一種快速鑒別干紅葡萄酒品質(zhì)優(yōu)劣的方法

夏曉艷，李赫宇，李巍，趙余慶，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

一種快速鑒別干紅葡萄酒品質(zhì)優(yōu)劣的方法

夏曉艷1，李赫宇2，李巍1，趙余慶1，*

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110016；2.天津市益倍建生物技術(shù)有限公司，天津300457）

根據(jù)葡萄酒中花色苷和單寧的化學(xué)性質(zhì)，建立一種沉淀法快速鑒別干紅葡萄酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的方法。該沉淀法是將不同酒樣分別與一定濃度的三氯化鐵、醋酸鉛、蛋白胨、純牛奶稀釋液等溶液，在室溫（20℃～22℃）條件下，分別按照一定的配比在EP管內(nèi)發(fā)生沉淀反應(yīng)，通過(guò)比較不同酒樣間反應(yīng)結(jié)果的差異性以及規(guī)律性，發(fā)現(xiàn)并證明了紅酒中的花色苷與單寧等物質(zhì)的含量與沉淀量之間存在著相關(guān)性。同時(shí)，利用HPLC法同步測(cè)定了試驗(yàn)中涉及的干紅葡萄酒中白藜蘆醇、原兒茶酸、沒(méi)食子酸、兒茶素和表兒茶素5種活性成分，進(jìn)一步驗(yàn)證了沉淀法評(píng)價(jià)干紅葡萄酒質(zhì)量的可靠性和科學(xué)性。

干紅葡萄酒；花色苷；單寧；沉淀法；HPLC；快速鑒別

根據(jù)國(guó)際葡萄和葡萄酒組織（OIV）規(guī)定，葡萄酒是用新鮮的葡萄或葡萄汁經(jīng)過(guò)發(fā)酵釀成的酒精飲料［1］。近年來(lái)，干紅葡萄酒的保健作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注，紅酒不再是一種單純的飲品，甚至被視為具有防病治病作用的功能性飲品?；ㄉ帐歉杉t葡萄酒中一類(lèi)常見(jiàn)的多酚類(lèi)化合物，化學(xué)性質(zhì)活潑，能夠轉(zhuǎn)化為更為復(fù)雜的寡聚體花青素源性色素，如原花青素等。干紅葡萄酒中已被鑒別的花色苷有錦葵素、花翠素、矢車(chē)菊素、芍藥素和矮牽牛色素等的3-單糖苷［2］。研究表明，花色苷是一種有效的抗氧化物質(zhì)，可以清除自由基［3-4］，具有抗動(dòng)脈硬化、預(yù)防冠心病，抗乳腺癌，抗衰老等作用［5-6］。另外，聚合花色苷是花色苷與兒茶素、表兒茶素等黃烷醇類(lèi)等物質(zhì)直接縮合或是一些小分子物質(zhì)和黃烷醇類(lèi)物質(zhì)的縮合產(chǎn)物，也包括花色苷-花色苷之間的直接或間接聚合的多聚體［7］?；ㄉ剀眨ò珷颗；ㄉ?，翠雀花色素，花青素等）右側(cè)苯環(huán)上的兩個(gè)羥基可以與重金屬離子（如Fe3+，Al3+等）反應(yīng)，形成穩(wěn)定的五元環(huán)絡(luò)合物，產(chǎn)生藍(lán)色或墨綠色的沉淀［8］。另外，單寧是一種可生物降解的陰離子聚合物，能與蛋白質(zhì)、多糖、非離子表面活性劑結(jié)合產(chǎn)生沉淀［9］。

花色素苷和單寧的含量直接影響著干紅葡萄酒的顏色，顏色越深，色度值越高［10］，葡萄酒的顏色也是評(píng)價(jià)葡萄酒質(zhì)量的重要指標(biāo)。目前，干紅葡萄酒的顏色評(píng)價(jià)方法主要還是用“目視感受+語(yǔ)言描述”的方法，但是該方法需要經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練，也存在很大的離散性和隨機(jī)誤差［11］。另外，利用CIELab系統(tǒng)方法描述葡萄酒的顏色特征，減少了感官評(píng)價(jià)的隨機(jī)誤差和主觀離散性，但是，對(duì)于普通能夠消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，該方法操作復(fù)雜，通用性較差。

根據(jù)葡萄酒中花色苷和單寧等物質(zhì)能夠與某些金屬離子或是蛋白質(zhì)等反應(yīng)生成沉淀的化學(xué)性質(zhì)，創(chuàng)建了一種利用沉淀反應(yīng)快速評(píng)價(jià)干紅葡萄酒中的花色苷及單寧含量的方法，對(duì)干紅葡萄酒的質(zhì)量進(jìn)行優(yōu)劣評(píng)價(jià)。并通過(guò)HPLC方法對(duì)葡萄酒中的幾種代表性物質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定，證實(shí)了該方法的可靠性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1品牌葡萄酒

25種國(guó)產(chǎn)品牌不同產(chǎn)地的干紅葡萄酒，主要采購(gòu)于沈陽(yáng)市家樂(lè)福大型超市。

1.1.2廉價(jià)葡萄酒

涉及14種廉價(jià)葡萄酒，主要采購(gòu)于沈陽(yáng)市南二批發(fā)市場(chǎng)。

1.1.3其他

純牛奶：遼寧輝山乳業(yè)集團(tuán)沈陽(yáng)有限公司生產(chǎn)；EP管（0.5、2 mL）：海門(mén)新星實(shí)驗(yàn)器材有限公司生產(chǎn)。

1.2儀器

高效液相色譜儀（HITACHI，日立），UV detector L-2000系統(tǒng)，Kromasil C18色譜柱（150 mm，4.6 mm），高速離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16）：江蘇金壇市中大儀器廠。

1.3試劑

醋酸鉛：廣東汕頭西隴化工廠；三氯化鐵：北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠；合成色素（日落黃、檸檬黃）：廣東省東莞市添之彩食品廠；大紅、亮藍(lán)、胭脂紅：天津裕興源添加劑科技有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；95%乙醇（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

白藜蘆醇（批號(hào)501-36-0）、原兒茶酸（批號(hào)99-50-3）和沒(méi)食子酸（批號(hào)5995-86-8，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）：天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司）；兒茶素（批號(hào)878-200102）和表兒茶素（批號(hào)877-200001，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%）：中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.4方法

1.4.1反應(yīng)溶液的配置

醋酸鉛溶液：量取6.2g醋酸鉛固體，加入到300mL去離子水中，搖勻，靜置，即得300 mL醋酸鉛儲(chǔ)備液。

三氯化鐵溶液：量取15.5 g六水合三氯化鐵，加入到300 mL去離子水中，再加入兩到三滴濃鹽酸，混合均勻，即得300 mL三氯化鐵儲(chǔ)備液。

蛋白胨溶液：量取0.8g蛋白胨粉末，加入到100mL去離子水中，混合均勻后即得100 mL蛋白胨儲(chǔ)備液。

牛奶稀釋液：量取50 mL純牛奶，等分為5份，分別用去離子水稀釋為1至5倍牛奶稀釋液。

1.4.2人工色素混合液的配置

分別配置濃度為0.1 g/100 mL的大紅、檸檬黃、亮藍(lán)、日落黃的溶液，以及0.2 g/100 mL的胭脂紅色素溶液。

混合色素溶液的調(diào)配：分別量取上述適量大紅、檸檬黃、胭脂紅3種色素溶液，混合調(diào)配，搖勻后，按照體積比加入13%的95%乙醇溶液，搖勻，目測(cè)觀察混合溶液接近紅酒的顏色。

1.4.3沉淀反應(yīng)

按照紅酒原液與沉淀試劑溶液分別按照體積比2∶1、1∶1、2∶3、1∶3、1∶4的配比，將各酒樣分別與上述四種反應(yīng)試劑于EP管中進(jìn)行反應(yīng)試驗(yàn)，搖勻，靜置，離心（1 600 r/min，30 s，離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速的設(shè)定，以沉淀完全沉降為準(zhǔn)）后，觀察對(duì)比不同酒樣與各反應(yīng)試劑反應(yīng)生成的沉淀的顏色與體積。并進(jìn)行品牌酒與廉價(jià)酒的平行對(duì)照反應(yīng)試驗(yàn)。

對(duì)照試驗(yàn)：按照相同的方法色素混合液分別與醋酸鉛、三氯化鐵、蛋白胨、牛奶稀釋液反應(yīng)試驗(yàn)。

1.4.4HPLC法對(duì)酒樣中指標(biāo)成分的含量測(cè)定

試驗(yàn)條件：結(jié)合參考文獻(xiàn)及本課題組已有工作基礎(chǔ)［12］，稍加改進(jìn)，確定色譜條件，固定相用Kromasil C18色譜柱（150 mm，4.6 mm）；流動(dòng)相采用乙腈（A）∶水-0.1%磷酸（B）梯度洗脫，流速為1 mL/min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

試劑處理水經(jīng)0.45 μm濾膜超濾、超聲波脫氣后使用；乙腈經(jīng)0.50 μm濾膜超濾、超聲振蕩脫氣后備用。

酒樣處理經(jīng)0.22 μm濾膜超濾，直接進(jìn)樣檢測(cè)。

標(biāo)準(zhǔn)品的配置分別準(zhǔn)確稱取白藜蘆醇、沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素對(duì)照品各1.5 mg置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

按上述色譜條件，依次取各種酒樣過(guò)0.22 μm濾膜超濾后，采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1沉淀反應(yīng)現(xiàn)象分析

本試驗(yàn)涉及的Pb（Ac）2、FeCl3、蛋白胨、牛奶稀釋液四種沉淀反應(yīng)試劑與不同品牌的酒樣發(fā)生反應(yīng)，皆有沉淀產(chǎn)生，且現(xiàn)象差異顯著。并且以上4種試劑與混合色素溶液作用，均無(wú)沉淀現(xiàn)象出現(xiàn)：Pb（Ac）2、FeCl3、蛋白胨3種溶液與混合色素溶液混合搖勻并離心后，溶液澄清透明，牛奶稀釋液與混合色素溶液混合搖勻并離心后為顏色均一的乳濁液。

2.2效果展示及規(guī)律

本試驗(yàn)觀察了在不同配比條件下（分別按照紅酒原液與各沉淀反應(yīng)試劑的體積比為2∶1，1∶1，2∶3，1∶3，1∶4的配比反應(yīng)）的反應(yīng)效果，均得到一定的反應(yīng)效果。其中，在體積比為2∶3的條件下，反應(yīng)較為完全，沉淀產(chǎn)生量最大，反應(yīng)效果最佳。表1為該條件下的部分反應(yīng)結(jié)果的效果展示。

表1　不同酒樣以及混合色素溶液分別與四種沉淀試劑反應(yīng)后的效果展示圖（酒樣/色素液與沉淀試劑的體積比為2∶3）Table 1The results of different wine samples and mixing the pigment solution reacted with four different precipitation reagents respectively showed in diagram（volume ratio of wine sample/dye solution and precipitation reagent was 2∶3）

對(duì)上述沉淀反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行觀察分析，筆者發(fā)現(xiàn)這些沉淀反應(yīng)存在著一定的規(guī)律，并分別對(duì)沉淀的和上清液的顏色規(guī)律進(jìn)行了總結(jié)，見(jiàn)表2和表3。

表2　品牌酒與廉價(jià)酒分別與不同試劑的沉淀反應(yīng)生成沉淀情況的規(guī)律性總結(jié)對(duì)比Table 2Comparative summary of the results of the reaction of brand wines and cheap wines with the four precipitate situations

表3　離心后，上清液的顏色對(duì)比Table 3Comparative summary of the color of the supernatant liquids after centrifugation

同時(shí)，在此基礎(chǔ)上對(duì)所得沉淀進(jìn)行過(guò)濾，干燥至恒重處理，稱重，得到各組沉淀的平均值，同列于表2。2.3 HPLC法測(cè)量結(jié)果

為了進(jìn)一步探尋沉淀反應(yīng)現(xiàn)象與紅酒品質(zhì)的關(guān)系，并驗(yàn)證其鑒別效果的可靠性，本文利用HPLC方法測(cè)定了沉淀反應(yīng)所涉及的葡萄酒中的沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇5種活性成分的含量。測(cè)量結(jié)果如表4、表5所示。

表4　HPLC法對(duì)25種國(guó)產(chǎn)品牌葡萄酒中的五種活性成分的含量測(cè)定Table 4Contents of five phenolic constituents in the 25 different kinds of Chinese brand red wines by HPLC method

續(xù)表4　HPLC法對(duì)25種國(guó)產(chǎn)品牌葡萄酒中的五種活性成分的含量測(cè)定Continue table 4Contents of five phenolic constituents in the 25 different kinds of Chinese brand red wines by HPLC method

表5　HPLC法對(duì)14種廉價(jià)葡萄酒中的5種活性成分的含量測(cè)定Table 5Contents of five phenolic constituents in the 14 different kinds of cheap red wines by HPLC method

3　結(jié)論與討論

HPLC測(cè)定結(jié)果顯示，沒(méi)食子酸、原兒茶酸、兒茶素、表兒茶素、白藜蘆醇等指標(biāo)成分在國(guó)產(chǎn)品牌葡萄酒中的含量明顯高于廉價(jià)酒。同時(shí)，在沉淀反應(yīng)中，品牌酒的沉淀平均生成量也多于廉價(jià)酒。根據(jù)此結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分別以Pb（Ac）2、FeCl3、蛋白胨和牛奶稀釋液作為沉淀反應(yīng)試劑，與紅酒中花色苷以及單寧發(fā)生反應(yīng)沉淀，其沉淀的生成量以及沉淀的顏色與紅酒中指標(biāo)成分含量之間存在著正相關(guān)性，沉淀的生成量越多，HPLC法測(cè)得的紅酒中活性物質(zhì)含量越高。這與沉淀反應(yīng)原理相一致，而沉淀反應(yīng)主要是紅酒多酚、單寧等物質(zhì)與沉淀試劑的絡(luò)合反應(yīng)，我們的試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了沉淀生成量越高紅酒多酚及單寧含量越高。

因此，沉淀法鑒別干紅葡萄酒方法簡(jiǎn)便、快速、成本耗費(fèi)低，是一種快速鑒別干紅葡萄酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的有效方法。

我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，葡萄酒中禁止添加除山梨酸鉀、苯甲酸、二氧化硫和抗壞血酸以外的任何種類(lèi)的添加劑［13］。然而，紅酒市場(chǎng)的造假現(xiàn)象屢見(jiàn)不鮮，為了貪圖利益，減少葡萄汁的用量，一些商販利用加水、調(diào)酒度、調(diào)總酸等手段生產(chǎn)勾兌紅酒。某些葡萄酒中檸檬黃、胭脂紅、亮藍(lán)等人工合成色素嚴(yán)重超標(biāo)［14］，危害消費(fèi)者的利益。目前，葡萄酒缺乏相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及快速檢測(cè)方法，傳統(tǒng)的感覺(jué)器官（視、嗅、味、觸）來(lái)品評(píng)鑒定葡萄酒不夠準(zhǔn)確，且需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員才能完成。應(yīng)用現(xiàn)代色譜分離、分析技術(shù)，尋找和發(fā)現(xiàn)紅酒中的生物活性物質(zhì)，并通過(guò)采用現(xiàn)代色譜技術(shù)對(duì)干紅葡萄酒中的活性成分進(jìn)行分析與定量測(cè)定，能夠達(dá)到準(zhǔn)確評(píng)價(jià)和鑒別的目的，也有助于人們更好地認(rèn)識(shí)葡萄酒。然而，這些方法專業(yè)性強(qiáng)，不便于普及，難以滿足廣大消費(fèi)者的需求。因此，本文試圖尋找一種方便快捷、通用性強(qiáng)、適用性好的葡萄酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的快速鑒別方法，希望能夠?yàn)閺V大群眾選購(gòu)紅酒提供依據(jù)和保障。

本研究探討對(duì)比了三氯化鐵、醋酸鉛、蛋白胨、純牛奶等4種物質(zhì)作為沉淀反應(yīng)試劑，鑒別干紅葡萄酒品質(zhì)的效果。其中，三氯化鐵和醋酸鉛試劑的反應(yīng)原理是根據(jù)花色素苷在右側(cè)苯環(huán)的正位上有兩個(gè)羥基與試劑中的鐵離子和鉛離子反應(yīng)，產(chǎn)生墨綠色或藍(lán)色的絡(luò)合物沉淀［8］。有研究根據(jù)此反應(yīng)性質(zhì)，利用醋酸鉛試紙快速鑒別干紅葡萄酒的真?zhèn)?，根?jù)試紙顏色變化差異鑒別原汁酒和勾兌酒［15］。但是，對(duì)于顏色的描述屬于感官評(píng)價(jià)，存在一定的隨機(jī)誤差和主觀離散性。本實(shí)驗(yàn)利用沉淀法鑒別紅酒品質(zhì)，在觀察沉淀和上清液顏色的基礎(chǔ)上，主要根據(jù)沉淀的量鑒別干紅葡萄酒中花色苷等物質(zhì)的含量，進(jìn)而評(píng)價(jià)紅酒的品質(zhì)，在一定程度上較好地克服了以上問(wèn)題。另外，本文首次嘗試?yán)眉兣Ｄ虒?duì)紅酒的品質(zhì)進(jìn)行鑒別，并取得一定的效果。本文提供了一種快速鑒別紅酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的思路和方法，為人們能夠利用生活中常見(jiàn)的物質(zhì)和簡(jiǎn)單易行的方法便能快速區(qū)分出勾兌酒與原汁酒提供依據(jù)，也為進(jìn)一步研究紅酒質(zhì)量的鑒別方法提供方向。

本研究根據(jù)葡萄酒中花色苷以及單寧等物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，探索了紅酒分別與三氯化鐵、醋酸鉛、蛋白胨以及純牛奶等物質(zhì)的沉淀反應(yīng)的規(guī)律，建立了利用沉淀反應(yīng)快速評(píng)價(jià)干紅葡萄酒的品質(zhì)的方法。同時(shí)，本文進(jìn)一步利用HPLC法測(cè)定了葡萄酒中的具有代表性的指標(biāo)性成分的含量，對(duì)比找到了反應(yīng)結(jié)果與指標(biāo)成分含量的相關(guān)性。初步證明了沉淀法可以作為一種簡(jiǎn)單有效的鑒別葡萄酒質(zhì)量的手段。并且該方法具有直觀有效、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。

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A Method for Fast Detection of the Quality of Red Wine

XIA Xiao-yan1，LI He-yu2，LI Wei1，ZHAO Yu-qing1，*
（1.College of Traditional Chinese Medicine，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016，Liaoning，China；2.UBasic Health Biotechnology Co.，Ltd.，Tianjin 300457，China）

According to the chemical properties of anthocyanins and tannins in wine，a rapid identification of red wine quality was established，and the method was a kind of precipitation assay.In this method，ferric chloride，lead acetate，and proteose peptone were used to react with different red wine samples in EP tubes at room temperature（about 20℃to 22℃），and we found that there was some correlation between the results and the wine quality.And what's more，five activities in red wine（resveratrol，protocatechuic acid，gallic acid，cate－chin and epicatechin）were detected simultaneously by HPLC method.In the light of the results，it found that precipitation assay was a reliable and scientific method for fast detection of the quality of red wine.

red wine；anthocyanins；tannin，method of precipitation；HPLC；fast detection

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.034

遼寧省博士啟動(dòng)資金（20111135）

夏曉艷（1984—），女（漢），碩士研究生，研究方向：中藥化學(xué)。

趙余慶（1957—），男（漢），教授，研究方向：天然抗腫瘤、降血糖成分的發(fā)現(xiàn)與構(gòu)效關(guān)系研究。

2015-12-07