納米金的制備、表征及應(yīng)用研究

周睿璐， 付大友， 袁　東， 吳永強(qiáng)， 譙康全

(四川理工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院， 四川　自貢　643000)

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納米金的制備、表征及應(yīng)用研究

周睿璐， 付大友， 袁東， 吳永強(qiáng)， 譙康全

(四川理工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院， 四川自貢643000)

納米金材料基于其良好的光學(xué)和電子學(xué)特性，近年來(lái)已成為科學(xué)家們研究的熱點(diǎn)之一。實(shí)驗(yàn)以氯金酸為原料，檸檬酸三鈉為還原劑，采用經(jīng)典的檸檬酸三鈉還原法制備出納米金溶液，利用目測(cè)法、紫外-可見(jiàn)分光光度法和掃描探針顯微鏡法對(duì)其進(jìn)行表征，結(jié)果表明：納米金粒子尺寸均勻、呈球形單分散分布。利用自組裝單分子膜原理，通過(guò)層層組裝將納米金粒子和DNA探針依次固定到玻碳電極表面制備探針電極，利用電化學(xué)工作站檢測(cè)其信號(hào)，結(jié)果表明納米金標(biāo)記DNA探針可顯著增強(qiáng)目標(biāo)DNA的檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度，并使響應(yīng)電流增強(qiáng)。

納米金；金標(biāo)記；DNA

納米金即指金的微小顆粒，直徑一般為1 nm～100 nm，通常以膠體金的形態(tài)存在于水溶液中。納米金的性質(zhì)主要取決于金顆粒的尺寸及其表面特性，當(dāng)金粒子尺寸減小到納米范圍時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出表面效應(yīng)、量子效應(yīng)、宏觀量子隧道效應(yīng)等特性[1]。納米金材料在生物化學(xué)中的應(yīng)用，使其成為當(dāng)今國(guó)際分析科學(xué)領(lǐng)域的前沿[2-3]。納米金的制備一般分為物理法和化學(xué)法。物理法是利用各種技術(shù)將塊狀固體金分散為金納米微粒，包括軟著陸法、真空蒸鍍法及激光消融法等[4-6]?；瘜W(xué)法是以金的化合物為原料，與還原劑反應(yīng)生成金納米微粒，在形成金納米顆粒時(shí)可以通過(guò)控制還原劑的用量來(lái)控制粒子的生長(zhǎng)，使其維持納米尺度，包括溶膠法、晶種生長(zhǎng)法、反膠束法、相轉(zhuǎn)移法及模板法等[7-9]。

基于納米金粒子特殊的性能和應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典的檸檬酸三鈉還原法[10-12]制備了納米金溶液并進(jìn)行了表征；將納米金粒子和DNA探針依次固定到玻碳電極表面制備探針電極，用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的濃度，改善濃度檢測(cè)信號(hào)，提高檢測(cè)的靈敏度。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

氯金酸(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；檸檬酸三鈉、硝酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、殼聚糖、冰乙酸、濃硫酸、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、無(wú)水乙醇(分析純，并購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠)；巰基己醇(分析純，上海靜融生物科技有限公司)；DNA探針、目標(biāo)DNA(上海生物有限公司)；超純水≥18.25 MΩ·cm。

SPA400型多功能掃描探針顯微鏡(日本精工)；UV1100/752型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海奧普勒儀器有限公司)；PHS-4C型精密酸度計(jì)(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)；微量移液器(上海求精生化試劑儀器有限公司)；TWCL-T型磁力攪拌器(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；優(yōu)普系列超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；AS10200B型超聲波清洗機(jī)(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；600D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器儀器有限公司)；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；AR1140型電子天平(梅特勒托利多儀器有限公司)；TDL80-2B型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2納米金溶液的制備

所有玻璃儀器都用3 mol/L的HNO3溶液浸泡24 h，用超純水洗凈，自然晾干備用。

將100 mL新鮮配制的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01%的氯金酸溶液倒入圓底燒瓶，加熱攪拌至溶液沸騰并持續(xù)2 min，加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)反應(yīng)10 min至合成液不再變色，停止加熱，繼續(xù)攪拌，待合成液冷卻至室溫后，放入4 ℃冰箱儲(chǔ)存，以備表征和標(biāo)記應(yīng)用。采用目測(cè)法、紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、掃描探針顯微鏡對(duì)合成的溶液進(jìn)行表征。

1.3玻碳電極的修飾

玻碳電極依次用1.0 mm、0.3 mm、0.05 mm的Al2O3粉末拋光至產(chǎn)生平滑、光亮表面。將電極分別放入HNO3、無(wú)水乙醇、超純水中超聲清洗3 min，在0.5 mol/L的H2SO4溶液中于0.3～0.7 V的電位范圍內(nèi)以50 mV/s的速度掃描，直至得到穩(wěn)定的伏安圖。將電極浸入0.1 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-的PBS緩沖溶液中，使用電化學(xué)工作站測(cè)定其交流阻抗，阻值小于200 Ω即可使用。將10 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的殼聚糖溶液滴至電極表面，自然晾干，制得Chits/GCE電極，將Chits/GCE電極浸入1×10-5mol/L納米金溶液中靜置12 h后用超純水沖洗，制得GNs/Chits/GCE電極。準(zhǔn)確吸取10 μL 1×10-5mol/L的DNA探針溶液滴加在GNs/Chits/GCE電極表面，自然晾干后用超純水沖洗，制得Probe/GNs/Chits/GCE/ssDNA電極；將電極垂直浸入1×10-5mol/L巰基己醇封閉試劑中靜置1 h，取出后用超純水沖洗，完成探針電極制備。將探針電極分別浸入已配制的不同濃度的目標(biāo)DNA溶液中室溫靜置3 h，取出后用超純水沖洗，在0.1 mol/L[Fe(CN)6]3-/4-的PBS緩沖溶液中進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

1.4電化學(xué)檢測(cè)

電化學(xué)檢測(cè)在CHI600D型電化學(xué)工作站進(jìn)行，采用三電極系統(tǒng)，以不同修飾層的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑片電極為輔助電極，在0.1 mol/L[Fe(CN)6]3-/4-的PBS緩沖溶液(pH=7.0)中，用交流阻抗法(EIS)以及循環(huán)伏安法(CV)檢測(cè)玻碳電極電化學(xué)信號(hào)并記錄。

交流阻抗法：初始電位為0.192 V，頻率范圍為105HZ～0.1 HZ，振幅為0.005 V。

循環(huán)伏安法：初始電位為0.4 V，電位范圍為0.8 V～-0.4 V，掃描速度為50 mV/s。

2　結(jié)果與討論

2.1表征結(jié)果

2.1.1目測(cè)分析

納米金溶液在合成過(guò)程中的變色情況為：無(wú)色→淺灰色→深灰色→深紅色→紫紅色→酒紅色→透亮紅色。制備出的納米金溶液顏色透亮、澄清，透明度良好，幾乎沒(méi)有雜質(zhì)顆粒，可初步判斷此溶液為納米金溶液[13]。

2.1.2紫外-可見(jiàn)分光光度分析

將合成液于400～600 nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。主峰寬度較小，合成液的最大吸收峰波長(zhǎng)λmax=521 nm，最大吸光度Amax=0.421，符合納米金溶液吸光特征[14-15]，可確認(rèn)此合成液為納米金溶液。

圖1金納米粒子的可見(jiàn)光吸收光譜圖

2.1.3掃描探針顯微鏡分析

用掃描探針顯微鏡對(duì)合成的納米金溶液進(jìn)行形貌分析，結(jié)果如圖2所示。納米金粒子尺寸均勻、球型狀比率高、分散性較好[22]，粒徑約為80 nm。

圖2金納米粒子的SPM圖

2.2不同修飾層電極的電化學(xué)阻抗圖譜

圖3為不同修飾層電極在0.1 mol/L[ Fe(CN)6]3-/4-的PBS緩沖溶液(pH=7.0)中的電化學(xué)阻抗圖譜。由圖3可知，裸玻碳電極(曲線A)的阻抗約為200 Ω，明顯高于Chits/GCE電極阻抗值(曲線B)，這主要源于Chits表面所擁有的大量荷正電的氨基，有利于帶負(fù)電的電活性物質(zhì)[Fe(CN)6]3-/4-靠近電極表面，促進(jìn)氧化還原電子轉(zhuǎn)移。然而，當(dāng)電極修飾納米金后(GNs/Chits/GCE，曲線C)其阻抗明顯增加，超過(guò)裸玻碳電極的阻抗，這說(shuō)明盡管納米金具有促進(jìn)電子傳遞減小阻抗的能力，但它的負(fù)電性在此占了主導(dǎo)地位，對(duì)電活性物質(zhì)[Fe(CN)6]3-/4-有較強(qiáng)的排斥作用，不利于電極表面氧化還原反應(yīng)的進(jìn)行。在電極表面修飾ssDNA探針后(ssDNA/GNs/Chits/GCE，曲線D)，阻抗值進(jìn)一步增加，影響[Fe(CN)6]3-/4-靠近電極表面的物質(zhì)來(lái)源于ssDNA中帶負(fù)電性的磷酸骨架，它使得電極表面氧化還原反應(yīng)更加難以進(jìn)行。當(dāng)巰基己醇作為封閉劑封閉電極表面后(巰基己醇/ssDNA/GNs/Chits/GCE，曲線E)，電極上物質(zhì)更加致密，阻抗又有較小幅度增大。當(dāng)將濃度為1×10-8mol/L的目標(biāo)DNA溶液修飾在電極上后(目標(biāo)DNA/巰基己醇/ssDNA/GNs/Chits/GCE，曲線F)，負(fù)電性的磷酸骨架量增加，使阻抗值又出現(xiàn)較大幅度的增長(zhǎng)。此電化學(xué)阻抗圖譜為DNA的定性定量檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。

圖3不同修飾層電極的電化學(xué)阻抗譜圖

2.3不同濃度目標(biāo)DNA修飾的玻碳電極的電化學(xué)阻抗圖譜

圖4為巰基己醇/ssDNA/GNs/Chits/GCE電極與不同濃度的目標(biāo)DNA雜交后的電化學(xué)阻抗譜圖。由圖4可知，當(dāng)電極與不同濃度的目標(biāo)DNA雜交后，高頻區(qū)阻抗半徑隨著目標(biāo)物DNA濃度的增大而呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，這主要源于更高濃度的目標(biāo)DNA會(huì)促使電極表面負(fù)電性的磷酸骨架吸附量增多，從而使得[Fe(CN)6]3-/4-平衡電對(duì)向電極表面?zhèn)鬟f電子的能力逐漸減弱，導(dǎo)致電極表面電子傳遞電阻逐漸增大。由圖4可知，在目標(biāo)DNA濃度為1×10-9～1×10-7mol/L的范圍內(nèi)，阻抗增加具有較強(qiáng)的規(guī)律性。

圖4不同濃度的目標(biāo)DNA修飾的玻碳電極的電化學(xué)阻抗圖譜

2.4目標(biāo)DNA濃度-電極阻抗的線性對(duì)數(shù)關(guān)系圖

電化學(xué)阻抗值與目標(biāo)DNA的濃度定量關(guān)系結(jié)果如圖5所示，在目標(biāo)DNA濃度為1×10-9～1×10-7mol/L的范圍內(nèi)，電化學(xué)阻抗值與目標(biāo)DNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程式為Z(Ω)=64.23 LOG[C(mol/L)]+1162.14，相關(guān)系數(shù)R=0.995 56，其中Z(Ω)為電極阻抗值，C(mol/L)為目標(biāo)DNA濃度的負(fù)對(duì)數(shù)值。

圖5目標(biāo)DNA-電極阻抗的線性對(duì)數(shù)關(guān)系圖

2.5不同濃度下目標(biāo)DNA修飾的玻碳電極的循環(huán)伏安圖譜

在用電化學(xué)阻抗法分析電極的基礎(chǔ)上，還采用循環(huán)伏安法進(jìn)一步分析。圖6是測(cè)量濃度分別為1×10-9mol/L、1×10-8mol/L、1×10-7mol/L的目標(biāo)DNA的CV圖。由圖6可知，CV圖中氧化過(guò)程曲線與還原過(guò)程曲線對(duì)稱(chēng)性好，表明體系具有良好的可逆性。值得一提的是，CV峰電流隨目標(biāo)DNA的增加呈現(xiàn)減小趨勢(shì)，且減小的幅度與濃度的負(fù)對(duì)數(shù)具有一定的線性關(guān)系，這也契合了圖4中阻抗與目標(biāo)DNA濃度之間的類(lèi)似關(guān)系，這表明即使運(yùn)用不同的電化學(xué)測(cè)量方法，其待測(cè)物濃度與電化學(xué)信號(hào)之間的關(guān)系也具有一致性。

圖6目標(biāo)DNA修飾的玻碳電極的循環(huán)伏安圖譜

2.6納米金標(biāo)記DNA探針在檢測(cè)目標(biāo)DNA中的作用

為探明納米金標(biāo)記DNA探針在檢測(cè)目標(biāo)DNA中的作用，實(shí)驗(yàn)采用相同的實(shí)驗(yàn)條件和修飾過(guò)程，對(duì)未使用納米金標(biāo)記和使用納米金標(biāo)記的電極在檢測(cè)1×10-8mol/L目標(biāo)DNA時(shí)的電化學(xué)信號(hào)進(jìn)行了比較，結(jié)果見(jiàn)表1。納米金標(biāo)記DNA探針可顯著增強(qiáng)目標(biāo)DNA的檢測(cè)信號(hào)，這與納米金比表面積小、生物相容性好、對(duì)生物探針的吸附力強(qiáng)等特性相關(guān)。

表1　電極修飾情況在檢測(cè)目標(biāo)DNA中的電信號(hào)結(jié)果比較

3　結(jié)束語(yǔ)

通過(guò)采用檸檬酸鈉還原法制備納米金溶液并進(jìn)行表征，結(jié)果表明：納米金粒子尺寸均勻、呈球形單分散分布且分散性較好。通過(guò)層層組裝將納米金粒子和DNA探針依次固定到玻碳電極表面制備探針電極并檢測(cè)其信號(hào)，通過(guò)分析比較發(fā)現(xiàn)，納米金標(biāo)記DNA探針可顯著增強(qiáng)目標(biāo)DNA的檢測(cè)信號(hào)，提高并改善檢測(cè)的靈敏度，使響應(yīng)電流增強(qiáng)。納米金標(biāo)記的DNA探針在生物檢測(cè)分析中具有重大科學(xué)研究?jī)r(jià)值和潛在應(yīng)用價(jià)值。

[1] RAGHURAMAN K,VALERIE R,CATHY C,et al.Nano compatible chemistry toword fabrication of arget-specific gold nanoparticles[J].J Am Chem Soc,2006,128(78):11342-11343.

[2] 陳雪皎.金納米粒子在傳感器中的應(yīng)用探索[D].上海:華東師范大學(xué),2012.

[3] 劉珊娜,葛懷娜,孟繁桐,等.李斯特菌免疫檢測(cè)用膠體金的制備及抗體標(biāo)[J].食品科技,2016,41(1):321-324.

[4] 鐘堅(jiān)海.納米金在化學(xué)傳感器中的應(yīng)用研究[D].福建:福州大學(xué),2010.

[5] 王振寬.功能分子-金納米粒子體系的組裝及應(yīng)用研究[D].遼寧:大連理工大學(xué),2015.

[6] PAOLO P,LUCIA P.Gold nanoparticles protected by fluorinated ligands:Syntheses,properties and applications[J].Journal of Fluorine Chemistry,2015,177:2-10.

[7] 呂碧琪.功能化納米金溶膠的制備及其對(duì)含巰基氨基酸的傳感[D].北京:北京化工大學(xué),2014.

[8] GHODSELAHI T,AGHABABAIE N,MOBASHERI H,et al.Fabrication and characterization and biosensor application of gold nanoparticles on the carbon nanotubes[J].Applied Surface Science,2015,355(15):1175-1179.

[9] ABHISHEK D,RIDHIMA C,NANDITA M,et al.Synthesis of pH sensitive gold nanoparticles for potential application in radio sensitization[J].Materials Science and Engineering:C,2015,55(1):34-41.

[10] 許艷敏.不同粒徑及形貌納米金的制備與催化性能研究[D].河南:鄭州大學(xué),2014.

[11] SOON C,YOUNGSEO M,HYOJONG Y.Finely tunable fabrication and catalytic activity of gold multipod nanoparticles[J].Journal of Colloid and Interface Science,2016,469(1):269-276.

[12] 劉穎沙,李建科,張琳.膠體金制備技術(shù)的改進(jìn)與優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2015,41(11):110-114.

[13] 吳皎,劉亞剛,賈清,等.免疫膠體金技術(shù)在畜禽疫病檢測(cè)中的應(yīng)用和研究進(jìn)展[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào),2005,46(4):46-48.

[14] TURKEVICH J.Colloidal Gold.Part I:Historical and Preparative Aspects,Morphology and Structure[J].Gold Bull,1985,18(3):86-91.

[15] TURKEVICH J.Colloidal Gold.Part II:Colour,Coagulation,Adhesion,Alloying and Catalytic Properties[J].Gold Bull,1985,18(4):125-126.

Preparation, Characterization and Application of Gold Nanoparticles

ZHOURuilu,FUDayou,YUANDong,WUYongqiang,QIAOKangquan

(School of Chemical Engineering, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong 643000, China)

With good optical and electronic properties, nano gold materials have become one of the hot spots in recent years. Nano gold solutions were prepared with chloroauric acid as raw material sodium citrate as reducing agent. Visual method, UV visible spectrophotometric method and scanning probe microscopy were used. The results showed that the gold nanoparticles were spherical and monodisperse. Using self-assembled monolayers principle, gold nanoparticles and DNA probes were fixed to the surface of glassy carbon electrode respectively to make probe electrode. Using electrochemical workstation to detect the signal, the results showed that the detection signal of the target DNA was enhanced and the detection sensitivity was improved, besides, the current response was greatly enhanced.

gold nanoparticle; gold labeling; DNA

2016-03-24

四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(13ZA0123)

周睿璐(1991-)，女，四川自貢人，碩士生，主要從事工業(yè)分析方面的研究，(E-mail)zrl1991808@163.com

1673-1549(2016)03-0014-05

10.11863/j.suse.2016.03.04

O611;O614.123

A