LC-MS/MS法測定贛江水中微囊藻毒素的初步研究*

林　芬,邱　偉,劉艷紅,李舒梅,劉大嬌, 程文煒,詹曉民

(贛南醫(yī)學院　1.預防醫(yī)學系；2.2010級預防醫(yī)學專業(yè)，江西　贛州　341000)

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LC-MS/MS法測定贛江水中微囊藻毒素的初步研究*

林芬1,邱偉1,劉艷紅1,李舒梅1,劉大嬌2, 程文煒2,詹曉民2

(贛南醫(yī)學院1.預防醫(yī)學系；2.2010級預防醫(yī)學專業(yè)，江西贛州341000)

目的:建立微囊藻毒素(MC-LR，MC-RR和MC-YR)的固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)分析方法，測定贛江水中微囊藻毒素含量。方法：采集贛江水樣18份，通過固相萃取柱富集凈化，在電噴霧正離子模式下，以多反應監(jiān)測模式采集數(shù)據(jù)，對微囊藻毒素進行定性與定量分析。結果：方法的線性范圍為1.0～20 μg·L-1，線性相關系數(shù)0.999 8～0.999 9，檢出限量為20 ng·L-1，平均回收率為66%～88.73%；相對標準偏差(RSD)為4.11%～12.78%。18份水樣中均未檢出微囊藻毒素，達到《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB5749-2006)。結論：該方法用來測定水中微囊藻毒素，操作快速簡單、干擾少、準確；由于微囊藻毒素受采樣時間、光照和氣溫等因素的影響，應持續(xù)監(jiān)測水樣，以保證贛江水質符合標準。

LC-MS/MS；微囊藻毒素；贛江

微囊藻毒素(Microcystins，Mcs)是由水體中藍綠藻如銅綠微囊藻、魚腥藻等產生的一類具有生物活性的單環(huán)七肽化合物，其中MC-LR、MC-RR和MC-YR是分布最廣，毒性最大的三種微囊藻毒素[1]。贛江是江西省的重要水源，隨著經濟的迅速發(fā)展，工廠數(shù)量急劇增加，農業(yè)和生活用水大量排放使水中的氮磷等有機污染物含量增加，水體富營養(yǎng)化，造成藻類滋生，微囊藻毒素也隨之增加。為了解贛江及鄱陽湖微囊藻毒素的污染狀況，我們采用特異性和靈敏度高的三重四級桿高效液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)測定贛江水中微囊藻毒素的含量，以期為江西省相關管理部門提供理論依據(jù)和決策參考。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑安捷倫1260型快速高分離液相色譜儀和6420型三重四級桿串聯(lián)質譜儀，配有ESI大氣壓電噴霧源，工作站為Agilent Mass Hunter B.06.00；色譜柱：C18反相柱，柱長50 mm，內徑4.6 mm，填料粒徑1.8 μm(美國安捷倫有限公司)；固相萃取裝置(美國SUPELCO 公司)；氮吹儀(美國Organomation Associates 公司);微囊藻毒素標準品(MC-LR、MC-RR、MC-YR) 混標，5 μg·mL-1(美國Sigma 公司)；甲酸:色譜純(上海阿拉丁公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國TEDIE公司)；實驗用水為二次蒸餾超純水；氮氣(純度大于99.999%)。

1.2水樣采集、前處理

1.2.1采樣點的布設及采集根據(jù)贛江的特點，于2015年4月分別在贛江入口前的章江、貢江、贛江起始段以及贛江途經的萬安段、吉安段、南昌段進行采樣，每個采樣點分別采集3份水樣，每份水樣采集2 L，記錄采樣時間、地點、天氣、水溫及pH，并填寫采樣記錄單。

1.2.2水樣的前處理[2]將采集來的水樣用500目的不銹鋼篩過濾，除去水中的懸浮物和一些浮游生物。再取過濾后的水樣1 100 mL于玻璃杯式濾器中，先用47 mm GF-C玻璃纖維濾膜減壓過濾兩次，0.45 μm乙酸纖維酯濾膜減壓過濾一次，準確量取1 000 mL于棕色玻璃瓶中。

1.2.3樣品的制備[2]將依次用10 mL甲醇和15 mL純水活化的C18固相萃取小柱連接到SPE固相萃取裝置，將1 000 mL水樣流經固相萃取小柱，控制流速為5 mL·min-1，對水樣進行富集。再依次用10 mL純水及10 mL 20%的甲醇淋洗小柱，10 mL酸化甲醇進行洗脫，洗脫液在氮吹儀上吹至盡干，殘留物用1mL流動相，渦旋混合，經0.22 μm有機濾膜過濾后，上機待測。

1.3實驗條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Agilent zorbax Eclipse XDB-C18，2.1×50 mm，填料粒徑為1.8 μm；柱溫：25 ℃；流動相A為含0.1%的甲酸水溶液，流動相B為含0.1%的甲酸乙腈溶液；流動相A∶B=60∶40；流動相流速：0.3 mL·min-1；進樣體積為10 μL；采用外標法定量。

1.3.2質譜條件離子源：大氣壓電噴霧離子源(ESI)，采用正離子檢測模式；干燥氣流速：11 L·min-1；干燥氣溫度：350 ℃；霧化氣壓力：35 psi；毛細管電壓：4 000 V；采用多反應離子監(jiān)測模式(MRM)，分別確定三種微囊藻毒素的保留時間、定量離子對、定性離子對、駐留時間、源內裂解電壓、定量離子對碰撞池電壓、定性離子對碰撞池電壓，見表1。

表1　微囊藻毒素-LR的質譜參數(shù)

2　結　果

2.1線性范圍、檢出限、精密度、加標回收率三種微囊藻毒多反應檢測色譜圖見圖1～3，將MC-LR，YR，RR的標準溶液，稀釋濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、20 μg·L-1，將所得的峰面積值Y與濃度X進行線性回歸分析，得到標準曲線，見表2，回歸系數(shù)R2>0.999 8，線性較好。

取空白水樣，分別添加2個濃度水平的3種微囊藻毒素混合標準工作液，每個添加濃度重復6次，計算添加回收率和測定結果的相對標準偏差。水中3種微囊藻毒素的平均回收率為66%～88.73%(表3)；

圖1　微囊藻毒素-RR MRM色譜圖

圖2　微囊藻毒素-YR MRM色譜圖

圖3　微囊藻毒素-LR MRM色譜圖

微囊藻毒素標準曲線相關系數(shù)R2MC?LRy=989．497727X+19．4537030．9999MC?RRy=56．753X+186．430．9998MC?YRy=5844．1X-12．750．9998

相對標準偏差(RSD)為4.11%～12.78%。檢出限是依據(jù)微囊藻毒素標準溶液的信噪比(S/N)為10的條件得出，本法最低檢測限為20 ng·L-1，低于GB/T20466-2006[2]高效液相色譜法的0.1 μg·L-1。由此可見，LC-MS/MS法測定微囊藻毒素，靈敏度及特異度均高，符合國家要求。

表3　不同加標水平下3種微囊藻毒素的回收率和精密度/n=6

2.2樣品中微囊藻毒素的檢測水樣取自2015年4月的贛江及鄱陽湖10個采樣點章江、貢江、贛江起始段、吉安市萬安縣、吉安市青原區(qū)、南昌新建縣10個地區(qū)進行采樣，每個采樣點3份水樣，這18個實際樣品采用優(yōu)化后的實驗條件進行檢測，檢測結果見表4。由表可見6個采樣點采集的18個水樣中均未檢測出微囊藻毒素LR，YR，RR。

表4　贛江水樣中微囊藻毒素檢出情況

注：ND代表未檢出。

3　討　論

3.1質譜條件的優(yōu)化三重四極桿串聯(lián)質譜能夠進行多反應離子監(jiān)測，最大程度上減小基質的干擾，為目標化合物的分析提供高選擇性和高靈敏度[3]。在全掃描的模式下，注射標準溶液找到三種微囊藻毒素的母離子(precursor ion)，在選擇性離子監(jiān)測(SIM)模式下，找到優(yōu)化的源內裂解電壓，在產物離子掃描(product ion scan)模式，找到特征子離子(pmduct ion)，確定離子對(transition)，在MRM模式下，找到每個確定離子對優(yōu)化的CE。LC-MS/MS法能夠滿足水中微囊藻毒素的檢測要求[4]。

3.2結果分析WHO規(guī)定飲用水中微囊藻毒素MC-LR 的限量值為1 μg·L-1[5]。我國《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB 5749-2006)[6]及《地表水環(huán)境質量標準》(GB 3838-2002)[7]中將MC-LR 的標準限值定為1 μg ·L-1。由于微囊藻毒素受到采樣時間、光照和氣溫等因素的影響，具有時間上和空間上的局限性。一般認為微囊藻毒素濃度從高到低的季節(jié)性分布總體表現(xiàn)是夏秋季(6～11月)>春季(3～5月)>冬季(12月、1月、2月)，而本次采樣時間為4月份，采集的水樣中均未檢測到微囊藻毒素，這有可能與采樣期間水體中MC濃度比較低有關；其次是4月份雨水多，采樣點水量充足，對微囊藻毒素存在著一定的稀釋作用，因此只在豐水期采一次樣是不足以反映水中微囊藻毒素污染情況的，應該根據(jù)我國《水環(huán)境監(jiān)測規(guī)范》對具有向城市供水功能的水庫或者湖泊，每月各采樣 1次，分別要采集到豐水期、枯水期、平水期的水樣，在水華特別嚴重的夏秋季節(jié)應加強監(jiān)測力度，增加采集頻數(shù)[8]，才能真正說明水中微囊藻毒素的含量。

雖然此次調查各個采樣點均未檢測出微囊藻毒素，但是尚不能肯定贛江未受到微囊藻毒素污染，建議在監(jiān)測水中微囊藻毒素的三個主要異構體(MC-LR、MC-RR、MC-YR)的同時，對水體富營養(yǎng)化進行評價。此外對贛江及鄱陽湖的水都應進行長期系統(tǒng)的監(jiān)測，以期更加準確有效的評價兩大水體中微囊藻毒素污染狀況，為保護人民群眾的身心健康提供科學的依據(jù)。

[1]DAWSON R M. The toxicology of microcystins[J].Toxicon,1998,36(7): 953-962.[2]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會．GB/T20466-2006中華人民共和國國家標準-水中微囊藻毒素的測定[S]．北京: 中國標準出版社，2006.

[3]WHO. Guidelines for drinking water quality[M].Third edition.Geneva:World Health Organization,2004:407-408.

[4]Amanda J Foss, Aubel Mark T.Using the MMPB technique to confirm microcystin concentrations in water measured by ELISA and HPLC (UV, MS, MS/MS)[J].Toxicon,2015,104:91-101.

[5]欒偉. 液相色譜串聯(lián)質譜法分析飲用水中微囊藻毒素[J].中華預防醫(yī)學雜志，2008，42(5):359-360.

[6]中華人民共和國衛(wèi)生部，中國國家標準化管理委員會．GB 5749-2006中華人民共和國國家標準-生活飲用水衛(wèi)生標準[S]．北京: 中國標準出版社，2006.

[7]國家環(huán)境保護總局，國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.GB3838-2002中華人民共和國國家標準-地表水環(huán)境質量標準[S]．北京: 中國標準出版社，2002.

[8]莊一廷.湖庫型飲用水源地富營養(yǎng)化污染控制研究[J].海峽科學，2007，6:77-79.

The Preliminary Study on the Determination of Three Microcystins in the Ganjiang River by HPLC-MS /MS

LINFen1,QIUWei1,LIUYan-hong1,LIShu-mei1,LIUDa-jiao1,CHENGWen-wei2,ZHANXiao-min2

(1.Dept.ofPreventiveMedicine;2.2010-gradePreventiveMedicineMajorofGannanMedicalUniversity,GanzhouJiangxi341000)

Objective: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric was established for the determination of three microcystins (MC-LR，MC-RR,MC-YR) in the Ganjiang River.Methods: Eighteen samples from the Ganjiang River were enriched and purified by solid phase extraction column, then detected by a high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometer. The identification was achieved by electrospray ionization (ESI) in positive mode using multiple reaction monitoring. Results: The calibration curves of three microcystins showed good linearity in the range of 1～20 μg·L-1, with correlation coefficient in the range of 0.999 8～0.999 99．The detection limit of the method was 20 ng·L-1. The recovery of two spiking levels ranged from 66% to 88.73%，and RSDs ranged from 4. 11% to 12.78%．Microcystins were not detected in 18 samples of the Ganjiang River, showing that the water quality reached "Sanitary Standards for Drinking Water". Conclusion: The method for the determination of microcystins of the Ganjiang River by HPLC-MS /MS was of operation convenience, less interference from impurities and good accuracy. The levels of Microcystins were influenced by sampling time, illumination, and temperature. Therefore, microcystins should be monitored in order to ensure the water quality of the Ganjiang River.

LC-MS /MS;Microcystin;The Ganjiang River

江西省教育廳科技項目，贛教技字[2006]254號；江西省教育廳科技項目(NO：GJJ11209)；贛州市科技局課題，贛市科發(fā)[2005]20號，贛市財教字[2005]33號

李舒梅，女，教授，碩士生導師。E-mail:gnyxylsm@163.com

R123.1

A

1001-5779(2016)03-0347-04

10.3969/j.issn.1001-5779.2016.03.004

2015-10-14)(責任編輯：劉仰斌)