液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留量

王興進(jìn)

(寧德市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所， 寧德 352100)

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液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留量

王興進(jìn)

(寧德市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)所， 寧德 352100)

樣品在酸性條件下通過(guò)加入鄰硝基苯甲醛實(shí)現(xiàn)衍生化，乙酸乙酯萃取，濃縮，以乙腈∶水(20∶80)定容和正己烷除脂后，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留量。該方法中4種硝基呋喃代謝物在1～50μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9971，定量限均為0.5μg/kg。4個(gè)添加水平(1μg/kg、2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg)的平均回收率在89.3%～106%之間，相對(duì)偏差均小于7.03%。結(jié)果表明該方法滿足黃魚鲞中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)要求。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法硝基呋喃代謝物黃魚鲞

大黃魚作為我國(guó)傳統(tǒng)的食用魚類，具有獨(dú)特競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，是我國(guó)八大優(yōu)勢(shì)出口養(yǎng)殖水產(chǎn)品品種之一。近年來(lái)由于活魚運(yùn)輸困難以及大黃魚制品(如黃魚鲞等)等相對(duì)口味較好，加上傳統(tǒng)飲食習(xí)慣以及產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，現(xiàn)在黃魚鲞等產(chǎn)品的銷量不斷增加。但是養(yǎng)殖過(guò)程中魚藥乃至禁藥的濫用，導(dǎo)致了養(yǎng)殖海域的連片污染，嚴(yán)重影響了大黃魚的質(zhì)量安全，直接影響了大黃魚及其制品(如黃魚鲞等)的出口。

硝基呋喃類藥物是一類人工合成的具有廣效性的抗菌藥物，目前較為廣泛使用的硝基呋喃類藥物有：:呋喃唑酮(FZD)、呋喃它酮(FTD)、呋喃西林(NFZ)和呋喃妥因(NFT), 其對(duì)應(yīng)的代謝物分別為:3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基-嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)和1-氨基-2-內(nèi)酰脲(A HD)。因這類藥物價(jià)格低廉且療效性強(qiáng)，因此常被用于畜禽及水產(chǎn)的養(yǎng)殖過(guò)程。當(dāng)人類攝入了含有硝基呋喃類藥物殘留的食品后，代謝物在胃液的酸性條件下從蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)被人體吸收，從而對(duì)人體造成一定的傷害，長(zhǎng)期食入此類食品會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生慢性毒性和致突變致癌的危險(xiǎn)[1-4]。因此，世界各國(guó)均嚴(yán)禁在治療和飼料中使用，美國(guó)FDA于2002年禁止了硝基呋喃類藥物在食品動(dòng)物中的使用，歐盟和日本也同樣禁止在食品動(dòng)物中使用，我國(guó)農(nóng)業(yè)部也于2002年發(fā)布了第193號(hào)公告，將硝基呋喃類抗菌劑列入了《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其他化合物清單》，明確禁止了硝基呋喃類藥物在食用動(dòng)物中的使用。

目前，硝基呋喃代謝產(chǎn)物殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[4-6]、酶聯(lián)免疫法(ELISA)[3,4]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[4,7]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)[2,4,8，9]檢測(cè)。其中ELISA法一般用于藥物殘留的定性分析，實(shí)現(xiàn)藥物殘留的初步篩查，無(wú)法滿足定量要求，而高效液相色譜法(HPLC)和液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)方法的靈敏度和選擇性都較液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)差，無(wú)法滿足歐盟EEC/657/2002標(biāo)準(zhǔn)和日本、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家對(duì)我國(guó)出口動(dòng)物源性食品檢測(cè)要求。關(guān)于硝基呋喃代謝物的測(cè)定研究報(bào)道大多限于禽獸肉、鮮水產(chǎn)品等的檢測(cè)[7-10]，對(duì)于黃魚鲞中硝基呋喃代謝物檢測(cè)的報(bào)道相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)在酸性條件下通過(guò)加入2-硝基苯甲醛實(shí)現(xiàn)衍生化，乙酸乙酯兩次萃取，正己烷除脂，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)，同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)黃魚鲞中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)分析。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑1.1.1儀器設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Aglient 1290-6460)：配帶Jet Stream的電噴霧離子源(ESI)；高速組織搗碎機(jī)(德國(guó)IKA公司)；旋轉(zhuǎn)濃縮儀(上海亞榮)；Milli-Q超純水設(shè)備(美國(guó)Millipore公司)；漩渦混合器(德國(guó)IKA公司)；，恒溫振蕩器(常州國(guó)華)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；微孔濾膜為0.2μm。

1.1.2試劑與材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純；甲酸：≥99%；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀(均為分析純)；鄰硝基苯甲醛：≥99%，鄰硝基苯甲醛溶液用乙腈溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配；配制溶液的水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液均用甲醇配制，-18℃避光保存(有效期6個(gè)月)；工作液用時(shí)用儲(chǔ)備液稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱取2g(精確至0.01g)試樣于50mL塑料離心管中，加入10mL 甲醇-水混合溶液(1+1，V+V)，超聲5 min后，5000r/min離心，棄去上清液。殘留物中加入10mL 的0.2mol/L鹽酸溶液，均質(zhì)1min，再用5mL鹽酸溶液洗滌均質(zhì)器刀，合并鹽酸溶液，再加入0.2 mL的0.01mg/L的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.1 mL的0.1mol/L的鄰硝基苯甲醛溶液，漩渦混勻器混勻，置于37℃恒溫箱中避光反應(yīng)16h。

取出衍生液，冷卻至室溫后，加入1.5mL0.3mol/L磷酸鉀溶液，用1.0mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至7.4左右，加入15mL乙酸乙酯渦旋混合1min后，渦旋提取1min后，離心，收集乙酸乙酯層。殘留物再加入15mL乙酸乙酯，超聲萃取10min，合并兩次的提取液，于40℃下氮?dú)獯蹈?。?.00mL乙腈∶水(20∶80)溶液定容，再加入3mL乙腈飽和的正己烷去除脂肪，下層水相過(guò)0.2μm濾膜供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定[11]。

1.3儀器條件1.3.1質(zhì)譜條件

離子源：帶鞘氣電噴霧離子源(ESI)；毛細(xì)管電壓：4.00kV；離子源溫度：110℃；干燥氣溫度：300℃；干燥氣流量：8L/min；鞘氣溫度：250℃；鞘氣流速：12L/min；碰撞氣：氮?dú)?；多反?yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM),其它質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

1.3.2色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus(2.1mm×50mm，1.8μm)；流速：0.3mL/min；柱溫：30℃；樣品室溫度：10℃；進(jìn)樣量：10μL；流動(dòng)相：溶劑A為0.1%甲酸水，溶劑B為乙腈，流動(dòng)性梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表1　硝基呋喃代謝物及其內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)

表2　液相色譜梯度洗脫程序

2　結(jié)果與討論

2.1質(zhì)譜條件的優(yōu)化

硝基呋喃4種代謝物(AOZ、 AMOZ、 SEM、 AHD)分子結(jié)構(gòu)中均含有氨基，在電離情況下容易獲取正電荷，因此選擇正離子模式進(jìn)行掃描。在正離子檢測(cè)方式下，先對(duì)各化合物進(jìn)行全掃描，以確定四個(gè)化合物的母離子，再采用子離子掃描，得到碎片離子信息和二級(jí)質(zhì)譜圖。同時(shí)對(duì)碎裂電壓和碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，使得母離子和特征子離子強(qiáng)度達(dá)到最大，確定的最佳質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

由于基質(zhì)效應(yīng)的影響，在采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí)，目標(biāo)化合物會(huì)發(fā)生離子增強(qiáng)或抑制的作用。因此，本方法通過(guò)添加內(nèi)標(biāo)的方式來(lái)減弱離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，分別采用D5-AMOZ、13C3-AHD、13C15N2-SEM、 D4-AOZ作為內(nèi)標(biāo)定量，從而使定量結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.2色譜條件的優(yōu)化

比較了兩種不同流動(dòng)相乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水對(duì)目標(biāo)物的分離度和靈敏度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，4種代謝物的衍生物可得到較好的分離和響應(yīng)。確定的最佳的色譜參數(shù)見(jiàn)表2。

2.3方法驗(yàn)證2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

在確定的色譜和質(zhì)譜條件下， 4 種硝基呋喃代謝物在 1.0 ng/mL～ 50 ng/mL(內(nèi)標(biāo)物濃度為4ng/mL)范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9971，見(jiàn)表3。以3倍信噪比(S/N)計(jì)算4種硝基呋喃代謝物的檢出限為0.2 μg/kg，以10倍信噪比確定其定量限為0.5μg/kg。4種硝基呋喃代謝物衍生物的MRM譜圖見(jiàn)圖1。

表3　種硝基呋喃代謝物的線性方程與相關(guān)系數(shù)

2.3.2回收率及精密度

選取咸香大黃魚和醉香大黃魚兩種黃魚鲞進(jìn)行回收率及精密度實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確稱取空白黃魚鲞樣品2.00g，分別添加1μ g/kg、2μ g/kg、5μ g/kg及10μ g/kg 4個(gè)濃度的硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及2μ g/kg的內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中不同添加量的重復(fù)樣品數(shù)為6。按照本實(shí)驗(yàn)建立的方法測(cè)定添加樣品中硝基呋喃類代謝物的殘留量。計(jì)算平均回收率和相對(duì)偏差,結(jié)果見(jiàn)表4。從表4中可以看出，4種硝基呋喃代謝產(chǎn)物的平均回收率在89.3%～106%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于7.1 %。表明該方法完全滿足硝基呋喃類藥物的檢測(cè)要求。

表4　4種硝基呋喃代謝物的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.4實(shí)際樣品檢測(cè)

采用已建立的方法對(duì)市場(chǎng)上采集的60份黃魚鲞樣品進(jìn)行硝基呋喃代謝物殘留量的檢測(cè)分析，結(jié)果表明， 57份硝基呋喃代謝物均未檢出，3份樣品檢出SEM，但是檢出值均小于定量限(0.5μg/kg)。

3　結(jié)論

研究了采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)黃魚鲞中的硝基呋喃代謝物產(chǎn)物的殘留量，并進(jìn)行了方法學(xué)評(píng)價(jià)，結(jié)果表明該方法的回收率為89.3%～106%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7.1% ，檢出限均為0.5μg/kg。本方法可有效用于黃魚鲞中硝基呋喃代謝物殘留的檢測(cè)。

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Determination of nitrofuran metabolites residues in dried salted yellow croakers by HPLC-MS/MS.

Wang Xingjin

(NingdeQualityInspectionInstituteofProduct,Ningde352100,China)

The samples were derived with 2-nitrobenzaldehyde in hydrochloric acid solution. After extracted with ethyl acetate and concentrated with rotary evaporator,the analytes were dissolved with acetonitrile solution (CH3CN:H2O=20:80), defatted with n-hexane and determined by LC-MS/MS. The results showed that the calibration curves for the analytes exhibited good linearity over the concentration range from 1 to 50 μg/L with the LOQ of 0.5μg/kg . Average recoveries for the spiked samples at 4 levels (1μg/kg, 2μg/kg, 5μg/kg, 10μg/kg) ranged from 89.3% to 106%, with a RSD less than 7.03%. The method is suitable for the determination of nitrofurans metabolites in dried salted yellow croakers.

HPLC-MS/MS; nitrofuran metabolites;dried salted yellow croakers

福建省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局科技項(xiàng)目(FJQI2013112)

王興進(jìn)，男，1970年出生，學(xué)士，高級(jí)工程師，主要從事食品質(zhì)量控制和衛(wèi)生檢測(cè)，E-mail: quikenter@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.004

2016-05-14