騰格里沙漠沙坡頭地區(qū)土壤微生物多樣性分析

李靖宇，張 琇，孫 敏，張燕靈

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

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騰格里沙漠沙坡頭地區(qū)土壤微生物多樣性分析

李靖宇，張 琇①，孫 敏，張燕靈

(北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

為了揭示沙坡頭沙漠固沙區(qū)與流沙區(qū)不同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)的組成、豐度和多樣性對(duì)沙漠極端環(huán)境的響應(yīng)，采用DNA提取試劑盒提取土壤總DNA，對(duì)細(xì)菌群落編碼16S rRNA的基因(16S rDNA)的V4～V5區(qū)進(jìn)行MiSeq測(cè)序，分析各樣品中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成、豐度以及多樣性指標(biāo)，通過非度量多維尺度(NMDS)法和文氏(Venn)圖解釋微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境的響應(yīng)。固沙區(qū)與流沙區(qū)不同土壤樣品微生物群落在門水平上主要以變形細(xì)菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)為優(yōu)勢(shì)類群。在屬水平上，不同樣品優(yōu)勢(shì)類群差異明顯。11個(gè)樣品在NMDS縱軸方向上按照固沙區(qū)與流沙區(qū)分為2大組，說明微生物類群對(duì)人工固沙做出了環(huán)境響應(yīng)。文氏圖分析結(jié)果表明，盡管不同樣品之間存在一定差異，但存在共有微生物類群，可能在沙坡頭沙漠生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用。藍(lán)細(xì)菌以及根瘤菌在沙生植物固沙過程中對(duì)于提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等生物地球化學(xué)循環(huán)起著重要作用。

微生物群落；極端環(huán)境；沙坡頭沙漠；MiSeq測(cè)序

土地沙漠化面積的迅速擴(kuò)展,造成環(huán)境退化和巨大的經(jīng)濟(jì)損失,使之成為全球廣泛關(guān)注的熱點(diǎn)[1]。沙漠化也是我國(guó)北方干旱、半干旱及部分半濕潤(rùn)地區(qū)由于人地關(guān)系不協(xié)調(diào)所造成的以風(fēng)沙活動(dòng)為主要標(biāo)志的土地退化[2]。我國(guó)沙漠及其邊緣地區(qū)的居民積累了豐富的治沙和沙地開發(fā)利用經(jīng)驗(yàn),建立了“以固為主、固阻結(jié)合、機(jī)械固沙和生物固沙并舉”的防沙體系,開展了騰格里沙漠地區(qū)無灌溉固沙植物種植和綜合防沙體系建設(shè)的開創(chuàng)性工作[1,3]。沙生植物對(duì)我國(guó)北部、西北部荒漠化防治起到了極其重要的作用,是維系沙漠植被生態(tài)系統(tǒng)的重要保障[4-6]。沙生植物有利于土壤養(yǎng)分、水分的保持及土壤的形成、發(fā)育,沙地灌叢具有肥島效應(yīng)[7]。在這個(gè)微環(huán)境中,根系分泌物為微生物提供重要的營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì),其成分和數(shù)量影響著根際微生物的種類和繁殖,根際微生物的代謝作用也影響根際土壤中的物質(zhì)轉(zhuǎn)化[8]。土壤微生物作為生態(tài)系統(tǒng)中重要組分之一,推動(dòng)著生態(tài)系統(tǒng)的能量流動(dòng)和物質(zhì)循環(huán),在維持生態(tài)系統(tǒng)整體服務(wù)功能方面發(fā)揮著重要作用。自然界中可培養(yǎng)的微生物種類僅占微生物總數(shù)的0.1%～10%[9-11]。

依賴于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的核酸分析技術(shù)可檢測(cè)某一基因的整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能群的多樣性信息,在微生物群落結(jié)構(gòu)變化與環(huán)境變化相互作用等諸多領(lǐng)域發(fā)揮著傳統(tǒng)分析方法無可替代的作用[12];特別是高通量測(cè)序技術(shù)的誕生,是基因組學(xué)研究領(lǐng)域一個(gè)具有里程碑意義的事件,在揭示微生物基因信息方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了克隆文庫(kù)所涵蓋的信息量,正是這種前所未有的能夠更加真實(shí)反映環(huán)境中微生物組成技術(shù)的應(yīng)用極大地推動(dòng)了人們對(duì)微生物生態(tài)學(xué)的認(rèn)識(shí)[13]。筆者以寧夏中衛(wèi)市沙坡頭沙區(qū)土壤為研究對(duì)象,試圖在沙漠科學(xué)研究中引入高通量測(cè)序技術(shù),對(duì)沙生植物根際土壤微生物多樣性進(jìn)行深入探討。

1 材料與方法

1.1 樣點(diǎn)位置與樣品采集

研究區(qū)域設(shè)在騰格里沙漠東南緣的寧夏中衛(wèi)市沙坡頭地區(qū)(37°32′ N,105°02′ E)。該地區(qū)年均氣溫10.0 ℃,低溫極值-25.1 ℃,高溫極值38.1 ℃,全年日照時(shí)數(shù)3 264 h,1956—2012年年均降水量186.2 mm,年潛在蒸發(fā)量3 000 mm,年均風(fēng)速2.9 m·s-1,年均沙暴天數(shù)59 d[14]。

沙漠土壤樣品按流沙區(qū)(A系列)與固沙區(qū)(B系列)分別取樣,土壤類型以風(fēng)沙土為主[15],于2014年10月3日采集土壤樣品,按5點(diǎn)法隨機(jī)選取沙生植物根系0～30 cm深度土壤,輕輕抖落根表面的土壤作為根際土壤樣品[16]。A系列包括無植被對(duì)照組A0以及不同植被A1、A2、A3和A4這5個(gè)樣品,其中A1植被為細(xì)枝巖黃芪(Hedysarumscoparium)，A2為沙蓬(Agriophyllumsquarrosum),A3為百花蒿(Stilpnolepiscentiflora),A4為霧冰藜(Bassiadasyphylla);B系列包括固沙區(qū)不同植被B1、B2、B3、B4這4個(gè)樣點(diǎn)以及不同于A系列沙生植物的樣點(diǎn)(記為B5和B6),其中B1植被為細(xì)枝巖黃芪，B2為沙蓬,B3為百花蒿,B4為霧冰藜,B5為刺沙蓬(Salsolatragus),B6為中間錦雞兒(Caraganaintermedia),具體信息見表1。

表1 不同樣點(diǎn)的基本信息

Table 1 Basic information of the sampling sites

樣點(diǎn)編號(hào)緯度經(jīng)度植被A037.473351°N105.009560°E無A137.473358°N105.009598°E細(xì)枝巖黃芪A237.473328°N105.009560°E沙蓬A(yù)337.473301°N105.009254°E百花蒿A437.473301°N105.009554°E霧冰藜B137.471161°N105.011795°E細(xì)枝巖黃芪B237.471138°N105.011765°E沙蓬B337.471176°N105.011841°E百花蒿B437.471230°N105.012001°E霧冰藜B537.471161°N105.011564°E刺沙蓬B637.470989°N105.012184°E中間錦雞兒

樣品A系列為流沙區(qū)，B系列為固沙區(qū)。

1.2 樣品基因組總DNA提取

沙漠土壤樣品微生物DNA參照E. Z. N. A.?Soil DNA Kit提取試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U. S.)的說明書進(jìn)行提取。

1.3 16S rDNA V4～V5區(qū)Illumina MiSeq測(cè)序

PCR采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA聚合酶,20 μL反應(yīng)體系:2.0 μL 2.5×10-3mol·L-1脫氧核苷酸(dNTPs),0.8 μL 0.5×10-5mol·L-1515F引物(5′-GTG CCA GCM GCC GCG G-3′),0.8 μL 0.5×10-5mol·L-1907R引物(5′-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3′),4.0 μL 5×FastPfu 緩沖液,10 ng模板以及 0.4 μL Fast Pfu聚合酶,最后加雙蒸水(ddH2O)到20 μL。

反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸 45 s,27個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行20 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳,使用AXYGEN 公司的AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物,Tris-HCL洗脫;使用Promega公司的QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。將每個(gè)樣品等比例混合,然后根據(jù)Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行雙端測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

Miseq測(cè)序得到的是雙端序列數(shù)據(jù),首先根據(jù)雙端讀長(zhǎng)(paired-end reads,PE reads)之間的重疊關(guān)系,將成對(duì)的讀長(zhǎng)(reads)拼接(merge)成一條序列,同時(shí)對(duì)讀長(zhǎng)的質(zhì)量和拼接的效果進(jìn)行質(zhì)控過濾,根據(jù)序列首尾兩端的條形碼(barcode)和引物序列區(qū)分樣品得到有效序列,并校正序列方向。過濾讀長(zhǎng)尾部質(zhì)量值20以下的堿基,設(shè)置50 bp的窗口,如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20,從窗口開始截去后端堿基,過濾質(zhì)控后50 bp以下的讀長(zhǎng);根據(jù)雙端讀長(zhǎng)之間的重疊關(guān)系,將成對(duì)讀長(zhǎng)拼接成一條序列,最小重疊長(zhǎng)度為10 bp;拼接序列的重疊區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2,篩選不符合序列;根據(jù)序列首尾兩端的條形碼和引物區(qū)分樣品,并調(diào)整序列方向,條形碼允許的錯(cuò)配數(shù)為0,最大引物錯(cuò)配數(shù)為2;且去掉包含模糊堿基的序列。

用UPARSE(version 7.1,http:∥drive5.com/uparse/)軟件聚類生成操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),相似度為97%。再用UCHIME軟件鑒別嵌合體序列,并將之去除。用silva (SSU115) 16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分類學(xué)比對(duì),算法為RDP Classifier (http:∥rdp.cme.msu.edu/),置信閾值為70%。根據(jù)BOWEN等[17]的研究結(jié)果,將相對(duì)豐度大于1%的類群作為優(yōu)勢(shì)類群。使用97%相似度的OTUs,利用mothur軟件做稀釋性曲線(rarefaction)分析,利用R語言工具制作曲線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)概況

為了比較流沙區(qū)和固沙區(qū)不同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)的差異,試驗(yàn)共設(shè)計(jì)取樣11個(gè)土壤樣品,通過高通量測(cè)序16S rDNA V4～V5區(qū)獲得微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。根據(jù)YOUSSEF等[18]報(bào)道,V4～V5區(qū)序列對(duì)微生物多樣性的估計(jì)與全長(zhǎng)16S rDNA序列得到的微生物多樣性最接近。因此,選擇V4～V5區(qū)序列進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析,共獲得有效序列416 372條,其中A0包含31 064條,A1包含43 650條,A2包含44 993條,A3包含35 080條,A4包含32 638條,B1包含42 796條,B2包含37 590條,B3包含41 707條,B4包含35 100條,B5包含30 672條,B6包含41 082條,平均長(zhǎng)度為396 bp。為了得到更高質(zhì)量的優(yōu)化序列,根據(jù)UPAESE軟件聚類,在聚類過程中會(huì)有單條序列和部分嵌合體被去除[19]。最后A0包含18 999條,A1包含29 740條,A2包含20 909條,A3包含21 198條,A4包含19 531條,B1包含26 707條,B2包含23 630條,B3包含23 657條,B4包含20 375條,B5包含17 392條,B6包含31 335條?；赨PAESE軟件處理后的更高準(zhǔn)確度的序列進(jìn)行后續(xù)的稀釋性曲線、OTUs聚類等分析。根據(jù)稀釋性曲線(圖1),測(cè)序深度基本可以真實(shí)反映沙漠環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的實(shí)際情況。

樣品A系列為流沙區(qū)，B系列為固沙區(qū)。A0為無植被對(duì)照；A1、B1植被為細(xì)枝巖黃芪；A2、B2為沙蓬；A3、B3為百花蒿；A4、B4為霧冰藜；B5為刺沙蓬；B6為中間錦雞兒。

2.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的組成、豐度與多樣性

OTUs分析表明,在相似性為0.97水平上,A0樣品包含1 418個(gè)OTUs,A1包含1 263個(gè)OTUs,A2包含1 564個(gè)OTUs,A3包含1 481個(gè)OTUs,A4包含1 515個(gè)OTUs,B1包含1 574個(gè)OTUs,B2包含1 115個(gè)OTUs,B3包含1 328個(gè)OTUs,B4包含1 286 個(gè)OTUs,B5包含1 368個(gè)OTUs,B6包含1 679個(gè)OTUs(表2)。

由圖2可見,在門水平上,主要涵蓋了變形細(xì)菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、浮霉?fàn)罹T(Planctomycetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、Armatimonadetes、綠菌門(Chlorobi)、異常球菌-棲熱菌門(Deinococcus-Thermus)、硝化刺菌門(Nitrospirae)和疣微菌門(Verrucomicrobia)。其中,變形細(xì)菌門、放線菌門、酸桿菌門和藍(lán)細(xì)菌門為優(yōu)勢(shì)類群。從A0到B6的11個(gè)樣品中,變形細(xì)菌門的相對(duì)豐度為20.30%～39.77%，放線菌門的相對(duì)豐度為10.69%～38.90%，酸桿菌門的相對(duì)豐度為4.13%～19.61%，藍(lán)細(xì)菌門的相對(duì)豐度為0.09%～29.44%。

表2 不同樣點(diǎn)細(xì)菌群落的豐度和多樣性指數(shù)

Table 2 Richness and diversity index of bacterial community relative to sampling sites

樣點(diǎn)編號(hào)讀長(zhǎng)平均長(zhǎng)度/bp 操作分類單元距離覆蓋度/%Chao1指數(shù)ACE指數(shù)辛普森指數(shù)香農(nóng)指數(shù)A018999396 14180.0398.0473171917120.02105.53A129740396 12630.0398.9610148615360.01315.34A226909396 15640.0398.5470187418810.01565.62A321198395 14810.0398.1319184018120.01635.58A419531395 15150.0398.0032184818290.01035.91B126707396 15740.0398.5772186618830.01295.70B223630396 11150.0398.7601141413710.02205.18B323657396 13280.0398.6854160015730.01255.68B420375396 12860.0398.4098155015650.01445.64B517392396 13680.0398.0221163416490.00935.86B631335396 16790.0398.8767193119260.01155.80

樣品A系列為流沙區(qū)，B系列為固沙區(qū)。A0為無植被對(duì)照；A1、B1植被為細(xì)枝巖黃芪；A2、B2為沙蓬；A3、B3為百花蒿；A4、B4為霧冰藜；B5為刺沙蓬；B6為中間錦雞兒。

樣品A系列為流沙區(qū)，B系列為固沙區(qū)。A0為無植被對(duì)照；A1、B1植被為細(xì)枝巖黃芪；A2、B2為沙蓬；A3、B3為百花蒿；A4、B4為霧冰藜；B5為刺沙蓬；B6為中間錦雞兒。

在屬水平上,不同樣品優(yōu)勢(shì)類群差異明顯。其中A0優(yōu)勢(shì)類群為微枝形桿菌屬(Microvirga)(11.66%)和微鞘藻屬(Microcoleus)(7.37%);A1優(yōu)勢(shì)類群為諾卡氏菌屬(Nocardioides)(13.66%)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)(4.63%)、微枝形桿菌屬(4.22%)、博斯氏菌屬(Bosea)(4.04%)和新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)(4.01%);A2優(yōu)勢(shì)類群為諾卡氏菌屬(10.01%)、節(jié)細(xì)菌屬(4.78%)和微枝形桿菌屬(4.08%);A3優(yōu)勢(shì)類群為微枝形桿菌屬(9.00%)、博斯氏菌屬(5.84%)、微鞘藻屬(5.43%)和Rubellimicrobium(5.08%);A4優(yōu)勢(shì)類群為微枝形桿菌屬(7.64%)、博斯氏菌屬(4.35%)、諾卡氏菌屬(3.42%)、Rubellimicrobium(3.08%)和微鞘藻屬(3.04%);B1優(yōu)勢(shì)類群為微鞘藻屬(5.91%)、微枝形桿菌屬(5.25%)、博斯氏菌屬(3.34%)和席藻屬(Phormidium)(3.31%);B2優(yōu)勢(shì)類群為微鞘藻屬(11.13%)、Blastocatella(10.51%)和微枝形桿菌屬(3.42%);B3優(yōu)勢(shì)類群為諾卡氏菌屬(8.74%);B4優(yōu)勢(shì)類群為馬西亞菌屬(Massilia)(4.73%)、Bryobacter(3.12%)和德沃斯氏菌屬(Devosia)(3.06%);B5優(yōu)勢(shì)類群為諾卡氏菌屬(4.08%);B6優(yōu)勢(shì)類群為微鞘藻屬(5.40%)、微枝形桿菌屬(4.82%)和席藻屬(3.13%)。

多樣性指數(shù)Chao1、Ace是生態(tài)學(xué)中估計(jì)物種總數(shù)的常用指數(shù)。從A0到B6的11個(gè)樣品中,Chao1指數(shù)范圍為1 414～1 931，Ace指數(shù)范圍為1 371～1 926,結(jié)果基本一致。辛普森指數(shù)是用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)之一,其值越大,說明群落多樣性越低。從A0到B6的11個(gè)樣品中,其指數(shù)范圍為0.009 3～0.022 0。香農(nóng)指數(shù)是用來估算樣品中微生物多樣性的指數(shù)之一,它與辛普森多樣性指數(shù)常用于反映alpha多樣性指數(shù),其值越大,說明群落多樣性越高,從A0到B6的11個(gè)樣品中,其指數(shù)范圍為5.18～5.91(表2)。

2.3 流沙區(qū)與固沙區(qū)植物根際微生物群落的比較

在流沙區(qū)設(shè)置A1～A4這4個(gè)樣點(diǎn),固沙區(qū)設(shè)置B1～B4這4個(gè)樣點(diǎn),其中A1與B1、A2與B2、A3與B3、A4與B4植被類型相同,對(duì)其根際土壤微生物多樣性進(jìn)行分析比較,結(jié)果見圖2。流沙區(qū)與固沙區(qū)相同植被根際微生物群落有明顯差異,這種差異主要體現(xiàn)在某些種群的相對(duì)豐度上。在屬的水平上,其優(yōu)勢(shì)類群差異較為明顯。

A1與B1在優(yōu)勢(shì)類群上的差異主要體現(xiàn)在:節(jié)細(xì)菌屬,A1相對(duì)豐度為4.63%,B1為1.15%;微鞘藻屬,A1相對(duì)豐度為0%,B1為5.91%;諾卡氏菌屬,A1相對(duì)豐度為13.66%,B1為0.96%;新鞘氨醇桿菌屬,A1相對(duì)豐度為4.01%,B1為0.30%;席藻屬,A1相對(duì)豐度為2.80%,B1為2.11%。

A2與B2在優(yōu)勢(shì)類群上的差異主要體現(xiàn)在:節(jié)細(xì)菌屬,A2相對(duì)豐度為4.78%,B2為0.06%;Blastocatella,A2相對(duì)豐度為0.36%,B2為10.51%;微鞘藻屬,A2相對(duì)豐度為0.01%,B2為11.13%;諾卡氏菌屬,A2相對(duì)豐度為10.01%,B2為0.16%。

A3與B3在優(yōu)勢(shì)類群上的差異主要體現(xiàn)在:節(jié)細(xì)菌屬,A3相對(duì)豐度為3.42%,B3為0.94%;博斯氏菌屬,A3相對(duì)豐度為5.84%,B3為0.30%;微鞘藻屬,A3相對(duì)豐度為5.43%,B3為0.03%;微枝形桿菌屬,A3相對(duì)豐度為8.96%,B3為1.89%;諾卡氏菌屬,A3相對(duì)豐度為0.83%,B3為8.74%;Rubellimicrobium,A3相對(duì)豐度為5.08%,B3為0.05%。

A4與B4在優(yōu)勢(shì)類群上的差異主要體現(xiàn)在:節(jié)細(xì)菌屬,A4相對(duì)豐度為2.94%,B4為0.20%;博斯氏菌屬,A4相對(duì)豐度為4.35%,B4為2.55%;Bryobacter,A4相對(duì)豐度為1.20%,B4為3.12%;馬西亞菌屬,A4相對(duì)豐度為0.63%,B4為4.73%;微鞘藻屬,A4相對(duì)豐度為3.04%,B4為0.79%;微枝形桿菌屬,A4相對(duì)豐度為7.64%,B4為2.80%;諾卡氏菌屬,A4相對(duì)豐度為3.42%,B4為0.84%;Rubellimicrobium,A4相對(duì)豐度為3.08%,B4為0.57%。

為了進(jìn)一步說明流沙區(qū)和固沙區(qū)相同植被根際微生物群落的差異,設(shè)置了無植被流動(dòng)沙丘作為對(duì)照組。以高通量測(cè)序數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),通過文氏圖反映流沙區(qū)和固沙區(qū)相同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)的差異,并發(fā)現(xiàn)這些相似環(huán)境中的“核心微生物群落”[20]。分析可知,在OTUs組成上,A0、A1、B1之間既有共同的微生物類群,也存在不同的微生物類群。A0、A2、B2,A0、A3、B3,A0、A4、B4情況相似。由圖3可以看出,沙漠環(huán)境中,植被根際微生物類群差異明顯,無植被與有植被情況下微生物類群差異明顯,固定沙丘和流動(dòng)沙丘微生物類群差異明顯。在沙漠這種極端環(huán)境中,微生物群落變化較大,但核心類群較為明顯,它們可能在生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著重要的作用。

數(shù)值表示可操作分類單元(OTUs)數(shù)。

2.4 流沙區(qū)與固沙區(qū)不同樣品微生物群落的聚類分析

非度量多維尺度(NMDS)法是一種將多維空間的研究對(duì)象(樣本或變量)簡(jiǎn)化到低維空間進(jìn)行定位、分析和歸類,同時(shí)又保留對(duì)象間原始關(guān)系的數(shù)據(jù)分析方法。該方法的特點(diǎn)是根據(jù)樣本中包含的物種信息,以點(diǎn)的形式反映在多維空間上,而對(duì)不同樣本間的差異程度,則通過點(diǎn)與點(diǎn)間的距離體現(xiàn),最終獲得樣本的空間定位點(diǎn)圖。由圖4可知,11個(gè)不同樣品在NMDS縱軸方向上基本分為2大類,即固沙區(qū)與流沙區(qū)2大組,這與實(shí)際情況相符,說明微生物類群對(duì)人工固沙做出了環(huán)境響應(yīng)。

樣品A系列為流沙區(qū)，B系列為固沙區(qū)。A0為無植被對(duì)照；A1、B1植被為細(xì)枝巖黃芪；A2、B2為沙蓬；A3、B3為百花蒿；A4、B4為霧冰藜；B5為刺沙蓬；B6為中間錦雞兒。

3 討論

沙漠生態(tài)系統(tǒng)蒸發(fā)量大于降水量,日溫差變化劇烈,土壤中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏,嚴(yán)酷的自然條件限制了許多植物的生存,只有為數(shù)不多的超旱生植物稀疏分布,生物種類多樣性低,群落結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,自動(dòng)調(diào)節(jié)能力差,干旱的限制使荒漠生態(tài)系統(tǒng)成為地球上各類生態(tài)系統(tǒng)中生產(chǎn)力最低、最脆弱的生態(tài)系統(tǒng)之一。那么,微生物群落在這個(gè)脆弱的生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著怎樣的作用?筆者從解析微生物群落結(jié)構(gòu)入手,采用宏基因組學(xué)技術(shù)手段最大限度地反映環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況。研究采用MiSeq測(cè)序技術(shù),針對(duì)沙坡頭沙漠流沙區(qū)和固沙區(qū)不同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行了深度測(cè)序,11個(gè)土樣分別獲得17 392～31 335條高質(zhì)量序列，覆蓋度數(shù)據(jù)表明測(cè)序結(jié)果基本可以反映土壤樣品微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)情況。沙坡頭沙漠土壤中微生物多樣性較高,類群豐富。流沙區(qū)和固沙區(qū)相同植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)和組成差異明顯。文氏圖分析結(jié)果表明,盡管不同樣品之間存在一定的差異,但是存在共有微生物類群;共有微生物類群可能在沙漠生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用,差異微生物類群可能是由于流沙與固沙的狀態(tài)不同等因素造成的。盡管微生物類群存在明顯差異,但在較大尺度上,流沙區(qū)樣品相似性較高,聚為1類;固沙區(qū)樣品相似性較高,聚為1類。NMDS分析結(jié)果間接表明流沙與固沙過程對(duì)微生物類群結(jié)構(gòu)影響明顯;根際環(huán)境隨著土壤類型、植物種類和生育階段存在很大的時(shí)空變異性。

微生物的分布、多樣性和群落組成差異主要取決于環(huán)境和生物因素[21-23]。在大的空間尺度上,微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤變量密切相關(guān),如土壤pH值[24-25]和含水量[26]。在局部尺度上,植物群落通過根際交互作用來影響土壤微生物群落[27-28]。干旱環(huán)境中,細(xì)菌的多樣性被認(rèn)為是由非生物因素(如溫度的劇烈變化、紫外線的強(qiáng)烈輻射、土壤含水量和營(yíng)養(yǎng)差)以及生物因素(如植物的豐度和物種組成[12])所影響。在營(yíng)養(yǎng)貧乏的沙漠土壤中,植物不僅提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的棲息地,還會(huì)進(jìn)一步對(duì)土壤微生物施加選擇性的影響[12]。在水和養(yǎng)分有限的環(huán)境中,肥島效應(yīng)假說認(rèn)為,由于營(yíng)養(yǎng)物在根和土壤界面處的積累,根際細(xì)菌多樣性應(yīng)大于根圍[12]。筆者的測(cè)序結(jié)果表明,流沙區(qū)無植被土壤樣品的微生物多樣性同樣很高,不同樣品微生物群落組成和多樣性的差異主要源于不同植物根際土壤?？赡懿煌参飳?duì)微生物群落結(jié)構(gòu)以及組成存在較大的選擇性影響,在較大的尺度上體現(xiàn)在固沙區(qū)與流沙區(qū)相同植物根際微生物群落間的差異。LIU等[29]報(bào)道古爾班通古特沙漠微生物群落的空間分布與沙丘地貌相關(guān)。由此推測(cè),沙坡頭沙漠中流沙區(qū)與固沙區(qū)不同植被根際土壤微生物類群差異明顯,除了與不同植物的屬性相關(guān)外,主要與沙丘的地貌密切相關(guān)。此外,在荒漠生態(tài)系統(tǒng),各種物理擾動(dòng)可能會(huì)顯著影響土壤微生物群落的時(shí)空分布,如沙埋、動(dòng)物踐踏和野火焚燒[29]。

沙坡頭沙漠微生物群落組成在門的水平上以變形細(xì)菌門、放線菌門、酸桿菌門、藍(lán)細(xì)菌門為優(yōu)勢(shì)類群,11個(gè)樣品在門水平上組成相似;這與CRITS-CHRISTOPH等[30]報(bào)道的智力阿塔卡馬沙漠優(yōu)勢(shì)類群以放線菌門(72%～88%)最多,其次為酸桿菌門(3.8%～6.6%)和變形細(xì)菌門(2.2%～9.2%)的組成相似。但沙坡頭沙漠與阿塔卡馬沙漠優(yōu)勢(shì)類群的豐度存在差異,主要體現(xiàn)在沙坡頭沙漠以變形細(xì)菌門為主要優(yōu)勢(shì)類群,阿塔卡馬沙漠以放線菌門為主要優(yōu)勢(shì)類群。阿塔卡馬沙漠在副熱帶高氣壓帶下沉氣流、離岸風(fēng)和秘魯寒流綜合影響下,成為世界最干燥的地區(qū)之一;我國(guó)的沙漠大多數(shù)分布于干旱區(qū),屬中溫帶典型的大陸性氣候,是干旱氣候與豐富沙源條件下的產(chǎn)物[1]。分析認(rèn)為,大環(huán)境的不同造成微生物群落結(jié)構(gòu)的組成和優(yōu)勢(shì)類群的相對(duì)豐度不同,這也說明了微生物群落結(jié)構(gòu)的生境異質(zhì)性,特別是沙坡頭沙漠藍(lán)細(xì)菌門類群的出現(xiàn),更體現(xiàn)出這2種環(huán)境的差異。

在屬水平上,沙坡頭不同樣品優(yōu)勢(shì)類群差異明顯,這種差異主要體現(xiàn)在博斯氏菌屬、德沃斯氏菌屬、馬西亞菌屬、微枝形桿菌屬、新鞘氨醇桿菌屬、Rubellimicrobium(變形細(xì)菌門);節(jié)細(xì)菌屬、諾卡氏菌屬(放線菌門);Blastocatella、Bryobacter(酸桿菌門);席藻屬、微鞘藻屬(藍(lán)細(xì)菌門)。其中博斯氏菌屬和微枝形桿菌屬屬根瘤菌(Rhizobiales)目,與固氮密切相關(guān)[31]。博斯氏菌屬的一些種能夠氧化還原態(tài)的無機(jī)硫化合物,有的能以CO2作為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)[32],這些生理生化特性對(duì)于營(yíng)養(yǎng)貧瘠的沙漠環(huán)境具有重要的意義。來自于土壤生物結(jié)皮的Microvirgasp. BSC39的基因組測(cè)序結(jié)果表明,其具有趨化和胞外多糖合成能力,有利于生物膜的形成[33]。Microvirgalotononidis是最近被描述的一個(gè)根瘤菌菌種,能夠有效地進(jìn)行固氮,具有一些與其他根瘤菌不同的性狀,含有色素,且能夠在45 ℃高溫條件下生長(zhǎng)[34]。藍(lán)細(xì)菌是一類進(jìn)化歷史悠久、革蘭染色陰性、無鞭毛、含葉綠素和藻藍(lán)素(但不形成葉綠體)、能進(jìn)行產(chǎn)氧性光合作用的大型原核微生物。此外,許多絲狀藍(lán)細(xì)菌在缺乏無機(jī)氮化合物(如硝酸鹽或銨鹽)的極端寡營(yíng)養(yǎng)條件下,能夠形成異形胞,進(jìn)行固氮作用[35]。藍(lán)細(xì)菌是自然界中生態(tài)適應(yīng)范圍最廣的一類生物。各種鹽度、各種溫度、各種壓力下都有藍(lán)細(xì)菌的存在[36]。藍(lán)細(xì)菌通常作為沙漠生態(tài)系統(tǒng)的先鋒和土壤生物結(jié)皮的優(yōu)勢(shì)類群,成為最初的生產(chǎn)者,固定碳并增加土壤有機(jī)物質(zhì),通過提供和再循環(huán)關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)后續(xù)維管植物的生長(zhǎng),且在這些生態(tài)系統(tǒng)的氮平衡過程中發(fā)揮重要作用[37]。具鞘微鞘藻(Microcoleusvaginatus)是藍(lán)藻門中一種廣泛分布的陸生絲狀藻類,同時(shí)也是荒漠干旱地區(qū)藻結(jié)皮的優(yōu)勢(shì)物種,作為荒漠植被演替過程中的先鋒拓殖生物,具鞘微鞘藻能在條件極其惡劣的環(huán)境下生長(zhǎng)、繁殖,并利用藻絲體對(duì)沙粒的捆綁、黏結(jié)作用使松散的沙面形成一個(gè)有機(jī)的整體,增強(qiáng)荒漠土壤表面的團(tuán)聚力,對(duì)藻結(jié)皮的形成和發(fā)育過程產(chǎn)生重要的生態(tài)學(xué)效應(yīng)[38-39]。

致謝: 感謝內(nèi)蒙古大學(xué)趙利清教授對(duì)沙生植物鑒定給予的無私幫助。

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(責(zé)任編輯： 許 素)

Analysis of Soil Microbial Diversity in Shapotou Area of Tengger Desert.

LI Jing-yu, ZHANG Xiu, SUN Min,ZHANG Yan-ling

(College of Biological Science & Engineering， Beifang University of Nationality， Yinchuan 750021， China)

Community composition, abundance and diversity of soil microbe in different vegetation rhizospheres and their responses to desert extreme environments in an artificial sand fixed area and a natural bare sand area in the Shapotou Desert, were studied. In the study, soil total DNA was extracted with the aid of the E.Z.N.A.?Soil DNA Kit, V4-V5 sections of the 16S rDNA of the soil bacterial community analyzed with a MiSeq pyrosequencer for community composition， abundance and diversity of the soil bacteria, and responses of the soil microbial community in structure to changes in environment explained with the NMDS and Venn diagrams. In the soil samples, no matter from which area, Proteobacteria, Actinobacteria, Acidobacteria and Cyanobacteria were dominant groups in the soil microbial community on the phylum level, while the soil samples from the two different areas differed sharply in dormancy of groups on the genus level. The 11 soil samples were divided into two groups along the vertical axis of the NMDS in accordance with the artificial sand fixed area and the natural bare sand area, indicating that the microbial community responded to changes in the environment, i.e. sand fixation. The Venn diagram analysis indicates that although some differences are found between different soil samples,groups of microbes common in the two groups of soil samples exist and are thought to play a core role in the Shapotou Desert ecosystem. Cyanobacteria and Rhizobia are the two species of soil microbes that play an important role in biogeochemical cycling, like providing nutrients to psammophytes in sand-fixing process.

microbial community; extreme environment; Shapotou Desert; MiSeq sequencing

2015-09-24

北方民族大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(44/4400302502)；寧夏自然科學(xué)基金(NZ15098)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31460212)

X172；Q93

A

1673-4831(2016)05-0780-08

10.11934/j.issn.1673-4831.2016.05.014

李靖宇(1986—),男,內(nèi)蒙古包頭人,講師,博士,從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail: lijingyu1986@126.com

① 通信作者E-mail： zhangxiu101@aliyun.com