血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)心肌缺血模型大鼠缺血區(qū)血管新生的影響

李蕾，何莉，蘇暢，梁昊，張秋雁，楊漾，謝輝，譚精培

血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)心肌缺血模型大鼠缺血區(qū)血管新生的影響

李蕾，何莉，蘇暢，梁昊，張秋雁，楊漾，謝輝，譚精培

湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

觀察血府逐瘀湯誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）對(duì)心肌缺血模型大鼠缺血區(qū)血管新生的影響，探討其作用機(jī)制。采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支方法制備急性心肌缺血模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、他汀組和血府逐瘀湯低、中、高劑量組。造模后將熒光標(biāo)記的EPCs尾靜脈注射植入模型大鼠體內(nèi)，成模后灌胃給藥，給藥第3日和第7日分別采血，取材缺血壞死部位肉芽組織和肌肉組織，行冰凍切片分析熒光表達(dá)，HE染色觀察樣本壞死病變情況，免疫組化檢測(cè)心肌組織CD106、CD146的表達(dá)，計(jì)數(shù)新生血管數(shù)量，硝酸還原酶法檢測(cè)血清和心肌缺血區(qū)一氧化氮（NO）表達(dá)。與模型組比較，血府逐瘀湯各劑量組均能促進(jìn)EPCs遷移至大鼠心肌缺血區(qū)，提高CD106、CD146的表達(dá)，促進(jìn)心肌缺血區(qū)血管新生，明顯升高血清和心肌組織NO含量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），血府逐瘀湯高劑量組效果最佳。血府逐瘀湯可誘導(dǎo)EPCs促進(jìn)心肌缺血區(qū)血管新生，其作用機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞CD106、CD146表達(dá)及升高血清和心肌組織NO水平有關(guān)。

血府逐瘀湯；內(nèi)皮祖細(xì)胞；血管新生；一氧化氮；大鼠

缺血性心臟?。╥schemic heart disease，IHD）是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起的冠狀動(dòng)脈血流供應(yīng)與心肌需求之間不能平衡所導(dǎo)致的心肌損害。在心肌缺血或梗死早期，毛細(xì)血管密度增加，壞死細(xì)胞釋放一系列促血管生成因子生成新的旁路，改善心肌的缺血狀態(tài)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，在成體血管新生中發(fā)揮著重要作用[1]。在生理或病理因素等刺激下，EPCs從骨髓動(dòng)員到外周血，在體內(nèi)缺血組織中整合形成新生血管的前體細(xì)胞，外源EPCs治療冠心病已從基礎(chǔ)研究推廣至臨床，能明顯改善心肌梗死和介入手術(shù)患者的預(yù)后[2-4]。血府逐瘀湯是治療缺血性心臟病的代表方，近年來(lái)，大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，其具有較好的抗心肌缺血的作用[5]。中醫(yī)祛瘀生新理論是在活血化瘀基礎(chǔ)上的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和深化。其中，抗血小板、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善血液流變等作用屬“祛瘀”之功，而促進(jìn)血管新生則為“生新”之效。EPCs在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將熒光標(biāo)記的EPCs尾靜脈注射植入急性心肌缺血模型大鼠體內(nèi)，探討血府逐瘀湯誘導(dǎo)EPCs參與心肌缺血區(qū)血管新生的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量220～240 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)43004700048705，動(dòng)物許可證號(hào)SYXK（湘）2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度55%～60%，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

血府逐瘀湯（當(dāng)歸9 g，生地黃9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，牛膝9 g，川芎4.5 g，柴胡3 g，赤芍6 g，甘草6 g，桔梗4.5 g），飲片購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，加10倍量水浸泡0.5 h，加熱回流提取1 h，過(guò)濾，第2次加8倍量水，再煮1 h，合并2次煎液，濃縮至含原藥材0.78 g/mL。阿托伐他汀鈣片，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20180605，配制成0.5 mg/mL混懸液。

1.3 主要試劑與儀器

Rat骨髓細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊锟萍加邢薰?，貨?hào)VE2012TARK），EGM-2培養(yǎng)基（瑞士LONZA公司，貨號(hào)CC-3162），NO試劑盒（南京建成生物科技有限公司，貨號(hào)A031-2），CD106一抗（英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)ab134047），CD146一抗（美國(guó)Proteintech公司，貨號(hào)1756-1-AP）。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（湘儀H1650R），全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳匯松PW-812），多功能酶標(biāo)分析儀（深圳匯松MB-530）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞原代分離及培養(yǎng)

大鼠脫頸處死后，分離四肢，剔除周圍肌肉組織，75%酒精浸泡5 min，無(wú)菌平皿中剪開(kāi)骨兩端，2 mL無(wú)菌注射器吸取10%FBS DMEM高糖培養(yǎng)基，反復(fù)沖洗骨髓腔。將所得細(xì)胞懸液過(guò)200目細(xì)胞濾網(wǎng)，400×離心5 min收集細(xì)胞。取新的離心管，依次加入分離液1、分離液2，制成梯度界面，吸管吸取細(xì)胞懸液加于分離液液面上，2000 r/min離心30 min。離心后，離心管中由上至下分為6層，吸管吸取第2層到另一15 mL離心管中，向該離心管中加入5 mL洗滌液，混勻細(xì)胞，1000 r/min離心10 min，棄上清液，吸管吸取培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，收集未貼壁細(xì)胞，換用EGM-2培養(yǎng)基接種于纖維連接蛋白（FN）包被的培養(yǎng)皿中。每3 d換液1次[7]。

2.2 免疫熒光鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞

細(xì)胞培養(yǎng)2周后，用胰酶消化細(xì)胞，接種于FN包被的爬片上，培養(yǎng)過(guò)夜后收集爬片，PBS洗2次；棄PBS后加入4%多聚甲醛，室溫固定20 min；PBS沖洗3次，每次5 min；0.3%TritonX-100通透30 min，再用PBS沖洗3次，每次5 min；用5%BSA 37 ℃封閉1 h；滴加適當(dāng)稀釋的一抗（CD34），4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加100 μL抗兔-IgG標(biāo)記熒光抗體，37 ℃孵育90 min，PBS沖洗3次，每次5 min；90%甘油封片；置于熒光顯微鏡下觀察。

2.3 熒光標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞

胰酶消化EPCs，無(wú)血清EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/管；取2 μL PKH26溶液，用試劑盒自帶稀釋液稀釋至500 μL，重懸細(xì)胞，混勻，37 ℃孵育5 min；加入100 μL血清終止，完全培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次。

2.4 心肌缺血模型建立

大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，行氣管插管，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)，觀察并記錄心電圖變化。于左前第4/5肋間開(kāi)胸，逐層鈍性分離，置入2個(gè)小型拉鉤，向兩邊拉開(kāi)肋骨，暴露心臟，撕開(kāi)心包膜，輕提左心耳，充分暴露肺動(dòng)脈圓錐，以左心耳和肺動(dòng)脈圓錐交界處的左冠狀動(dòng)脈主干為標(biāo)志，用6/0無(wú)創(chuàng)縫合絲線穿過(guò)心耳下緣的心肌淺層，結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支。結(jié)扎后心室壁顏色變暗，心電圖可見(jiàn)ST段抬高伴肢導(dǎo)聯(lián)R波高尖為結(jié)扎成功的標(biāo)志。術(shù)后青霉素肌注連續(xù)3 d，預(yù)防感染。

2.5 分組及給藥

心肌缺血大鼠模型制備后，將“2.3”項(xiàng)下熒光標(biāo)記的EPCs以5×106/mL，尾靜脈注射1 mL細(xì)胞懸液入模型鼠體內(nèi)，并于造模后第2日給藥。大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、他汀組和血府逐瘀湯高、中、低劑量組（中藥高、中、低劑量組）。正常組不施加任何干預(yù)，假手術(shù)組只在左前降支穿線不打結(jié)，模型組給予生理鹽水20 mL/（kg?d）灌胃，他汀組腹腔注射阿托伐他汀混懸液0.3 mg/（kg?d），中藥低、中、高劑量組分別給予血府逐瘀湯藥液3.9、7.8、15.6 g/（kg?d）灌胃，給藥體積20 mL/kg，連續(xù)7 d。

2.6 標(biāo)本采集

給藥第3日和第7日采血，分離血清，置于-20 ℃保存，第7日處死大鼠，開(kāi)胸后取出心臟，取一等份缺血壞死部位肉芽組織和肌肉組織，OCT包埋，冰凍切片，一等份心肌組織，4%多聚甲醛固定液固定，石蠟包埋，制成厚約5 μm組織切片。

2.7 指標(biāo)檢測(cè)

2.7.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移分布檢測(cè)

將樣本用OCT包埋，冰凍切片；將切片置于冰丙酮中固定15 min，蒸餾水水洗；切片置蒸餾水中脫膠30 min；DAPI工作液37 ℃染核10 min，PBS沖洗3次，每次5 min；緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，每個(gè)樣本隨機(jī)選取6個(gè)視野，分析各視野熒光強(qiáng)度，取其均數(shù)作為該樣本的熒光強(qiáng)度。

2.7.2 心肌組織病理觀察

60 ℃烤片1～2 h；將切片置于二甲苯中10 min×2次，然后依次置于100%、 95%、85%、75%梯度乙醇，每級(jí)5 min，再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染色約30 s，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；伊紅染色約30 s，蒸餾水沖洗；梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級(jí)5 min。取出后置于二甲苯中10 min×2次，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

2.7.3 免疫組化檢測(cè)心肌組織CD106、CD146的表達(dá)和血管計(jì)數(shù)

60 ℃烤片30 min；置于二甲苯中10 min×2次，再依次置于100%、95%、85%、75%乙醇，每級(jí)放置5 min，再用蒸餾水浸洗5 min；將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，連續(xù)煮15 min后，冷卻15 min取出，冷卻至室溫，0.01 mol/L PBS（pH 7.2～7.6）洗滌3次，每次3 min；加入3%H2O2，室溫10 min，以滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加適當(dāng)稀釋的一抗（CD106，CD146），4 ℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加50～100 μL抗兔-IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min；滴加預(yù)制好的顯色劑工作液50～100 μL，室溫孵育1～5 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，蒸餾水洗滌；蘇木素復(fù)染10 s左右，蒸餾水沖洗，PBS返藍(lán)；各級(jí)乙醇（60%～100%）脫水，每級(jí)5 min。取出后置于二甲苯10 min，2次，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。陽(yáng)性染色為黃色或棕黃色（深可至褐色）。每張組織切片400倍下攝取6個(gè)視野，運(yùn)用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件對(duì)圖片進(jìn)行分析，計(jì)算相同面積內(nèi)相關(guān)指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度（IOD值）。每個(gè)樣本在400倍鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野計(jì)數(shù)血管，以均值作為該樣本的新生血管數(shù)量。

2.7.4 血清和心肌缺血區(qū)一氧化氮含量測(cè)定

腹主動(dòng)脈取血，離心，取上清液，硝酸還原酶法測(cè)定血清和心肌缺血區(qū)NO含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 血府逐瘀湯對(duì)模型大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞遷移的影響

熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，藍(lán)色是DAPI染核信號(hào)，紅色熒光是EPCs陽(yáng)性染色信號(hào)。與模型組比較，他汀組和中藥低、中、高劑量組紅色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）；他汀組熒光信號(hào)較中藥各劑量組明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組紅色熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。表明血府逐瘀湯能促進(jìn)EPCs遷移至大鼠心肌缺血區(qū)，與藥物濃度呈正相關(guān)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖1。

4.2 病理觀察結(jié)果

正常組和假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊，可見(jiàn)橫紋，細(xì)胞間隙均勻；模型組大鼠可見(jiàn)梗死灶，心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞水腫變性，間質(zhì)變寬，心肌細(xì)胞纖維化，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；中藥低劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞水腫，可見(jiàn)炎性細(xì)胞；中藥中、高劑量組和他汀組大鼠心肌細(xì)胞排列較為規(guī)則，部分細(xì)胞輕度水腫，變性明顯減輕，中藥高劑量組大鼠心肌細(xì)胞變性壞死程度最輕。結(jié)果見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠心肌組織EPCs熒光表達(dá)比較（±s）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△＜0.05，△△＜0.01；與他汀組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◇＜0.05，◇◇＜0.01；與中藥中劑量組比較，◆◆＜0.01

4.3 血府逐瘀湯對(duì)模型大鼠心肌組織CD106、CD146表達(dá)的影響

鏡下觀察顯示，新生血管陽(yáng)性信號(hào)為黃色或棕色染色（深可至褐色）。正常組和假手術(shù)組大鼠心肌組織CD106呈弱陽(yáng)性表達(dá)；模型組可見(jiàn)中等量CD106陽(yáng)性染色，染色稍深；中藥低劑量組和中藥中劑量組大鼠心肌組織CD106陽(yáng)性染色進(jìn)一步加深，可見(jiàn)棕色顆粒；中藥高劑量組和他汀組大鼠心肌組織CD106呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，可見(jiàn)大量棕褐色顆粒，見(jiàn)圖3。CD146在正常組和假手術(shù)組表達(dá)量較少；模型組呈弱陽(yáng)性表達(dá)，散在分布，染色較淺；中藥低劑量組和中藥中劑量組大鼠心肌組織可見(jiàn)中等量CD146陽(yáng)性染色，染色變深，可見(jiàn)很多深棕色顆粒；他汀組可見(jiàn)CD146陽(yáng)性染色，染色進(jìn)一步加深；中藥高劑量組CD146呈強(qiáng)陽(yáng)性染色，陽(yáng)性表達(dá)量明顯高于模型組、中藥低劑量組和中藥中劑量組。見(jiàn)圖4。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，他汀組和中藥中、高劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達(dá)顯著升高（＜0.01）；與他汀組比較，中藥各劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達(dá)明顯下降（＜0.01，＜0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠心肌組織CD106、CD146蛋白表達(dá)比較（±s，IOD值）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△△＜0.01；與他汀組比較，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◇◇＜0.01；與中藥中劑量組比較，◆＜0.05

4.4 血府逐瘀湯對(duì)模型大鼠新生血管數(shù)量的影響

正常組與假手術(shù)組大鼠新生血管數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與正常組比較，模型組大鼠新生血管數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，他汀組和中藥中、高劑量組大鼠新生血管數(shù)量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與他汀組比較，中藥各劑量組大鼠血管數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與中藥低劑量組比較，中藥中、高劑量組大鼠新生血管數(shù)量明顯增加（＜0.01）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組大鼠血管數(shù)量明顯增加（＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表3。

4.5 血府逐瘀湯對(duì)模型大鼠血清和心肌組織一氧化氮含量的影響

正常組與假手術(shù)組大鼠NO含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與正常組比較，模型組大鼠血清和心肌組織NO含量均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與模型組比較，他汀組和中藥中、高劑量組大鼠血清和心肌組織NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）；與他汀組比較，中藥低、中劑量組大鼠血清和心肌組織NO含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05），中藥高劑量組NO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與中藥低劑量組比較，中藥高劑量組NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05），中藥中劑量組NO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與中藥中劑量組比較，中藥高劑量組大鼠血清和心肌組織NO含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 各組大鼠新生血管數(shù)量比較（±s，個(gè)）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△△＜0.01；與他汀組比較，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◇◇＜0.01；與中藥中劑量組比較，◆＜0.05

表4 各組大鼠血清和心肌組織NO含量比較（±s，μmol/L）

注：與正常組比較，##＜0.01；與模型組比較，△△＜0.01；與他汀組比較，▲＜0.05，▲▲＜0.01；與中藥低劑量組比較，◆＜0.05，◆◆＜0.01

5 討論

IHD屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”范疇。血府逐瘀湯是活血化瘀經(jīng)典方。方中桃仁破血行滯而潤(rùn)燥，紅花活血祛瘀以止痛，共為君藥；赤芍、川芎助君藥活血化瘀，牛膝引瘀血下行，使血不郁于胸中，痰熱不上擾。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，既能行血分瘀滯，又能解氣分郁結(jié)；活血不耗血，行氣不傷陰；能夠升達(dá)清陽(yáng)，降泄下行，使氣血調(diào)和。

心肌缺血后會(huì)激發(fā)自身血管新生機(jī)制，毛細(xì)血管密度增加，釋放多種促血管生成因子，形成新的旁路循環(huán)，但仍不足以代償缺血造成的血流損失和使血管恢復(fù)到正常生理功能。因此，盡早恢復(fù)供血，促進(jìn)新的血管生成是修復(fù)損傷的關(guān)鍵所在。

EPCs能增殖和分化成為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，修復(fù)受損傷的內(nèi)皮。通過(guò)對(duì)缺血區(qū)的新生血管數(shù)量進(jìn)行測(cè)定、分析比較發(fā)現(xiàn)，與正常組和模型組比較，中藥各劑量組新生血管數(shù)量明顯增多，中藥高劑量組新生血管數(shù)量最多。對(duì)缺血心肌組織進(jìn)行病理觀察發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組可見(jiàn)大面積梗死灶，心肌細(xì)胞纖維化，間質(zhì)增寬；與模型組比較，中藥高劑量組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列較規(guī)則，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，中藥高劑量組變性程度最輕。提示高劑量血府逐瘀湯能促進(jìn)新的血管生成，保護(hù)和修復(fù)缺血損傷的心肌。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，內(nèi)皮細(xì)胞CD106和CD146呈陽(yáng)性表達(dá)，表明其參與了受損內(nèi)皮的修復(fù)，且隨著給藥濃度的增加，陽(yáng)性表達(dá)率增高，進(jìn)一步證實(shí)其在生理和病理性血管生成中的作用。

血管新生受到眾多信號(hào)調(diào)控，其中NO在調(diào)控體系中發(fā)揮極大作用。NO能動(dòng)員骨髓EPCs釋放進(jìn)入外周血。為進(jìn)一步了解血府逐瘀湯誘導(dǎo)遷移的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)選擇在動(dòng)員EPCs和提高循環(huán)EPCs數(shù)量方面發(fā)揮重要作用的血管舒張因子NO作為切入點(diǎn)，結(jié)果顯示，血府逐瘀湯能提高血清和心肌組織NO含量，結(jié)合相應(yīng)的熒光表達(dá)情況，表明在血府逐瘀湯誘導(dǎo)EPCs遷移至心肌缺血區(qū)，促進(jìn)血管新生，修復(fù)缺血損傷的過(guò)程中，NO可能是發(fā)揮關(guān)鍵作用的因素之一。

綜上，血府逐瘀湯可誘導(dǎo)EPCs促進(jìn)心肌缺血區(qū)血管新生，其作用機(jī)制與促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞CD106、CD146表達(dá)及血清、心肌組織NO水平有關(guān)。

[1] HUR J, YANG H M, YOON C H, et al. Identification of a novel role of T cells inpostnatal vasculogenesis：Characterization of endothelial progenitor cell colonies[J]. Circulation,2007, 116(15)：1671-1682.

[2]CHONG E, POH K K, LIANG S, et al. Two-year clinical registry follow-up of endothelial progenitor cell capture stent versus sirolimus-eluting bioabsorbable polymer-coated stent versus bare metal stents in patients undergoing primary percutaneous coronary intervention for ST elevation myocardial infarction[J]. Journal of Interventional Cardiology,2010,23(2)：101-108.

[3] PEARSON J D. Endothelial progenitor cells-hype or hope?[J]. J Thromb Haemost,2009,7(2)：255-262.

[4] ABDEL-LATIF A, BOLLI R, TLEYJEH I M, et al. Adult bone marrow–derived cells for cardiac repair：A systematic review and meta-analysis[J]. Archives of Internal Medicine,2007,167(10)：989-997.

[5] 王菲,施紅,夏韻.血府逐瘀湯治療心腦血管疾病研究進(jìn)展[J].中醫(yī)學(xué)報(bào),2013,28(11)：1732-1734.

[6] 顧鈺霞,劉乃豐.內(nèi)皮祖細(xì)胞在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病中的作用研究進(jìn)展[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014,33(3)：354-358.

[7] 陸耀良,康濤,李曉強(qiáng),等.大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,23(6)：465-469.

Effects of Endothelial Progenitor Cells Induced byDecoction on Angiogenesis of Ischemic Region in Rats with Myocardial Ischemia

LI Lei, HE Li, SU Chang, LIANG Hao, ZHANG Qiuyan, YANGYang, XIE Hui, TAN Jingpei

To observe the effects of endothelial progenitor cells (EPCs) induced byDecoction on angiogenesis in ischemic region of rats with myocardial ischemia; To explore its mechanism.Acute myocardial ischemia model was prepared by ligating the left anterior descending coronary artery. Experimental rats were randomly divided into normal group, sham-operation group, model group, atorvastatin group,Decoction low-, medium-, and high-dosage groups. After successful modeling, fluorescently labeled EPCs were injected into the model mice by tail vein injection. After modeling, the rats received gavage. On the 3rd and 7th day after administration, blood was collected and the granulation tissue and muscle tissue of the ischemic necrosis were taken. The fluorescence expression was analyzed by frozen section. HE staining was used to observe the necrotic lesions of each group and count the number of local blood vessels. Immunohistochemistry was used to detect the expressions of CD106 and CD146 in neovascularization. NO expression levels in serum and myocardial ischemic areas were determined by nitrate reductase assay.Compared with model group,Decoction groups could promote the migration of EPCs to myocardial ischemia area in rats, increase the expressions of CD106 and CD146, promote angiogenesis in myocardial ischemic area, and significantly increase the NO content in serum and ischemic tissue, with statistical significance (<0.01), and the high-dosage group achieved the best efficacy.Decoction can induce EPCs to promote angiogenesis in myocardial ischemic area. The mechanism of action is related to the promotion of endothelial cell CD106 and CD146, as well as the expression of NO in serum and myocardial tissue.

Decoction; endothelial progenitor cells; angiogenesis; NO; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)02-0069-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202006290

國(guó)家自然科學(xué)基金（81574039、81503627）

張秋雁，E-mail：1746821852@qq.com

（收稿日期：2020-06-15）

（修回日期：2020-07-13；編輯：華強(qiáng)）