六堡茶總黃酮對老齡小鼠抗氧化功能的影響

宋家樂，周燕園，趙超超，李雪梅，鄭妍菲

（1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，預防醫(yī)學研究所，廣西桂林541100；2.韓國國立釜山大學食品科學與營養(yǎng)學科，釜山609-735；3.解放軍153中心醫(yī)院營養(yǎng)科，河南鄭州450042）

六堡茶總黃酮對老齡小鼠抗氧化功能的影響

宋家樂1，2，周燕園1，趙超超1，李雪梅2，鄭妍菲3

（1.桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，預防醫(yī)學研究所，廣西桂林541100；2.韓國國立釜山大學食品科學與營養(yǎng)學科，釜山609-735；3.解放軍153中心醫(yī)院營養(yǎng)科，河南鄭州450042）

探討六堡茶總黃酮提取物對老齡ICR小鼠抗氧化功能的影響。分別給予老齡ICR小鼠不同劑量的六堡茶總黃酮提取物30d后。依試劑盒說明書分別測定其血清中總抗氧化能力（T-AOC），主要臟器（腦、心臟和肝臟）和血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（catalase，CAT），谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSHPx），以及氧化損傷標志物丙二醛（malondiadehycle，MDA）的水平。六堡茶總黃酮提取物能顯著提高老齡小鼠血清TAOC能力，提高血清和臟器組織內(nèi)SOD、CAT和GSH-Px活性，同時降低血清和臟器組織內(nèi)MDA的水平（P＜0.05）并呈劑量依存效應關系。本研究結(jié)果提示六堡茶總黃酮提取物能明顯提高老齡小鼠體內(nèi)的抗氧化狀態(tài)。

六堡茶；總黃酮；抗氧化功能；老齡小鼠

機體自身抗氧化能力的降低是伴隨衰老發(fā)生的重要事件，同時也是各種退行性疾病的主要誘因之一。機體在正常生理條件下能夠通過由過氧化氫酶（catalase，CAT），超氧化物歧化酶（superoxide dismu－tase，SOD）和谷胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）所構(gòu)筑的內(nèi)源性抗氧化酶防御系統(tǒng)來對抗氧化損傷導致的應激損傷，延緩機體衰老，并預防各類慢病的發(fā)生發(fā)展［1-2］。

我國是茶葉種植大國，茶制品種類豐富，而傳統(tǒng)意義上茶葉又是一類健康保健食品［3］。其中，具有1 500多年歷史的六堡茶是原產(chǎn)于我國廣西梧州地區(qū)的一種傳統(tǒng)后發(fā)酵緊壓型黑茶制品［4］。因其獨具檳榔香味和“紅、濃、陳、醇”等特殊品性，深受兩廣、港澳臺地區(qū)和東南亞當?shù)厝嗣裣矏郏?］。研究表明六堡茶具有較好的體外抗氧化［6］和降血脂［7］能力，能提高小鼠免疫力［8-9］，降低3T3-L1脂肪細胞發(fā)生胰島素抵抗［10］，并具有改善小鼠高血脂癥及抗凝血能力［11］。此外，六堡茶還是一種富含礦物質(zhì)［12］的安全發(fā)酵茶制品［13］。因此，本文旨在通過給予老齡小鼠一定劑量的六堡茶總黃酮提取物，通過觀察其對實驗動物體內(nèi)抗氧化狀態(tài)的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

六堡茶：購自廣西梧州六堡茶廠（生產(chǎn)年份：2014年8月）。

1.1.2試劑

乙醇：國藥集團化學試劑有限公司；商用總抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）測定試劑盒：美國Cayman公司；其他化學試劑均為分析純。

1.1.3實驗動物

老齡ICR小鼠（雄性，12月齡，體重43 g±3 g）由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，并置于桂林醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院動物房飼養(yǎng)。

1.2儀器與設備

EYELA N-1001S真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：日本東京理化器械株式會社；Combi-514R冷凍離心機：韓國Hanil株式會社；Bio-Rad 680酶標儀：美國Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1六堡茶總黃酮的制備

參考羅艷等［14］報告的方法，取100 g經(jīng)冷凍干燥后的六堡茶粉碎品，依照料液比1∶25（g/mL）比例，以60%的乙醇溶液為提取試劑，混合提取3次，每次提取1.5 h。提取完畢后，合并所有提取液，以4 000 r/min的速度離心20 min以收集上清液。低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)制備得六堡茶總黃酮提取物，抽真空包裝并置于-80℃條件下保管待用。經(jīng)三氯化鋁比色法測定六堡茶提取物中總黃酮含量為3.57%。

1.3.2動物分組

所有40只小鼠經(jīng)一周馴養(yǎng)后，稱量體重并按照每組10只隨機分為對照組和六堡茶總黃酮提取物低、中、高劑量組。

1.3.3給藥方法

實驗動物按照低劑量組10 mg/kg、中劑量組50 mg/kg和高劑量組100 mg/kg每日1次，連續(xù)灌胃30 d，對照組以等量生理鹽水代替。第31天用CO2安樂死處死所有實驗小鼠。本實驗經(jīng)桂林醫(yī)學院動物實驗倫理審查委員會審查通過，并嚴格按照美國國立健康研究院（NIH）實驗動物健康管理規(guī)定執(zhí)行。

1.3.4血清和組織中抗氧化指標的測定

所有安樂死后的實驗小鼠自腹部中央靜脈處取血。血樣4℃過夜放置后，以3 500 r/min速度在4℃條件下離心15 min制備血清。取血后，摘取實驗動物的腦，心臟和肝臟并用冷生理食鹽水洗去血污，以適量濃度為0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液于冰上制備各組織的勻漿液。按試劑盒說明分別測定血清和組織內(nèi)抗氧化酶的活性。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學分析

所有實驗均重復3次，數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學分析。用單因素方差分析（ANOVA）進行多組之間均數(shù)的差異性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2　結(jié)果與討論

2.1六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠體重以及一般狀態(tài)的影響

整個實驗期間，各組小鼠的發(fā)育狀況良好，未發(fā)現(xiàn)實驗動物死亡。經(jīng)六堡茶總黃酮30 d給藥處理后的小鼠體重和主要臟器（腦、心臟和肝臟）的質(zhì)量與對照組小鼠相比變化差異不明顯，無統(tǒng)計學意義。

2.2六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠血清抗氧化能力的影響

衰老與機體內(nèi)部各種物質(zhì)代謝功能的障礙和酶類或非酶類抗氧化物質(zhì)的逐步缺乏存在著極大的聯(lián)系。其中，自由基所引起的過氧化反應是誘發(fā)機體氧化應激損傷所致衰老的主要原因之一［14］。高活性的自由基能直接攻擊生物體細胞膜內(nèi)不飽和脂肪酸并引起其過氧化反應，造成機體內(nèi)部丙二醛（MDA）和4-羥基壬烯醛（4-HNE）等毒性過氧化物產(chǎn)物的大量生成。MDA和4-HNE可通過改變細胞生物膜的組分，引起細胞自溶；通過影響細胞內(nèi)核糖體的正常機能造成細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成障礙；并能通過誘發(fā)DNA等遺傳物質(zhì)突變，造成細胞異常分裂和癌變，最后導致細胞衰老并引發(fā)疾病。因此，增強機體內(nèi)源性抗氧化物酶系統(tǒng)的活性可助于機體對抗氧化應激損傷并能延緩衰老進程［15］。六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠血清抗氧化能力的影響見表1。

如表1所示，給予不同劑量的六堡茶總黃酮提取物30 d后，各組小鼠血清中總抗氧化T-AOC水平與對照組相比呈顯著升高趨勢，并具統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。特別是高劑量處理組小鼠血清SOD，CAT和GSH-Px的水平分別較對照組顯著上升。此外，六堡茶總黃酮還能顯著降低各組老齡小鼠血清MDA水準。與對照組相比，經(jīng)高劑量六堡茶總黃酮（100 mg/kg）處理后的老齡小鼠血清中的MDA生成量降低約39%。

表1　六堡茶總黃酮對老齡小鼠血清中T-AOC，SOD，CAT，GSH-Px和MDA水平的影響Table 1Effect of Liubao tea total flavonoid on serum levels of T-AOC，SOD，CAT and GSH-Px in aged mice

2.3六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠腦組織中抗氧化能力的影響

六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠腦組織中抗氧化能力的影響見表2。

表2　六堡茶總黃酮對老齡小鼠腦組織中SOD，CAT，GSH-Px和MDA水平的影響Table 2Effect of Liubao tea total flavonoid on brain levels of SOD，CAT，GSH-Px and MDA in aged mice

如表2所示，在給予不同劑量六堡茶總黃酮提取物處理30 d后，各組小鼠腦中主要抗氧化酶的活性與對照組比較呈顯著升高趨勢，并具統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。特別是高劑量處理組小鼠腦組織中SOD，CAT和GSH-Px的水平分別較對照組小鼠腦組織中SOD，CAT和GSH-Px的水平增加顯著。高劑量六堡茶總黃酮處理組小鼠腦內(nèi)的MDA的含量與對照組小鼠相比顯著降低41%（P＜0.05）。

2.4六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠心臟組織內(nèi)抗氧化能力的影響

六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠心臟組織內(nèi)抗氧化能力的影響見表3。

表3　六堡茶總黃酮對老齡小鼠心臟組織內(nèi)SOD，CAT，GSH-Px和MDA水平的影響Table 3Effect of Liubao tea total flavonoid on heart levels of SOD，CAT，GSH-Px and MDA in aged mice

如表3示，經(jīng)不同劑量六堡茶總黃酮提取物處理30 d后，各組老齡小鼠心臟組織內(nèi)3種主要抗氧化酶的活性與對照組比較呈顯著升高趨勢，并具統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。與對照組小鼠相比，高劑量六堡茶總黃酮能較對照組分別提高小鼠心臟組織內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px的活性水平增加顯著。此外，高劑量的六堡茶總黃酮還能顯著降低老齡小鼠心臟組織內(nèi)約29%的MDA生成量。

2.5六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠肝臟組織內(nèi)抗氧化能力的影響

六堡茶總黃酮提取物對老齡小鼠肝臟組織內(nèi)抗氧化能力的影響見表4。

表4　六堡茶總黃酮對老齡小鼠肝臟組織中SOD，CAT，GSH-Px和MDA水平的影響Table 4Effect of Liubao tea total flavonoid on liver levels of SOD，CAT，GSH-Px and MDA in aged mice

各組小鼠經(jīng)30 d不同劑量六堡茶總黃酮提取物處理后，其肝臟組織內(nèi)3種主要抗氧化酶的活性與對照組相比呈顯著升高趨勢，并具統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。高劑量六堡茶總黃酮能顯著提高老齡小鼠肝臟組織內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px的活性，并顯著降低老齡小鼠肝臟組織內(nèi)MDA的生成。而該實驗結(jié)果與陳雪等報道的六堡茶水提取物能提高D-半乳糖誘發(fā)的衰老小鼠肝組內(nèi)SOD和CAT抗氧化酶活性的結(jié)果較為一致［15］。此外，與六堡茶同屬于緊壓型后發(fā)酵黑茶的湖南茯磚茶能夠通過提高細胞內(nèi)SOD，CAT和GSH-Px等抗氧化酶系的活性，來抑制H2O2對豬腎上皮LLCPK1細胞造成的氧化應激損傷［16］。

3　結(jié)論

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)六堡茶總黃酮能有效地提高自然衰老小鼠體內(nèi)血清T-AOC能力，通過提高心、肝、腦等身體主要臟器中的SOD，CAT，GSH-Px 3種主要抗氧化物酶的活性，從而降低血清以及主要內(nèi)臟器官內(nèi)氧化損傷標志物MDA的含量，抑制了衰老過程中氧化損傷的發(fā)生。結(jié)果提示六堡茶總黃酮可能主要通過提高老齡小鼠體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)活性來對抗自然衰老。而本研究為六堡茶作為具有抗氧化、抗衰老能力的保健食品提供了一定的科學研究依據(jù)。

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Effect of Liubao Tea Total Flavonoid on Antioxidant Function in Aged Mice

SONG Jia-le1，2，ZHOU Yan-yuan1，ZHAO Chao-chao1，LI Xue-mei2，ZHENG Yan-fei3
（1.School of Public Health，Institute of Preventive Medicine，Guilin Medical University，Guilin 541100，Guangxi，China；2.Department of Food Science and Nutrition，Pusan National University，Busan 609-735，South Korea；3.Department of Nutrition，the 153rd Central Hospital of People's Liberation Army，Zhengzhou 450042，Henan，China）

To investigate the effect of Liubao tea total flavonoid（LBTFE）on the antioxidant function in aged ICR mice.The aged ICR mice were administrated with various dose of LBTFE for 30 days.The levels of total antioxidant capacity（T-AOC）in serum，and levels of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathione peroxidase（GSH-Px），as well as malondiadehycle（MDA）in serum and multiple organs including brain，heart and liver were determined by commercial assay kits.LBTFE was significantly（P＜0.05）increased the serum T-ACO activity，and also increased the activity of SOD，CAT and GSH-Px in serum and multiple organs，respectively.In addition，LBTFE treatment was also dose-dependently decreased the serum levels of MDA，and reduced the lipid peroxidation in multiple organs（brain，heart and liver）of aged mice，significantly（P＜0.05）.The results from this study suggested the LBTFE was able to enhance the antioxidant activity in aged ICR mice.

Liubaotea；totalflavonoid；antioxidantfunction；agedmice

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.041

廣西教育廳高校科學技術研究項目（LX2014257）；桂林醫(yī)學院引進人才科研啟動基金（04010150001）

宋家樂（1983—），男（漢），副教授，博士，研究方向：植物天然化學，分子營養(yǎng)學。

2015-12-12