響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥殼總黃酮超聲輔助萃取工藝

張嵐，于婷婷，孫婉玲，王丹，代偉長(zhǎng)

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013；2.吉林省中醫(yī)藥管理局二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林132013；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥殼總黃酮超聲輔助萃取工藝

張嵐1，2，于婷婷1，孫婉玲1，王丹1，2，代偉長(zhǎng)3

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林吉林132013；2.吉林省中醫(yī)藥管理局二級(jí)實(shí)驗(yàn)室，吉林吉林132013；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130118）

主要研究超聲波輔助萃取蕎麥殼黃酮的影響因素并采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助萃取蕎麥殼黃酮類(lèi)化合物。通過(guò)Placket-Burman試驗(yàn)考察料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取溫度、提取次數(shù)對(duì)黃酮提取率的影響，影響最為顯著的3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)；Box-Behnken設(shè)計(jì)得到最優(yōu)超聲輔助萃取蕎麥殼黃酮提取條件。蕎麥殼黃酮最佳提取工藝為：料液比1∶49.63（g/mL），提取時(shí)間60.53min，提取溫度64.70℃，黃酮得率1.58%。考慮到實(shí)際可操作性將實(shí)際組合定為：料液比1∶50（g/mL），提取時(shí)間60min，提取溫度65℃。驗(yàn)證在條件下實(shí)際黃酮得率為1.581%。

蕎麥殼；總黃酮；響應(yīng)面；超聲波

我國(guó)蕎麥種植面積及產(chǎn)量均較高，資源豐富［1］。蕎麥殼重量約占蕎麥總重的三分之一，在我國(guó)，蕎麥殼幾乎得不到有價(jià)值的利用，一部分制成蕎麥枕頭，剩余則作為基肥或者焚燒，因此造成很大浪費(fèi)，不符合可持續(xù)發(fā)展的價(jià)值觀。近年來(lái)隨著科技發(fā)展及科研的深入，人們發(fā)現(xiàn)蕎麥殼富含黃酮類(lèi)物質(zhì)，趙玉平等［2］發(fā)現(xiàn)蕎麥殼中總黃酮含量為1.67%，郭玉蓉等［3］研究發(fā)現(xiàn)苦蕎麥殼黃酮得率為1.7%。因此以蕎麥殼作為原料提取黃酮類(lèi)化合物有好的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

黃酮類(lèi)化合物是重要的天然有機(jī)化合物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類(lèi)此生代謝產(chǎn)物［4］。而目前一些相關(guān)研究證實(shí)，蕎麥黃酮具有多種藥理活性如清除自由基、調(diào)節(jié)血管活性物質(zhì)，特別是對(duì)糖尿?。?-8］、高血脂癥［9-11］和心血管?。?2-15］等具有良好的防治作用。除了上述關(guān)于蕎麥黃酮的研究，目前應(yīng)用于臨床的蕎麥黃酮藥物也很多，例如，復(fù)方蕎麥黃酮膠囊（片劑）用于心腦血管病、蕎麥黃酮口腔噴霧劑用于心絞痛的預(yù)防和治療、復(fù)方蕎麥黃酮噴霧劑用于脫發(fā)癥的治療等［16］。

本文采用了近年來(lái)在提取工藝上運(yùn)用比較廣泛的超聲波輔助萃取并結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥殼中的總黃酮，確定最佳提取工藝參數(shù)。

1　材料與方法

1.1材料

吉蕎1號(hào)蕎麥殼：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院提供。

1.2試劑及配置方法

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%）：南寧龐博生物工程有限公司；95%乙醇、無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純。

1.3儀器與設(shè)備

KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；722型可見(jiàn)光分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；SHB-111A型循環(huán)水式多用真空泵：上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AF-20A型密封型搖擺式粉碎機(jī)：溫嶺市奧力中藥機(jī)械有限公司。

1.4方法

1.4.1蕎麥殼黃酮的提取

將蕎麥殼除雜后鋪在潔凈地面上灑水進(jìn)行回潮處理，放置2 h～3 h后將蕎麥殼放入高壓鍋121℃高壓處理20 min，將經(jīng)高壓處理后的蕎麥殼取出用微波干燥，將干燥的蕎麥殼放入搖擺式粉碎機(jī)粉碎過(guò)60目篩，粉碎過(guò)篩后的蕎麥殼密封放置干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

準(zhǔn)確稱(chēng)取上述處理過(guò)的蕎麥殼1.00 g于100 mL錐形瓶中，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液，在一定溫度、超聲功率下提取一定時(shí)間，提取液冷卻后抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，以95%乙醇定容至100 mL，備用。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4 mL于比色管中，補(bǔ)加95%乙醇至1.5 mL，分別向各試管中加入0.25 mL 4%亞硝酸鈉溶液，靜置6 min，再分別加入0.25 mL 10%硝酸鋁溶液，靜置反應(yīng)6 min，最后各加入1.5 mL 4%氫氧化鈉溶液，混勻。在波長(zhǎng)510 nm測(cè)定其吸光度值并記錄讀數(shù)。以蘆丁濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。Y=0.010 6X，R2=0.999 7

1.4.3黃酮得率計(jì)算

黃酮得率計(jì)算公式如下。

式中：m為1.0 mL樣品液中黃酮質(zhì)量，mg；V為樣品液總體積，mL；M為樣品質(zhì)量，g。

1.4.4超聲輔助萃取蕎麥殼黃酮工藝優(yōu)化

1.4.4.1Plackett-Burman設(shè)計(jì)

通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)可能影響超聲輔助萃取黃酮效果的參數(shù)，包括提取次數(shù)（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）、料液比（E）進(jìn)行主效應(yīng)分析，選用N=5的PB設(shè)計(jì)，每因素取高（+1）、低（-1）兩水平，以黃酮提取率為指標(biāo)。PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1　PB試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表Table 1PB test factor level design table

1.4.4.2最陡爬坡試驗(yàn)

響應(yīng)面只有在臨近最佳值時(shí)才能建立有效的響應(yīng)面方程，最陡爬坡法以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向，根據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長(zhǎng)，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域［17］。根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，確定3個(gè)因素及爬坡方向，選擇合理步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)路徑。

1.4.4.3Box-Behnken Design（BBD）優(yōu)化設(shè)計(jì)

在PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)，選擇料液比（X1）、提取時(shí)間（X2）、提取溫度（X3）為因素，Box-Behnken Design設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。

1.5數(shù)據(jù)分析

每次試驗(yàn)重復(fù)3次，采用MINITAB16.0軟件進(jìn)行PB試驗(yàn)及BBD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

表2　BBD設(shè)計(jì)因子及水平表Table 2BBD design factor and horizontal table

2　結(jié)果與分析

2.1Placket-Burman試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3、表4，主效應(yīng)分析圖見(jiàn)圖1。

表3　Placket-Burman設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Table 3Placket-Burman design experiments and results

表4　PB實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果Table 4PB experimental results

圖1　主效應(yīng)圖Fig.1The main effect diagram

通過(guò)對(duì)效應(yīng)值的計(jì)算，同時(shí)利用minitab16軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行因子分析t檢驗(yàn)得到結(jié)果如下：

回歸方程為：Y=1.43+0.007 7A-0.017 7B+0.022 8C+ 0.064 2D+0.063 5E

根據(jù)表4及主效應(yīng)圖（圖1）可知，D、E即提取溫度和料液比對(duì)蕎麥殼黃酮提取率影響顯著。A、C、D、E為正效應(yīng)，即提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取溫度及料液比的值越大，蕎麥殼黃酮提取率越高，B為負(fù)效應(yīng)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)越大蕎麥殼黃酮提取率越低，最終確定料液比、提取時(shí)間、提取溫度為響應(yīng)面優(yōu)化的因素。

2.2最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5Climbing experiments and results

由表5可看出隨著液料比的增大，提取時(shí)間的增加及提取溫度的升高，黃酮得率呈現(xiàn)先逐漸增大再減小的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶50（g/mL），提取時(shí)間為60 min，提取溫度60℃時(shí)吸光度最大黃酮含量最多即黃酮得率最高，為3因子的最大響應(yīng)值區(qū)域，因此以試驗(yàn)號(hào)4的各因素水平為中心點(diǎn)值設(shè)計(jì)下一步響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.3BBD試驗(yàn)結(jié)果

以料液比1∶50（g/mL），提取時(shí)間為60 min，提取溫度為60℃為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析，BBD設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6，回歸分析結(jié)果見(jiàn)表7。

所得回歸方程為：

由表7可知該二次模型多元相關(guān)性系數(shù)R2= 0.933 6，表明僅有6.64%的不能由此模型解釋?zhuān)貧w模型P值（Prob＞F）=0.018表明該模型顯著，X1、X3、X12、X22、X1X3均對(duì)蕎麥殼黃酮提取率有顯著影響（P＜0.05）。

根據(jù)上述擬合方程得到料液比與提取時(shí)間交互作用對(duì)蕎麥殼黃酮得率的等高線及3D曲面圖，見(jiàn)圖2。

表6　BBD設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6BBD design and results

表7　BBD設(shè)計(jì)回歸分析Table 7BBD design regression analysis

圖2　料液比及提取時(shí)間對(duì)蕎麥殼黃酮得率的影響等高線及3D曲面圖Fig.2Influence of 3D surface contour and solid-liquid ratio and extraction time on the yield of buckwheat flavonoids

由圖2可看出當(dāng)料液比從1∶40（g/mL）增大至1∶60（g/mL），提取時(shí)間由55 min增大至65 min的過(guò)程中黃酮提取率呈現(xiàn)先增大再減小的趨勢(shì)，曲面的頂點(diǎn)即為黃酮提取率最大值。

2.4驗(yàn)證試驗(yàn)

Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化得出最佳組合43組，其中最優(yōu)組合工藝條件為：料液比1∶48.75（g/mL），提取時(shí)間60.14 min，提取溫度64.74℃，黃酮得率1.58%。考慮到實(shí)際可操作性將實(shí)際組合定為：料液比1∶50（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取溫度65℃，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件下實(shí)際黃酮得率為1.581%，與理論最大值接近。說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥殼中總黃酮的提取工藝是可靠的。

3　討論

本試驗(yàn)選擇的吉蕎1號(hào)蕎麥殼黃酮得率為1.581%，與其它研究結(jié)果略有出入，熊雙麗等［18］的研究得出在以乙醇為提取溶劑利用索氏提取方法的條件下苦蕎麥殼和甜蕎麥殼的黃酮得率相似，都為1.10%左右。而宋小利等［19］采用超聲提取，確定最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)63.73%，料液比1∶21.77（g/mL），提取溫度75℃，提取時(shí)間1 h，在上述條件下測(cè)得陜北定邊縣甜蕎麥殼中黃酮類(lèi)化合物的含量為1.03%。樸春紅等［20］的研究得出在乙醇體積分?jǐn)?shù)30%，料液比1∶20（g/mL），提取時(shí)間10 min，提取3次條件下內(nèi)蒙古蕎麥殼黃酮得率為2.381%。這可能由于不同生長(zhǎng)環(huán)境及生長(zhǎng)條件影響蕎麥主要成分的含量，所以黃酮得率有所差別。

在一定提取溫度范圍內(nèi)隨著提取溫度的升高總黃酮得率也隨之增加，這可能是由于蕎麥殼中總黃酮在乙醇中的溶解度隨溫度的升高而增加，同時(shí)由于溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)也隨之增大，提取劑滲透力也隨之增強(qiáng)，使有效成分析出速率增大，這與熊雙麗等［18］及宋小利［19］等人研究趨勢(shì)相同，但當(dāng)提取溫度超過(guò)一定值時(shí)提取率不再增加，甚至有減少趨勢(shì)。提取時(shí)間也是影響黃酮提取率的因素之一，在一定時(shí)間內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加黃酮提取率會(huì)提高，但超過(guò)一定時(shí)間后，黃酮得率上升變化緩慢，這與熊雙麗等［18］及樸春紅等［20］的研究趨勢(shì)相同。乙醇體積分?jǐn)?shù)及料液比影響黃酮提取率，由主效應(yīng)圖（圖1）可看出本文中乙醇體積分?jǐn)?shù)為負(fù)效應(yīng)，即隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，黃酮提取率隨之減小，與郭玉蓉等［3］的研究趨勢(shì)相同，本文乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍在40%～60%之間。另外在一定料液比內(nèi)黃酮得率隨料液比的增大而增大，但超過(guò)一定值后總黃酮得率下降，這與楊芙蓮等［21］的研究趨勢(shì)相同，且臨界值都為1∶50，當(dāng)料液比達(dá)到1∶50（g/mL）后黃酮析出達(dá)到平衡，料液比再繼續(xù)增大對(duì)黃酮得率影響不大。

4　結(jié)論

通過(guò)Placket-Burman設(shè)計(jì)，從5個(gè)影響黃酮提取的因素中篩選出3個(gè)影響因素：液料比、提取溫度、提取時(shí)間，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近最大響應(yīng)值區(qū)域，再利用Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化得出最佳組合：料液比1∶48.75（g/mL），提取時(shí)間60.14 min，提取溫度64.74℃，黃酮得率1.58%。考慮到實(shí)際可操作性將實(shí)際組合定為：料液比1∶50（g/mL），提取時(shí)間60 min，提取溫度65℃，實(shí)際黃酮得率為1.581%與理論最大值接近，說(shuō)明運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥殼中總黃酮的提取工藝是可靠的。

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Optimization of Ultrasonic Assisted Extraction of Total Flavonoids from Buckwheat Shell by Response Surface Method

ZHANG Lan1，2，YU Ting-ting1，SUN Wan-ling1，WANG Dan1，2，DAI Wei-chang3
（1.Department of Public and Health，Jinlin Medical College，Jilin 132013，Jilin，China；2.Level Two Laboratory of Administration of Traditional Chinese Medicine of Jilin Province，Jilin 132013，Jilin，China；3.College of Food Science and Engineering，Jilin Agriculture University，Changchun 130118，Jilin，China）

This paper studied on the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hull main factors and the response surface method was used to optimize the ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hulls.Through the Placket-Burman experiment investigation material to liquid ratio，volume fraction of ethanol，extraction time，extraction temperature，extraction times on the extraction rate of flavonoids，and to determine the effect of the three significant factors for the steepest ascent experiment，determine the center point；Box-Behnken design got optimal ultrasonic assisted extraction of flavonoids from buckwheat hull extraction conditions.The optimized extraction process was that liquid to solid ratio 1∶49.63（g/mL），extraction time 60.53 min，extraction temperature 64.70℃，flavonoid rate 1.58%.Considering the practical operability，the actual combination was determined as the ratio of material to liquid 1∶50（g/mL），extraction time 60 min，extraction temperature 65℃.After the test，under the optimal extraction condition s of buckwheat flavonoids，the actual extraction rate of flavonoids was 1.581%.

buckwheat shell；total flavonoids；response surface；ultrasonic

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.012

吉林省科技廳青年科研基金項(xiàng)目“蕎麥殼黃酮改善糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激作用及機(jī)制”（20150520133JH）；吉林省教育廳“十三五”科研項(xiàng)目“蕎麥殼黃酮改善2型糖尿病糖代謝及肝糖異生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控”

張嵐（1980—），女（漢），副教授，博士，研究方向：生物反應(yīng)器與功能性食品。

2015-12-14