甜菜堿在提高血清乳酸脫氫酶活性穩(wěn)定性中的作用

虞嘯炫，歐元祝，唐立萍，劉文彬，林斐然，葛丹紅，龔敬凱，朱宇清

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是臨床常用的生化酶學(xué)指標(biāo)，在心、腦、肝、腎等器官損傷疾病中起重要的輔助診斷作用。酶蛋白屬于大分子化合物，很難被直接測(cè)定，因此臨床一般通過(guò)測(cè)定反應(yīng)速度，間接推算出酶濃度。盡管目前我國(guó)大多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室采用速率法檢測(cè)LDH，但不同廠商生產(chǎn)的試劑的緩沖液成分、樣本和試劑用量比例、檢測(cè)程序等都不太一致，因此檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)一定的差異。為了使LDH測(cè)定結(jié)果在不同臨床實(shí)驗(yàn)室之間有可比性，開(kāi)展LDH測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化工作勢(shì)在必行。但不論是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，還是正確度控制品的研制都存在LDH的穩(wěn)定性問(wèn)題。由于LDH有5種同工酶（LDH1～LDH5），分布在不同組織中，且5種同工酶在不同溫度下表現(xiàn)出的穩(wěn)定性不一致，導(dǎo)致LDH具有“冷變性”的特征。因此，血清LDH活性的穩(wěn)定性是亟待解決的問(wèn)題。甜菜堿（又稱三甲基甘氨酸）是一種在自然界中廣泛存在的滲透劑。有研究結(jié)果顯示，甜菜堿對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有一定的穩(wěn)定作用[1-2]。原因可能是甜菜堿可使溶液表面張力增大，并使蛋白質(zhì)優(yōu)先發(fā)生水合作用，在兩者的共同作用下使蛋白質(zhì)在熱力學(xué)上的變性過(guò)程難以進(jìn)行[3]。本研究擬通過(guò)研究甜菜堿對(duì)LDH穩(wěn)定性的影響，找出甜菜堿穩(wěn)定LDH的最適條件，為L(zhǎng)DH標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和正確度控制品的研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 血清樣本來(lái)源

血清樣本均為海軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床檢測(cè)后的剩余樣本。

1.2 儀器和試劑

LDH同工酶采用SPIFE 3000蛋白電泳分析儀（美國(guó)Helena Laboratories公司）及配套試劑檢測(cè)。LDH總活性檢測(cè)采用L-乳酸向丙酮酸鹽轉(zhuǎn)化過(guò)程中NAD被還原為NADH的方法，試劑盒購(gòu)自瑞士羅氏公司，檢測(cè)儀器為7180全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。甜菜堿化學(xué)原料購(gòu)自美國(guó)西格瑪公司（CAS：107-43-7）。

1.3 方法

1.3.1 血清樣本中甜菜堿的添加量 （1）5 mol/L甜菜堿溶液的配制。稱取117.15 g甜菜堿化學(xué)原料，溶解于200 mL超純水中，攪拌至全部溶解，混勻后2～8 ℃保存。（2）血清樣本中甜菜堿的添加量及保存條件。收集18份不同LDH濃度（LDH為100～500 U/L）的新鮮血清樣本，分成5組，第1組為6份不添加甜菜堿溶液的血清樣本，分成2批，第1批2～8 ℃保存，每份樣本分裝4支，每支200 μL；第2批-20 ℃保存，每份樣本分裝4支，每支200 μL；第2組3份血清樣本按樣本∶甜菜堿溶液（V∶V）9∶1配制（甜菜堿為0.5 mol/L），與第1組一樣分成2批保存；第3組3份血清樣本按樣本∶甜菜堿溶液（V∶V）8∶2配制（甜菜堿為1 mol/L），與第1組一樣分成2批保存；第4組3份血清樣本按樣本∶甜菜堿溶液（V∶V）7.5∶2.5配制（甜菜堿為1.25 mol/L），與第1組一樣分成2批保存；第5組3份血清樣本按樣本∶甜菜堿溶液（V∶V）6∶4配制（甜菜堿為2 mol/L），與第1組一樣分成2批保存。

1.3.2 LDH同工酶電泳分析及LDH總活性檢測(cè) 第1組6份不添加甜菜堿溶液的樣本在保存前先進(jìn)行LDH同工酶電泳分析和LDH總活性檢測(cè)，將該檢測(cè)結(jié)果作為后續(xù)保存的對(duì)照結(jié)果（基線值），隨后將分裝樣本分別保存于2～8 ℃和-20 ℃，4周后取出，進(jìn)行LDH同工酶電泳分析和LDH總活性檢測(cè)。第2～5組添加不同比例甜菜堿溶液的血清樣本在保存前先進(jìn)行LDH同工酶電泳分析和LDH總活性檢測(cè)，將該檢測(cè)結(jié)果作為后續(xù)保存的對(duì)照結(jié)果（基線值），隨后將分裝樣本分別于2～8 ℃和-20 ℃保存，4周后取出，進(jìn)行LDH同工酶電泳分析和LDH總活性檢測(cè)。計(jì)算所有添加甜菜堿溶液的樣本的LDH活性回收率結(jié)果。根據(jù)基線結(jié)果，分析2種保存溫度下LDH同工酶電泳分析與LDH總活性的變化。

2 結(jié)果

2.1 添加不同比例甜菜堿溶液的血清樣本的LDH活性回收率結(jié)果

第2組、第3組、第4組血清樣本的LDH總活性回收率為98.36%～101.41%。第5組血清樣本的LDH總活性回收率為95.16%～103.48%，有1份樣本的偏移高于我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（WS/T 403-2012）規(guī)定的偏差（4.0%），因此后續(xù)研究中排除第5組血清樣本。見(jiàn)表1。

表1 添加不同濃度甜菜堿的血清樣本的LDH總活性回收率

2.2 不同保存溫度下LDH同工酶電泳分析結(jié)果和LDH總活性的變化

2.2.1 各組血清樣本2～8 ℃保存后LDH總活性的變化 第1～4組血清樣本分別于2～8 ℃保存7、21和30 d后，檢測(cè)LDH總活性。第1組血清樣本未添加甜菜堿溶液，保存7 d后的LDH總活性為基線值的74.87%～81.23%；隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，LDH總活性逐漸降低，保存30 d后僅為基線值的52.31%～59.95%。第2～4組添加不同濃度甜菜堿溶液的血清樣本，LDH總活性均較穩(wěn)定，是基線值的98.54%～101.64%，檢測(cè)結(jié)果的變化率≤1.60%。見(jiàn)表2。

表2 各組血清樣本2～8 ℃保存不同時(shí)間LDH總活性相對(duì)于基線值的變化 %

2.2.2 各組血清樣本-20 ℃保存后LDH總活性的變化 檢測(cè)第1～4組血清樣本分別于-20 ℃保存21、30和45 d后LDH總活性。未添加甜菜堿溶液的第1組血清樣本保存21 d后的LDH總活性是基線值的88.78%～91.57%，且隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)，LDH總活性逐漸降低，保存45 d后的LDH總活性是基線值的83.69%～87.42%。添加不同濃度甜菜堿溶液的第2～4組血清樣本保存21 d后LDH總活性急劇下降，僅為基線值的56.14%～65.34%。見(jiàn)表3。

表3 各組血清樣本-20 ℃保存不同時(shí)間LDH總活性相對(duì)于基線值的變化 %

2.2.3 各組血清樣本-20 ℃保存30 d后LDH同工酶的變化 LDH同工酶電泳分析結(jié)果顯示，與保存前的基線值比較，-20 ℃保存30 d，LDH同工酶中LDH1、LDH2比例升高，LDH3比例接近基線值，LDH4、LDH5比例為0。由于第2～4組血清樣本保存后的LDH同工酶變化基本一致，因此僅列出第2組血清樣本的LDH同工酶變化，見(jiàn)表4。

表4 第2組血清樣本-20 ℃保存30 d后LDH同工酶的變化%

3 討論

由于LDH具有“冷變性”的特性，所以會(huì)嚴(yán)重影響樣本的保存和運(yùn)輸。歐元祝等[4]的研究結(jié)果顯示，甜菜堿在不同保存溫度下對(duì)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶均有較好的穩(wěn)定效果。因此，本研究對(duì)甜菜堿在血清LDH穩(wěn)定性中的作用進(jìn)行了探討。

本研究結(jié)果顯示，未添加甜菜堿溶液的血清樣本2～8 ℃保存30 d后，LDH總活性僅為基線值的52.31%～59.95%，而添加不同濃度（0.5～1.25 mol/L）甜菜堿溶液的血清樣本LDH總活性是基線值的98.54%～101.64%。提示甜菜堿對(duì)LDH具有良好的穩(wěn)定作用，為后續(xù)LDH正確度控制品的研制奠定了基礎(chǔ)。未添加甜菜堿溶液的血清樣本在-20 ℃保存21 d后，LDH的總活性是基線值的88.78%～91.57%，但添加0.5～1.25 mol/L甜菜堿的血清樣本LDH總活性僅為基線值的56.14%～65.34%。由此可見(jiàn)，血清樣本添加甜菜堿后保存于-20 ℃，LDH反而不穩(wěn)定。JACBOS等[5]對(duì)血清LDH同工酶在25、4和-20 ℃條件下保存45 d后的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示，LDH1在3種溫度下均穩(wěn)定，而其他4種LDH同工酶在4 ℃時(shí)穩(wěn)定性均較差，由此得出LDH具有“冷變性（4 ℃）”的特征。本研究對(duì)添加甜菜堿的血清樣本在-20 ℃保存后LDH同工酶的變化進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，-20 ℃保存30 d后，LDH同工酶中LDH1、LDH2比例升高，LDH3比例接近基線值，LDH4、LDH5比例為0。由于LDH總活性下降至基線值的44.78%～60.11%，LDH3就算接近基線值，也難以避免總活性下降幅度大于LDH1和LDH2。根據(jù)LDH活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書和同工酶電泳試劑說(shuō)明書的聲明，LDH活性檢測(cè)和電泳分析后顯色均屬于同一反應(yīng)原理，說(shuō)明電泳后無(wú)法顯色的LDH同工酶在酶活性檢測(cè)中也無(wú)法被檢測(cè)到，而在活性檢測(cè)中能被檢測(cè)到的LDH在電泳分析中也必定會(huì)顯色。由此可見(jiàn)，-20 ℃保存30 d后LDH總活性降低，有可能是5個(gè)LDH同工酶的活性均降低，但相對(duì)而言，LDH1和LDH2在-20 ℃下的穩(wěn)定性優(yōu)于LDH3、LDH4、LDH5。

綜上所述，用于LDH檢測(cè)的血清樣本添加甜菜堿溶液后，在2～8 ℃至少可穩(wěn)定30 d。該時(shí)間段足夠完成1次LDH正確度驗(yàn)證計(jì)劃。如選擇-20 ℃作為樣本保存和運(yùn)輸溫度，為了使樣本對(duì)LDH活性檢測(cè)的影響程度降至最低，一方面應(yīng)盡可能選擇LDH1及LDH2較高的樣本（LDH1和LDH2主要存在于人體心肌、腎、紅細(xì)胞中），另一方面還需將樣本在-20 ℃保存21 d以上，讓LDH3、LDH4和LDH5失去活性，從而使LDH總活性穩(wěn)定在一定水平。另外，由于目前商品化LDH檢測(cè)試劑的原理基本已按國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)公布的LDH參考方法（乳酸氧化為丙酮酸）進(jìn)行了調(diào)整，因此本研究?jī)H證明了從乳酸向丙酮酸方向反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)中甜菜堿對(duì)LDH穩(wěn)定性的作用。由于沒(méi)有LDH逆反應(yīng)方法（丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸）的試劑，因此未進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)將進(jìn)一步研究。