自制大容量扣式負壓抽提裝置應用于RNA抽提的性能評價*

莊健海，何　嫻，卓雪芽，鄭文標

(廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗科　528000)

?

·論著·

自制大容量扣式負壓抽提裝置應用于RNA抽提的性能評價*

莊健海，何嫻，卓雪芽，鄭文標

(廣東省佛山市中醫(yī)院檢驗科528000)

目的對自制大容量扣式負壓抽提裝置進行擴增前性能評價。方法采用配套負壓抽提裝置(對照組裝置)和自制大容量扣式負壓抽提裝置(實驗組裝置)對67份白細胞(WBC)大于2.0×109/L的新鮮全血進行核酸(RNA)提取并進行擴增前性能評價，驗證實驗組的工作效率、提取RNA的濃度、純度及完整性。結果67份RNA標本采用對照組裝置69 min完成抽提，處理效率平均為0.97份/分；實驗組裝置41 min完成抽提，效率為1.63份/分。對照組抽提標本RNA濃度為(248.8±21.4)μg/mL，實驗組為(260.3±21.8)μg/mL。對照組抽提標本OD260/OD280和OD260/OD230分別為(1.995±0.095)和(2.020±0.082)，95%CI分別為1.964～2.025和2.001～2.040，實驗組分別為(2.093±0.092)和(2.071±0.120)，95%CI分別為2.075～2.113和2.044～2.103；2組比較差異有統(tǒng)計學意義(t=24.570,P<0.001)，線性回歸方程Y=0.950X+0.039,R2=0.903。2組裝置提取RNA后完整性均較好，電泳條帶整齊、清晰。結論自制大容量扣式負壓抽提裝置具有更高的抽提工作效率，且能保證RNA濃度、純度及完整性，更符合實驗室實際情況，具有更優(yōu)的臨床價值。

負壓抽提裝置；核酸；RNA提取

核酸提取是下游檢測、基因分型的起點，是分子生物學最關鍵的基本方法之一，已經廣泛滲透到生物學、遺傳學、醫(yī)學等各個生命領域。抽提所分離的核酸質量直接影響后續(xù)的檢測效率及準確性，起著承前啟后的關鍵作用[1-3]。

本科室日均處理RNA提取標本量大，使用的配套負壓抽提裝置存在壓力易泄漏，不穩(wěn)定，處理工作效率低，容量小等缺陷。為此現研制一款大容量扣式負壓抽提裝置，通過平行使用配套負壓抽提裝置和自制大容量扣式負壓抽提裝置進行擴增前性能評價，比較兩者工作效率、提取RNA的純度及完整性，為自制裝置的使用提供理論依據。

1　資料與方法

1.1一般資料選取該院已檢測的白細胞(WBC)大于2.0×109/L的新鮮全血67份作為標本，排除嚴重脂濁、溶血、黃疸標本，采用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝。

1.2儀器與試劑

1.1.1RNA抽提的柱式抽提法(1)對照組RNA提取裝置：采用配套的美國AXYGEN公司生產的負壓抽提裝置(型號 AP VM Ⅱ)AP VM Ⅱ 可容納16支柱子。(2)實驗組RNA提取裝置：采用自制大容量扣式負壓抽提裝置。本實驗室從3個方面進行改進：第一，將負壓抽提裝置改為四面蝶形的扣環(huán)，啟動時完全取代人力，也可克服裝置使用時間長后，上下兩部分間隙逐漸加大的弱點。第二，將銜接處改為螺旋接口，支持單個銜接處更換，不用時用螺旋蓋帽封閉，避免因個別泄露導致整個裝置漏壓。第三，將裝置改為8×12陣列形式，容納96支柱子，較市面普遍使用的負壓抽提裝置容納柱量增加6倍以上，完美銜接下游的PCR擴增儀。

1.1.2RNA純度檢測采用eppendorf bioPhotometer plus核酸蛋白測定儀，RNA完整性檢測使用北京六一儀器廠生產的DYY-4C型電泳儀與UVI凝膠電泳成像儀，抽提柱子及抽提試劑由上海科華生物工程股份有限公司提供。

1.3方法將標本3 500 r/mL離心15 min，吸取標本中白細胞層，裝至試管中，再往試管中加入紅細胞溶血素-SYS-SLS，由蘭橋醫(yī)療醫(yī)學科技有限公司提供，比例為1∶5，冰上孵育10 min，期間渦旋振蕩2次，然后4 ℃ 2 100 r/min離心10 min，棄上清液，加入500 μL紅細胞溶血素,重懸沉淀WBC,重復上一步驟，最后加入400 μL配套提取試劑里的裂解液，振蕩重懸沉淀，WBC平均分成2份(A、B)，各200 μL，并分裝至試管，并作編號。所有處理標本的吸頭、吸嘴及試管皆用0.1焦碳酸二乙酯(DEPC)室溫浸泡2 h，無菌水淋洗數次，100 ℃干烤15 min，1.034×105Pa高壓滅菌15 min,備用。

1.4標本RNA提取同時使用對照組裝置和實驗組裝置對67份標本進行RNA抽提，其中A標本使用對照組裝置抽提，B標本使用實驗組裝置。

1.5性能評價(1)提取工作效率：記錄對照組裝置和實驗組裝置完成67份標本RNA抽提所需時間。(2)濃度及純度檢測：標本4倍稀釋后，直接使用eppendorf bioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定標本的OD260、OD260/OD280 及OD260/OD230?？煞謩e反映標本抽提總RNA濃度、蛋白質干擾及有機溶劑殘留情況。(3)完整性檢測：取10 μL提取標本與2 μL上樣緩沖液混勻，點樣于1%瓊脂糖凝膠，0.5 TBE電泳緩沖液環(huán)境下，110 V 恒壓電泳15 min，然后0.5 μg/mL溴化乙錠(EB)染色5 min，最后凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照檢測。

2　結　　果

2.12種裝置工作效率結果比較對照組裝置處理67份RNA標本抽提用時69 min，處理效率平均為0.97份/分；實驗組裝置用時41 min，效率平均為1.63份/分,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.22種裝置RNA濃度及純度檢測結果比較對照組標本檢測OD260為(1.555±0.134)，實驗組為(1.627±0.136)。計算2組RNA濃度分別為(248.8±21.4)μg/mL和(260.3±21.8)μg/mL。對照組OD260/OD280 及OD260/OD230比值分別為(1.995±0.095)和(2.020±0.082),實驗組分別為(2.093±0.092)和(2.071±0.120)。2種裝置抽提RNA濃度比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2種裝置抽提標本RNA蛋白質干擾及有機溶劑殘留，RNA OD260/OD280 95%CI為1.80～2.00，OD260/OD230 95%CI大于2.00。相關性分析顯示，Y=0.950X+0.039,R2=0.903，2組數據相關性良好。

2.32種裝置RNA完整性結果比較凝膠電泳成像系統(tǒng)拍照檢測，電泳結果顯示，2種設備提取的總RNA有2條整齊、清晰條帶(18S、28S)，說明2種設備在RNA提取過程中，RNA降解少，完整性較好，2組完整性均符合要求。見圖1、2。

圖1　　自制裝置提取RNA(A13-A17)

圖2　　配套裝置提取RNA(B13-B17)

3　討　　論

方法學評價通過實驗途徑測定分析方法的技術性能，確認其是否滿足臨床使用要求或驗證是否達到廠家聲明的技術性能指標[4-6]。血液中提取RNA是分子生物學研究中常用的重要實驗技術[7-8]。RNA分子結構極不穩(wěn)定，可受較多因素改變而降解[9-10]。本研究RNA提取采用柱式分離技術[11]。

本研究結果表明，RNA提取工作效率上，對照組裝置為69 min，處理效率平均為0.97份/分；實驗裝置為41 min，平均為1.63份/分，實驗組遠高于對照組。對照組裝置每次只能處理16份標本，當標本大于16份時，需多次處理，67份標本須下柱4次及裝柱5次；實驗組裝置可一次性完成67份標本處理。本實驗室日均處理RNA抽提標本在125份以上，可節(jié)約時間近60 min，提示標本量越大，優(yōu)勢越明顯。使用實驗組裝置降低等待下游檢測時間太長所致的RNA降解風險[12-13]。2組抽提標本RNA濃度結果顯示，對照組裝置為(248.8±21.4)μg/mL，實驗組裝置為(260.3±21.8)μg/mL，實驗組裝置抽提標本RNA濃度較高，差異有統(tǒng)計學意義(t=24.570，P<0.001)。相關性分析表明，Y=0.950X+0.039,R2=0.903，2組數據相關性良好。

OD280nm和OD230nm的吸光度分別代表蛋白質和有機溶劑含量，OD260/OD280和OD260/OD230比值可考察上述物質在RNA進行下游檢測時的干擾程度，即反映抽提的RNA純度[14]。對照組裝置的OD260/OD280和OD260/OD230分別為(1.995±0.095)和(2.020±0.082)，95%CI為1.964～2.025和2.001～2.040;實驗組裝置為(2.093±0.092)和(2.071±0.120)，95%CI分別為2.075～2.113和2.044～2.103，說明2組OD260/OD280的95%CI為1.80～2.00，OD260/OD230的95%CI>2.00，證明2種裝置提取RNA純度均較好，但實驗組裝置的OD260/OD280和OD260/OD230比值較對照組大，純度更好，可能與抽提過程中扣式裝置傳遞和維持負壓更穩(wěn)定有關。RNA完整性分析顯示，2種設備提取的RNA在28S及18S處有2條明顯的條帶，且28S亮度大于18S，說明2種設備在RNA提取過程中，RNA降解少，完整性較好。

綜上所述，實驗組裝置RNA抽提質量稍好于對照組，能保證RNA的濃度、純度及完整性，可在臨床實驗室使用，且工作效率提高較大，解決了負壓抽提裝置普遍存在需借助人手按壓啟動、壓力易泄露、易損壞及柱子容納數量少等缺點，實用性增強，具有更優(yōu)的臨床價值。

[1]劉洪波，劉曉雷，羅小銘．核酸提取方法進展[J]．現代生物醫(yī)學進展，2011，11(16)：3187-3190．

[2]章林華，王豐園．核酸提取方法的改進[J]．放射免疫學雜志，2011，24(5)：591．

[3]張杰，武晶晶，趙飛飛，等．不同溫度和不同放置時間對總 RNA 提取濃度和純度的影響[J]．實驗技術與管理，2013，30(11)：79-82．

[4]辛運超．細菌生物膜RNA提取方法研究[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2015，36(2)：244-246．

[5]何松哲，何慧，陳懿，等．不同保存和處理方式對全血標本總RNA提取的影響[J]．中國微生態(tài)學雜志，2015，27(2)：223-226．

[6]王惠民，王清濤．臨床實驗室管理學[M]．6版.北京：高等教育出版社，2012：68-97．

[7]J·薩姆布魯克,D·W·拉塞爾.分子克隆實驗指南[M].北京:北京科學出版社,2002：516-522.

[8]孟浩，彭貞，王闖，等．血液總RNA提取方法的比較[J]．塔里木大學學報，2014，26(1)：46-49．

[9]Jiang Z,Uboh CE,Chen J,et al.Isolation of RNA from equine peripheral blood cells:comparison of methods[J].Springerplus,2013,2(1):478-479.

[10]邱方，陳子祥，楊清玉，等．不同方法提取血清總RNA的性能評價[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33(4)：457-458．

[11]劉學敏，陳麗茹，馬冬雪，等．丙肝病毒 RNA 提取方法優(yōu)化研究[J]．現代儀器與醫(yī)療，2015，21(5)：50-52．

[12]邱方，陳子祥，楊清玉，等．不同方法提取血清總RNA的性能評價[J]．國際檢驗醫(yī)學雜志，2012，33(4)：457-458．

[13]黃培堂,俞煒源,陳天彌.PCR技術實驗指南[M].北京:北京科學出版社,1998：75-81.

[14]穆龍龍，趙志英，朱立．全血標本保存條件對人總RNA提取效率的影響[J]．北京醫(yī)學，2010，32(10)：837-840．

Performance evaluation of the one self-developed device for transmitting negative pressure in RNA extraction*

ZHUANGJianghai,HEXian,ZHUOXueya,ZHENGWenbiao

(DepartmentofClinicalLaboratory,FoshanTraditionalChineseMedicineHospital,Foshan，Guangdong528000,China)

ObjectiveTo evaluate the self-developed device for transmitting negative pressure with large capacity before propagating.MethodsTotally 67 ribonucleic acid(RNA) of WBC>2.0×109/L fresh whole blood were extracted with the intrinsic device(control) and the self-developed device for transmitting negative pressure with large capacity(test) in parallel.The difference of the performance including efficiency,concentration,purity and integrity of RNA extraction were evaluated between the two groups.ResultsIn 67 specimens of RNA extraction,efficiency,concentration,purity and integrity of the control device were 0.97(portion/minute),(248.8±21.4)μg/mL,(1.995±0.095) (OD260/OD280)，(2.020±0.082) (OD260/OD230),1.964-2.025 (95% confidence interval for mean) (OD260/OD280),2.001-2.040(95% confidence interval for mean) (OD260/OD230) and complete.Those of test device were 1.63 portion/minutes,(260.3±21.8)μg/mL,(2.093±0.092) at OD260/OD280,(2.071±0.120) at OD260/OD230,2.075-2.113 for 95% confidence interval for mean at OD260/OD280,2.044-2.103 for 95% confidence interval for mean at OD260/OD230 and complete.Thetvalue was 24.570 (P<0.001) in pairedt-test,and the linear regression equation wasY=0.950X+0.039,R2=0.903 for the two groups data of RNA concentration.ConclusionThe self-developed device for transmitting negative pressure with large capacity is excellent in the work efficiency,concentration,purity,integrality and of the RNA in extracting.It is better than the intrinsic device in the clinical value for situation of lab.

device for transmitting negative pressure;ribonucleic acid;RNA extraction

廣東省科技廳科枝計劃項目(2013-137-06)。

莊健海，男，主任技師，主要從事臨床免疫及分子生物學研究。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.19.025

A

1673-4130(2016)19-2723-03

2016-03-01

2016-04-23)