗器（天津奧特賽恩儀器有限公司）。2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110844-200607，供含量測定用，含量為100.00%）；補腦安神片（武漢鈞安制藥有限公司，批號分別為141101，141201，150202）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Lichrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；預(yù)柱C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（20∶80）；流速：1 mL/min；檢測波長：320 nm；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于2 000［5］，分離度大于1.5。

2.2溶液制備

對照品溶液：精密稱取置五氧化二磷減壓干燥器中干燥24 h的2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品10.46 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇約30 mL，超聲5 min使溶解，冷卻，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（0.209 2 mg/mL）。

供試品溶液：取本品20片，除去糖衣，精密稱定6.231 8 g，平均片重0.311 6 g，研細，稱取0.646 0 g，置錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，水浴加熱回流30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液備用（在8 h內(nèi)使用）。

陰性對照品溶液：按處方比例取除制何首烏以外的其他藥材，以相同工藝制備，按供試品溶液制備方法制備缺制何首烏陰性對照溶液。

2.3方法學(xué)考察

專屬性試驗：分別取2.2項下3種溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液相應(yīng)位置上，有相同保留時間的色譜峰，陰性對照無干擾。見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對照品溶液1，2，4，8，16 μL注入高效液相色譜儀，測定峰面積積分值，以進樣量（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程：Y=414 519 X+53 151，r= 0.999 9。結(jié)果表明，2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷進樣量在0.209 2～3.347 2 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μL，重復(fù)進樣5次，測定峰面積。結(jié)果峰面積的RSD=0.95%（n=5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：精密吸取同一批（批號為150202）供試品溶液，分別于0，2，4，6，8 h時進樣，測定峰面積。結(jié)果峰面積的RSD=1.27%（n=5），表明供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取同一批（批號為150202）樣品粉末適量，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂方法測定。結(jié)果平均含量為2.33.0 mg/g，RSD=1.33%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的同一批（批號為150202，含量為2.330 mg/g）樣品粉末約0.35 g，平行取6份，精密稱定，分別精密加入2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液（0.209 2 mg/mL）各3，3，4，4，5，5 mL，依法制備溶液并進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

圖1　高效液相色譜圖

表1　加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4樣品含量測定

取市售補腦安神片3批，依法制備供試品溶液，分別精密量取供試品溶液與對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，按外標(biāo)法計算供試品溶液中2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。結(jié)果見表2。

3　討論

3.1指標(biāo)成分選擇

方中共11味中藥，因制何首烏在處方中屬君藥，且用量大，其有效成分清楚，常作為含量測定對象，制何首烏中主要有效成分為2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷和蒽醌類化合物，2010年版《中國藥典（一部）》規(guī)定蒽醌類化合物不得少于0.1%，因含量較低，測定結(jié)果差異大，相對誤差也較大，不好掌握，而2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量高，2010年版《中國藥典（一部）》規(guī)定不少于0.7%［5］，且性質(zhì)穩(wěn)定，故選擇2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷作為測定的考察指標(biāo)。

表2　補腦安神片中二苯乙烯苷的含量測定結(jié)果（mg/片，n=3）

3.2提取溶劑選擇

2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為水溶性成分［9］，是20碳化合物，分子量較大，用甲醇和稀乙醇作為溶劑提取較好，因補腦安神片的制備過程中有3味是原藥材入藥，7味是用水煮提取濃縮綢膏入藥，1味是70%乙醇滲漉液回收乙醇后入藥，成藥中含有較多淀粉和其他水溶性物質(zhì)，特別是方中茯苓以原藥材入藥，含較高的β-茯苓聚糖，易溶于水，用稀乙醇提取易產(chǎn)生混濁，很難過濾，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，用甲醇可避免淀粉溶解，糖類成分溶解也較少，提取液澄清，易過濾，又能很好地將2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷溶解出來，故選擇甲醇作提取溶劑。

3.3提取方法選擇

制何首烏用的是飲片原藥入藥，未事先水煮提取，經(jīng)過對提取方法的考察，結(jié)果表明，超聲提取和加熱回流提取存在較大差異性，故選擇加熱回流提取，且回流時間30 min以上可提取完全。

3.4流動相選擇

［5］，采用乙腈-水（25∶75）為2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷流動相，樣品主峰出峰快，6 min即可出峰，但樣品與雜質(zhì)峰未達到完全分離，不斷改變流動相比例，增加水相比例，當(dāng)乙腈-水（20∶80）為流動相時，樣品與雜質(zhì)完全分離，且2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的保留時間為10.16 min，時間較好，分離效果也好，故確定乙腈-水（20∶80）為流動相。

3.5檢測波長選擇

取2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品溶液（0.209 2 mg/mL）在250～450 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在（320±1）nm波長處有最大吸收，因320 nm是中紫外區(qū)，有穩(wěn)定的吸收，且基線平穩(wěn)，因此參照2010年版《中國藥典（一部）》［5］選擇320 nm作為檢測波長。

目前，國內(nèi)HPLC法測定2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷已有廣泛應(yīng)用和報道［6-10］，也有用紫外光譜（UV）法測定2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的報道，因本處方有11味藥材入藥，很難提取分離純化的2，3，5，4’-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的樣品溶液，而HPLC法可達到較好分離，且快捷、簡便、易行，可為提高質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。

［1］WS3-B-2335-97，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第十二冊）［S］.

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Determination of the Content of 2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside in Bunao Anshen Tablets by HPLC

Wang Hong1，Yang Cihai2，Song Jun2
（1.Jingzhou Maternal and Child Health Care，Jingzhou，Hubei，China434020；2.Jingmen Institute for Food and Drug Control，Jingmen，Hubei，China448124）

ObjectiveTo establish an high-performance liquid chromatography method for the content determination of 2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside in Bunao Anshen Tablets.M ethodsSeparation was achieved on a Lichrom C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm）with acetonitrile-water（20∶80）as mobile phase；the detection wavelength was 320 nm；the flow rate was 1 mL/min.ResultsThere was a good linear relationship（r=0.999 9）at the concentration range of 0.209 2-3.347 2 μg for2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside.Themeanrecoverywas98.89%withRSD=0.76%（n=6）. ConclusionThe method is simple and accurate.It can be used for the quality control of Bunao Anshen Tablets.

HPLC method；Bunao Anshen Tablets；2，3，5，4’-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glucoside；content determination

R284．1；R286．0

A

1006－4931（2016）16－0072－03

王紅（1967-），女，大學(xué)本科，副主任藥師，主要從事醫(yī)院藥學(xué)工作，（電子信箱）jzwh1967@ 163.com；楊慈海（1965-），男，大學(xué)本科，主任藥師，研究方向為藥物分析，本文通訊作者，（電話）0724-8885050（電子信箱）1447558970@qq.com。

（2016－03－18；

2016－05－13）