蛹蟲草菌絲體酶解制備多肽的工藝研究

朱振元，孟潔，樊梅香，王明飛，王錚，苗信凱

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

蛹蟲草菌絲體酶解制備多肽的工藝研究

朱振元，孟潔，樊梅香，王明飛，王錚，苗信凱

（食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

蛹蟲草和冬蟲夏草是藥食兼用的真菌，具有對(duì)人體有益的多種活性作用。以液體發(fā)酵后干燥的蛹蟲草菌絲體粉末為原料，分別以底物濃度、溫度、pH、加酶量和時(shí)間為條件，分析單因素對(duì)菌絲體酶解效果，結(jié)果表明：當(dāng)蛹蟲草菌絲體酶解液多肽指數(shù)達(dá)最大時(shí)，各個(gè)條件分別為：底物濃度10%左右；溫度42℃左右；pH為2.0；加酶量2.5%；時(shí)間8 h。然后通過正交試驗(yàn)優(yōu)化菌絲體多肽，獲得最佳酶解工藝，即反應(yīng)溫度為42℃、時(shí)間為8h、底物濃度為10%、加酶量為2.5%。最后利用Tricine-SDS-PAGE電泳確定多肽的分子量范圍，結(jié)果表明：蛋白酶酶解蛹蟲草菌絲體酶解液多肽主要分布在3160Da～7629Da附近。

蛹蟲草菌絲體；多肽；酶解；電泳

蛹蟲草又別名北冬蟲夏草，我國(guó)各省區(qū)均有遍布，春至秋天在半埋于林地上或腐枝落葉層下的鱗翅目昆蟲蛹上長(zhǎng)出。隸屬于真菌門、子囊菌亞門、核菌綱、球殼目、麥角菌科、蟲草屬，與冬蟲夏草同屬異種。研究表明二者具有極相似的有效成分和作用［1］。

生物活性肽因?yàn)楦呶章?、低毒、零污染等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、畜牧養(yǎng)殖等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。Byung TP等從蛹蟲草子座中分離得到分子量為12 kDa的小分子蛋白肽［2］，經(jīng)檢測(cè)其對(duì)尖孢鐮刀菌有顯著抗菌活性，并能對(duì)人乳腺癌和膀胱癌細(xì)胞有抑制作用。目前有關(guān)蛹蟲草的核苷類、多糖類物質(zhì)的研究報(bào)道較多，但對(duì)于其蛋白質(zhì)多肽方面的研究較少。Ng TB等從蛹蟲草中提取到天然活性肽Cordymin［3］，測(cè)定到此多肽分子量為10.90 kDa，其對(duì)玉米小班病菌、球腔菌、絲核菌、加拿大白色念珠菌都有顯著抑制作用，但蛹蟲草中多肽含量微少。通過對(duì)蛹蟲草酶解制備多肽，可以更好的挖掘蛹蟲草的藥用價(jià)值。

采用實(shí)驗(yàn)室提供的蛹蟲草菌絲體，通過單因素試驗(yàn)，從控制底物濃度、加酶量、溶液pH、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間5個(gè)因素來確定最佳酶解條件。選用胰蛋白酶和胃蛋白酶分別進(jìn)行水解，以可溶性氮含量為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)優(yōu)化了最佳酶解工藝。最后采用Tricine-SDS-PAGE電泳法對(duì)蛹蟲草菌絲體多肽初步鑒定，分析蛹蟲草菌絲體多肽分子量分布。

1　材料與方法

1.1原料與試劑

蛹蟲草菌絲體：由天津科技大學(xué)生物資源與功能食品研究室保存的蛹蟲草菌種經(jīng)液體發(fā)酵、干燥而得。

胰蛋白酶（10 000 U/g）、胃蛋白酶（3 500 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2主要儀器設(shè)備

SP2102UV型紫外可見分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司；ESJ205-4電子天平：沈陽(yáng)龍騰電子標(biāo)量?jī)x器有限公司；a/CYAB30立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫(yī)用核子有限公司；DFG801型電熱鼓風(fēng)箱：湖北省黃石市醫(yī)療器械廠；G10型醫(yī)用高速離心機(jī)：安新縣白洋離心機(jī)廠；MODEL808酸度計(jì)：美國(guó)奧利龍；LGJ-0.5臺(tái)式冷凍干燥機(jī)：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)儀器廠；冷藏冰箱BCD-215F/T：青島澳柯瑪有限公司。

1.3方法

1.3.1蛹蟲草菌絲體蛋白含量的測(cè)定

采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.2蛹蟲草菌絲體酶解液的制備

1.3.2.1酶解工藝

準(zhǔn)確稱取菌絲體干粉末，加入蒸餾水，然后用1 mol/L氫氧化鈉或1 mol/L氯化鈉用酸度計(jì)調(diào)節(jié)所需的pH，加入相應(yīng)的蛋白酶，進(jìn)行水解。在水解過程中要一直保持pH得恒定，待水解結(jié)束，將樣品溶液煮沸，促使酶失去活性。放置冷卻后，以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心，取上清液，再用蒸餾水洗1次沉淀離心后合并，記錄體積。然后用三氯乙酸可溶性氮（TCA-NSI）法測(cè)可溶性氮濃度［4］。

1.3.2.2酶解度測(cè)定

TCA-SN%法：取3 mL水解液與3 mL 10%TCA溶液混合后反應(yīng)30 min，在4 200 r/min下離心20 min，量取上清液1.0 mL于試管中，加入4.0 mL雙縮脲試劑，室溫放置30 min，反應(yīng)結(jié)束后，用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度值，然后按照如下公式算出蛹蟲草菌絲體的多肽指數(shù)［5］。

式中：TCA-SN%為蛹蟲草酶解液多肽指數(shù)；C為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V為上清液體積，mL；W為蛹蟲草菌絲體的質(zhì)量，mg。

1.3.2.3制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

取6支干凈試管進(jìn)行編號(hào)，按照表1加入試劑，充分混勻，在室溫下放置30 min反應(yīng)，然后用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作Table 1Production of standard curve

1.3.2.4樣品的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

量取水解液與TCA混合上清液1.0 mL于試管中，加入4.0 mL雙縮脲試劑，室溫放置30 mim，反應(yīng)結(jié)束后，用紫外可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)540 nm下測(cè)定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的濃度，可得可溶性氮含量。

1.3.2.5蛋白酶的選擇

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶和胃蛋白酶處理效果較好，故本試驗(yàn)選擇胰蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1底物濃度對(duì)蛹蟲草菌絲體酶解效果的影響

稱取菌絲體粉末1.0 g放入錐形瓶中，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度分別為6%、8%、10%、12%、14%，調(diào)節(jié)溶液的pH為2.0，加入2.5%的胃蛋白酶，37℃酶解8 h，沸水浴10 min，抽濾，用TCA-NSI法和雙縮脲法測(cè)定濾液的蛋白質(zhì)濃度，按照上述公式算出濾液中多肽指數(shù)［6］。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3.2反應(yīng)溫度對(duì)蛹蟲草菌絲體酶解效果的影響

稱取菌絲體粉末1.0 g，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度為10%，調(diào)節(jié)溶液的pH初始為2.0，加入2.5%的胃蛋白酶，分別在溫度25、30、37、42、50℃下酶解8 h，沸水浴10 min，抽濾，用TCA-NSI法和雙縮脲法測(cè)定濾液的蛋白濃度，按照公式算出濾液中的多肽指數(shù)。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3.3初始pH值對(duì)蛹蟲草菌絲體酶解效果的影響

稱取蛹蟲草菌絲體粉末1.0 g，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度為10%，調(diào)節(jié)溶液的pH分別為1.0、1.5、2.0、3.0、4.0，加入2.5%的胃蛋白酶，37℃酶解8 h，沸水浴10 min，抽濾，用TCA-NSI法和雙縮脲法測(cè)定濾液的蛋白濃度，按照公式算出濾液中的多肽指數(shù)。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3.4加酶量（胃蛋白酶）對(duì)蛹蟲草菌絲體酶解效果的影響

稱取菌絲體粉末1.0 g，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度為10%，調(diào)節(jié)溶液的pH為2.0，分別加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的胃蛋白酶，37℃酶解8 h，沸水浴10 min，抽濾，用TCA-NSI法和雙縮脲法測(cè)定濾液的蛋白濃度，按照公式算出濾液中的多肽指數(shù)。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.3.5反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛹蟲草菌絲體酶解效果的影響

稱取蛹蟲草菌絲體粉末1.0 g，加入蒸餾水調(diào)節(jié)底物濃度為10%，調(diào)節(jié)溶液的pH為2.0，加入2.5%的胃蛋白酶，37℃分別酶解2、4、6、8、10h，沸水浴10min，抽濾，用TCA-NSI法和雙縮脲法測(cè)定濾液的蛋白濃度，按照公式算出濾液中的多肽指數(shù)。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1分別選擇胰蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行正交試驗(yàn)

由于胰蛋白酶和胃蛋白酶在各自最適的溫度和pH范圍內(nèi)對(duì)酶促反應(yīng)的影響不大，所以本試驗(yàn)選取其他因素：底物濃度、加酶量和時(shí)間3個(gè)因素，優(yōu)化了最優(yōu)蛋白酶的工藝條件進(jìn)行正交試驗(yàn)［7］。

采用三因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，如表2所示。

表2　正交試驗(yàn)因素水平Table 2The orthogonal experiment factor levels

1.3.4.2胰蛋白酶和胃蛋白酶以1∶1的比例進(jìn)行正交試驗(yàn)

采用四因素四水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，如表3所示。

表3　正交試驗(yàn)因素水平Table 3The orthogonal experiment factor levels

1.3.4蛹蟲草菌絲體活性肽的分離純化

1.3.4.1蛹蟲草菌絲體酶解液的脫色

蛹蟲草菌絲體粗品利用大孔吸附樹脂AB-8進(jìn)行脫色，先將AB-8超聲脫氣0.5 h，將多余的蒸餾水倒出，使用玻璃棒邊攪拌邊將AB-8緩慢地灌入層析柱中（柱尺寸2.5 cm×20 cm），輕輕敲擊柱壁，使填料沉降均勻、緊密，用蒸餾水平衡2 h，使層析柱達(dá)到平衡狀態(tài)，填料緊密結(jié)實(shí)，備用［8］。然后將酶解液用膠頭滴管加入層析柱中。用蒸餾水洗脫，并收集洗脫液，備用。

1.3.4.2蛹蟲草菌絲體酶解液的濃縮

將經(jīng)過脫色后的蛹蟲草菌絲體酶解液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行初次濃縮，等到體積小于原體積的1/2時(shí)，放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍再次濃縮，備用。

1.3.4.3Tricine-SDS-PAGE電泳

分別量取2 mL經(jīng)過濃縮干燥處理的蛹蟲草菌絲體酶解液和蛋白Marker，加入2 mL樣品緩沖液，在渦旋混勻器上混合均勻，沸水浴15 min，冷卻后準(zhǔn)備點(diǎn)樣。每次點(diǎn)樣量40 μL。

2　結(jié)果與討論

2.1蛹蟲草菌絲體蛋白含量的測(cè)定結(jié)果

2.1.1蛋白含量測(cè)定結(jié)果

經(jīng)過凱氏定氮法滴定分析后，得到蛹蟲草菌絲體的蛋白質(zhì)含量為26.782 g/kg。

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的的制作

圖1是以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度為橫坐標(biāo)、以吸光度值為縱坐標(biāo)繪作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到蛋白質(zhì)濃度與吸光度之間的回歸方程為：y=0.045 3x+0.000 9（R2=0.999 7）。

圖1　牛血清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1Standard curve of bovine serum protein

2.2對(duì)蛹蟲草菌絲體酶解效果影響因素結(jié)果

底物濃度、反應(yīng)溫度、初始pH、加酶量、反應(yīng)時(shí)間分別對(duì)多肽指數(shù)的影響見圖2～圖6。

圖2　底物濃度對(duì)多肽指數(shù)的影響Fig.2Effect of substrate concentration on the peptide index

圖3　反應(yīng)溫度對(duì)多肽指數(shù)的影響Fig.3Effect of reaction temperature on the peptide Index

圖4　初始pH對(duì)多肽指數(shù)的影響Fig.4Effect of initial pH on thepeptide index

圖5　加酶量對(duì)多肽指數(shù)的影響Fig.5Effect of the amount of enzyme on the peptide index

圖6　反應(yīng)時(shí)間對(duì)多肽指數(shù)的影響Fig.6Effect of reaction time on the peptides index

如圖2所示，隨著酶解液底物濃度的逐漸增大，多肽指數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)線，在底物濃度10%左右時(shí)，多肽指數(shù)最大；如圖3所示，隨著反應(yīng)溫度的逐漸增大，多肽指數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)線，當(dāng)反應(yīng)溫度42℃左右時(shí)，多肽指數(shù)最大；如圖4所示，隨著初始pH的逐漸增大，多肽指數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)線，在pH2時(shí)，多肽指數(shù)最大；如圖5所示，隨著加酶量的逐漸增大，多肽指數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)線，在加酶量2.5%時(shí)，多肽指數(shù)最大；如圖6所示，隨著反應(yīng)時(shí)間的逐漸增長(zhǎng)，多肽指數(shù)呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)線。在反應(yīng)時(shí)間8 h時(shí)，多肽指數(shù)最大。

2.3正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果

胰蛋白酶水解正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表4和表5。

表4　胰蛋白酶水解直觀分析結(jié)果表Table 4Analysis of the results of Trypsin Hydrolysis

表5　胰蛋白酶水解方差分析表Table 5Analysis of variance of trypsin hydrolysis

由表4可以看出，影響胰蛋白酶水解的各因素的順序?yàn)闀r(shí)間（A）＞加酶量（B）＞底物濃度（C），由表5方差分析可以看出，其中P（A）＞0.05，所以反應(yīng)時(shí)間對(duì)胰蛋白酶水解試驗(yàn)有顯著的影響，由直觀分析和方差分析得出，以胰蛋白酶為水解酶，得到的最佳酶解組合為A2B2C2，即反應(yīng)時(shí)間為4 h、底物濃度為10%、加酶量為2.5%時(shí)用胰蛋白酶水解效率最高。

2.3.2胃蛋白酶水解正交試驗(yàn)結(jié)果

胃蛋白酶水解正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表6和表7。

由表6和表7可以看出，影響胃蛋白酶水解的各因素的順序?yàn)闀r(shí)間（A）＞加酶量（B）＞底物濃度（C），所以由直觀分析和方差分析得出，以胃蛋白酶為水解酶，得到的最佳酶解組合為A3B2C2，即反應(yīng)時(shí)間為6 h、底物濃度為10%、加酶量為2.5%時(shí)用胰蛋白酶水解效率最高。

表6　胃蛋白酶水解直觀分析結(jié)果Table 6The results of the visual analysis of pepsin hydrolysis

表7　胃蛋白酶水解方差分析表Table 7Analysis of variance of pepsin hydrolysis

2.3.3胰蛋白酶和胃蛋白酶以1∶1的比例進(jìn)行水解的正交試驗(yàn)結(jié)果

以胃蛋白酶和胰蛋白酶為水解酶，水解正交試驗(yàn)分析結(jié)果見表8和表9。

表8　復(fù)合酶水解直觀分析結(jié)果Table 8Analysis of the results of compound enzymatic hydrolysi

續(xù)表8　復(fù)合酶水解直觀分析結(jié)果Continue table 8Analysis of the results of compound enzymatic hydrolysi

表9　復(fù)合酶水解方差分析表Table 9Analysis of variance of compound enzyme hydrolysis

由表8和表9可以看出，雙酶得到的最佳酶解組合為A3B4C3D3，即反應(yīng)溫度為42℃、時(shí)間為8 h、底物濃度為10%、加酶量為2.5%時(shí)用雙酶水解效率最高，4個(gè)因素對(duì)水解影響的程度分別為溫度＞時(shí)間＞加酶量＞底物濃度。

2.4蛹蟲草菌絲體活性肽的分離純化結(jié)果

2.4.1Tricine-SDS-PAGE電泳

根據(jù)Tricine-SDS-PAGE電泳中標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker的分子量大小和遷移距離，以Marker的分子量對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，以Marker遷移距離為橫坐標(biāo)做回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖7所示；得到marker分子量對(duì)數(shù)（y）和遷移距離（x）間的回歸方程為：y=-0.216 9x+4.779 4（R2= 0.936 9）。

如圖7所示，此圖是蛹蟲草菌絲體酶解液經(jīng)過Tricine-SDS-PAGE電泳后的條帶分布圖，條帶比較模糊，但是能看清楚大概位置，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker測(cè)量其遷移距離，然后使用回歸方程y=-0.216 9x+ 4.779 4計(jì)算蛹蟲草菌絲體酶解液電泳后各片段分子量大小，結(jié)果表明蛹蟲草菌絲體酶解液電泳后條帶主要集中分布在16 423 Da、3 160 Da～7 629 Da。結(jié)合生物活性肽的分子量分布范圍，多肽是分子是小分子物質(zhì)?？芍鞍酌该附庥枷x草菌絲體酶解液多肽主要分布在3 160 Da～7 629 Da。

圖8　蛹蟲草菌絲體酶解液電泳結(jié)果Fig.8Cordycepsmilitaris mycelium enzymolysis liquid electrophoresis results

3　結(jié)論

本試驗(yàn)通過凱氏定氮法測(cè)定蛹蟲草菌絲體蛋白含量為26.782 g/kg，酶解的最佳優(yōu)化工藝為A3B4C3D3，即反應(yīng)溫度為42℃、時(shí)間為8 h、底物濃度為10%、加酶量為2.5%；制備蛹蟲草多肽的最佳工藝條件為：反應(yīng)時(shí)間8 h、加酶量2.5%、底物質(zhì)量濃度10%、反應(yīng)溫度42℃、初始pH為2，此條件可以達(dá)到最大程度的多肽指數(shù)。Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，蛹蟲草菌絲體多肽主要集中分布在3 160 Da～7 629 Da附近。

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Study on Preparation Process of Peptides from Cordyceps Mycelium by Enzymolysis

ZHU Zhen-yuan，MENG Jie，F(xiàn)AN Mei-xiang，WANG Ming-fei，WANG Zheng，MIAO Xin-kai
（Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education/College of Food Science and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Cordyceps Militaris belongs to the group of Cordyceps sinensis is a kind of edible fungus with similar drug effects.It has a variety of beneficial effects to human，such as regulating immunity，tumor inhibition and anti-aging activity.In this paper，substrate concentration，temperature，pH，enzyme dosage and time were set as control conditions，respectively to univariate analysis the digestion effect on mycelial.The result was shown that the condition for hydrolyzate peptides index mycelia reaching maximum wasthe substrate concentration of about 10%，the temperature around 42℃，the initial pH at 2.0，the enzyme dosage at 2.5%and the time at 8 h. Then the conditions were optimized by orthogonal experiments of mycelium polypeptides.The result indicated that the best condition for the enzymatic hydrolysis process were as follows：reaction temperature was 42℃，time was 8 h，substrate concentration of 10%，enzyme dosage of 2.5%.Finally the molecular weight of the polypeptide was identified by the tricine-SDS-PAGE electrophoresis method.Theresults showed that the weight of peptides by protease mycelialhydrolyzatedare varied from 3 160 Da to 7 629 Da.

Cordyceps militaris mycelium；peptide；enzymolysis；electrophoresis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.023

國(guó)家農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項(xiàng)目（2011GB2A100009）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20090604）；天津科技大學(xué)科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目（20120106）

朱振元（1969—），男（漢），教授，博士，研究方向：生物資源與功能食品。

2015-12-04