絞股藍(lán)多糖保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡

宿彥峰，齊波

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院體育教學(xué)部，河南新鄉(xiāng)453000；2.中南大學(xué)體育教研部，湖南長沙410083）

絞股藍(lán)多糖保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡

宿彥峰1，齊波2，*

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院體育教學(xué)部，河南新鄉(xiāng)453000；2.中南大學(xué)體育教研部，湖南長沙410083）

為研究絞股藍(lán)多糖（GMP）對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響。采用大鼠力竭運(yùn)動(dòng)模型，將32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組：安靜對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)力竭對(duì)照組、絞股藍(lán)多糖低劑量組+運(yùn)動(dòng)力竭組，絞股藍(lán)多糖高劑量組+運(yùn)動(dòng)力竭組；采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)，對(duì)各組大鼠肝組織Bax/Bcl-2比值與肝組織細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行分析；采用以分光光度法檢測(cè)肝臟主要抗氧化酶活性與丙二醛（MDA）含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)多糖后能使力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織Bax的表達(dá)減弱、Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)、Bax/Bcl-2比值降低；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）活性增加；MDA含量降低。絞股藍(lán)多糖對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肝組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

絞股藍(lán)多糖；力竭運(yùn)動(dòng)；氧化應(yīng)激；肝細(xì)胞；凋亡

研究表明，力竭運(yùn)動(dòng)過程中機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，當(dāng)所產(chǎn)生的自由基超過機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力，則使機(jī)體處于氧化應(yīng)激（Oxidative stress，OS）狀態(tài)。機(jī)體在OS狀態(tài)下對(duì)核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)等生物大分子物質(zhì)均可產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)肌肉、心血管等損傷，甚至引起細(xì)胞凋亡或壞死。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞應(yīng)答不同有害刺激或疾病而發(fā)生的一種特殊的細(xì)胞自殺行為。通過這種細(xì)胞自殺行為，機(jī)體消除損傷、衰老、突變的細(xì)胞，以維持生理平衡[1]。力竭運(yùn)動(dòng)可加速機(jī)體的物質(zhì)代謝和能量代謝，并使機(jī)體處于缺血、缺氧狀態(tài)，引起ATP減少、自由基增多、Ca2+濃度改變、線粒體結(jié)構(gòu)及功能變化等，導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[2]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因有兩類，包括促進(jìn)基因和抑制基因。Bcl-2基因家族是目前最受重視的調(diào)控細(xì)胞凋亡的基因家族，屬于一類新的癌基因家族[3]，Bcl-2和Bax是凋亡調(diào)節(jié)基因Bcl-2家族的兩個(gè)重要成員。許多研究表明Bcl-2是抑制凋亡的主要基因，Bax是促凋亡基因，它們和其家族成員共同構(gòu)成了復(fù)雜的相互作用的網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4]。目前，力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及其引起的細(xì)胞凋亡在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域備受關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

絞股藍(lán)干品：購于湖南藥材公司（長沙），粉碎后過60目篩備用；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、過氧化氫酶（CAT）、丙二醛（MDA）等分析試劑盒：購于建成生物工程研究所（南京）；兔抗鼠Bax、Bcl-2多克隆抗體：購于博士德生物工程有限公司（武漢）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液：購于中杉金橋生物技術(shù)有限公司（北京）；乙醇、丙酮、石油醚、三氯乙酸、鹽酸、蘇木素等常規(guī)試劑：均為國產(chǎn)分析純，由中南大學(xué)分析測(cè)試中心提供。

1.2 儀器

DK-8AS電熱恒溫水槽：上海合恒儀器設(shè)備有限公司；ML-T分析天平：德國梅特勒-托利公司；DW-86L388A超低溫冰箱：海爾公司；SQ510高壓蒸汽滅菌器：日本三洋公司；MPT250L生化培養(yǎng)箱：深圳市帕特騰飛科技公司；CARY60紫外分光光度計(jì)：美國安捷倫公司；Allegra X-15R冷凍離心機(jī)：美國Beckman Coulter公司；YB-6LF生物組織包埋機(jī)：孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)公司；LKB2188超薄切片機(jī)切片：瑞典LKB公司；ELX-800酶標(biāo)儀：美國BioTek公司；GWA-UN1-10純水超純水器：北京普析公司；CX41顯微鏡：日本奧林巴斯公司。

1.3 方法

1.3.1 絞股藍(lán)多糖的制備

干燥絞股藍(lán)粉末用75%乙醇80℃下回流提取2次，回收乙醇，殘?jiān)眉?0倍蒸餾水提取3次，每次1 h，合并濾液并減壓蒸餾濃縮，加入4倍95%乙醇，過夜，離心后收集沉淀再溶于蒸餾水中，加入三氯乙酸去除蛋白，上清液加入4倍95%乙醇，過夜，離心后收集沉淀經(jīng)無水乙醇、丙酮、石油醚各洗滌3次，真空干燥得GMP。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

雄性Wistar大鼠32只，體重200 g～220 g（中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），常規(guī)分籠喂養(yǎng)，室溫（24±3）℃，濕度為（60±1）%。普通大鼠飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，隨機(jī)分為安靜對(duì)照組（Quiet control group，QC）、運(yùn)動(dòng)力竭對(duì)照組（Exhausting exercises control group，EC）、低劑量絞股藍(lán)多糖+運(yùn)動(dòng)力竭組（Low dose GMP+exhausting exercises group，LGE），高劑量絞股藍(lán)多糖+運(yùn)動(dòng)力竭組（High dose GMP+exhausting exercises group，HGE），每組8只。QC組大鼠不運(yùn)動(dòng)，其余組為力竭運(yùn)動(dòng)組。LGE組與HGE組大鼠每只每天灌胃GMP溶液，給藥量以100mg/kg·bw和300mg/kg·bw計(jì)算，每天1.0mL灌服一次；QC組和EC組灌服同樣劑量的蒸餾水。

1.3.3 力竭運(yùn)動(dòng)模型的建立

力竭運(yùn)動(dòng)組大鼠進(jìn)行3 d的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)適應(yīng)性訓(xùn)練（速度為10 m/min，時(shí)間為10 min/d，坡度為0°）。正式實(shí)驗(yàn)采用Bedford依據(jù)大鼠體重/攝氧量回歸方程所建立的遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷訓(xùn)練大鼠模型[8-9]。按以下運(yùn)動(dòng)程序運(yùn)動(dòng)至力竭：第一級(jí)負(fù)荷：0 °，8.2 m/min，15 min（相當(dāng)于 53%VO2max）；第二級(jí)負(fù)荷：5 °，15 m/min，15 m（相當(dāng)于 64%VO2max）；第三級(jí)負(fù)荷：10 °，19.3 m/min（相當(dāng)于76%VO2max）運(yùn)動(dòng)至力竭。總運(yùn)動(dòng)時(shí)間為（66±24）min。大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)為保證運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度，對(duì)其采用聲音、小木棍等方式刺激，如效果不明顯，可給予一定電刺激，使動(dòng)物始終保持在跑道前1/3處。力竭運(yùn)動(dòng)后，將大鼠斷頭處死，迅速摘取肝臟經(jīng)0.9%生理鹽水漂洗后用濾紙吸干，測(cè)定肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)、SOD、GPx、CAT活性及MDA含量。

高血壓主要危險(xiǎn)因素為肥胖、高血脂，而后兩者為脂肪肝的危險(xiǎn)因素。QIAN等[13]的研究指出NAFLD與患者的血壓水平相關(guān)。ANENI等[14]的研究指出IR是NAFLD的主要危險(xiǎn)因素，IR對(duì)高血壓有作用，而高血壓對(duì)NAFLD的發(fā)展有作用，三者之間的關(guān)系密不可分[15-16]。

1.3.4 力竭判定標(biāo)準(zhǔn)

到運(yùn)動(dòng)末期，大鼠運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度減緩，速度下降，不能保持在跑道前1/3處的次數(shù)大3次以上，即使給予電刺激也驅(qū)趕無效，停跑后體征表現(xiàn)為神情倦怠、腹部觸地、呼吸急促、臥位、對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍[10]。

1.3.5 肝組織Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的檢測(cè)

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)大鼠肝組織Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。4 μm切片，常規(guī)脫蠟水化，一抗為兔抗鼠Bax和Bcl-2多克隆抗體，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，樹脂封片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察、照相記錄。在高倍鏡下，每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比作為Bax、Bcl-2蛋白陽性表達(dá)指數(shù)[11]。陽性染色為細(xì)胞內(nèi)有棕黃色點(diǎn)狀或顆粒狀物質(zhì)。重復(fù)進(jìn)行3次操作，取3次參數(shù)的均值為分析數(shù)據(jù)。

1.3.6 肝組織SOD、GPx、CAT活性及MDA含量測(cè)定

取肝組織剪碎，倒入玻璃勻漿管中，加入冷生理鹽水，在盛有冰水混合物的器皿中制成10%勻漿，然后離心，取上清液，按試劑盒說明測(cè)定SOD、GPx、CAT活性及MDA含量。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間差異采用單因素方差分析（One Way ANOVA），組間P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax表達(dá)影響

絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax表達(dá)影響見圖1。

由圖1可以看出，QC組大鼠的Bax表達(dá)量很低，EC組大鼠的Bax表達(dá)量較高，LGE組與HGE組大鼠的Bax表達(dá)量處于兩者之間。

2.2 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達(dá)影響

絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達(dá)影響見圖2。

圖1 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bax表達(dá)影響Fig.1 Effects of GMP on the expressions of Bax in the liver

圖2 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝細(xì)胞凋亡調(diào)控基因Bcl-2表達(dá)影響Fig.2 Effects of GMP on the expressions of Bcl-2in the liver

由圖2可以看出，QC組、LGE組、HGE組大鼠的Bcl-2表達(dá)量明顯，EC組組大鼠的Bcl-2表達(dá)量較弱。

2.3 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2、Bax/Bcl-2比值變化影響

絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠Bax、Bcl-2表達(dá)量及Bax/Bcl-2比值的計(jì)算結(jié)果見圖3。

圖3 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝組織Bax、Bcl-2表達(dá)量及Bax/Bcl-2比值變化影響Fig.3 Effects of GMP on the expressions quantity of Bax and Bcl-2 and the changes of Bcl-2/Bax ratio in the liver

由圖3可以看出，與QC組比較，EC組、LGE組、HGE組的Bax表達(dá)量及Bax/Bcl-2比值顯著上升（P<0.05），EC組、LGE組Bcl-2表達(dá)量顯著下降（P<0.05）。與EC組比較，LGE組與HGE組的Bax表達(dá)量及Bax/Bcl-2比值顯著下降，Bcl-2表達(dá)量有顯著上升（P<0.05）。這表明灌胃絞股藍(lán)多糖能使力竭運(yùn)動(dòng)大鼠肝組織中Bax的表達(dá)減弱，Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)，能抑制力竭運(yùn)動(dòng)大鼠肝細(xì)胞凋亡。

2.4 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝組織SOD、GPx、CAT活性影響

絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝組織SOD、GPx、CAT活性影響見圖4。

圖4 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝組織SOD、GPx、CAT活性影響Fig.4 Effects of GMP on the main antioxidant enzyme activities in the liver

由圖4可以看出，與QC組比較，LGE組、HGE組的 SOD 活性，EC組、LGE組、HGE組的 GPx、CAT活性均顯著降低（P<0.05）。與EC組比較，EC組、LGE組、HGE組的 SOD、CAT活性，EC組、HGE組的 GPx活性均顯著提高（P<0.05）；LGE組的GPx活性雖然有少量增加，但差異不顯著（P>0.05）。這表明力竭運(yùn)動(dòng)能使機(jī)體主要抗氧化酶活性下降，這是與以往研究結(jié)果相一致的。絞股藍(lán)多糖能增強(qiáng)大鼠肝組織抗氧化酶活性，清除氧化應(yīng)激狀態(tài)下的過量自由基，進(jìn)而加強(qiáng)對(duì)機(jī)體的保護(hù)。

2.5 絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大鼠肝組織MDA含量影響

絞股藍(lán)多糖對(duì)各組大肝組織MDA含量影響見圖5。

由圖5可以看出，與QC組比較，EC組、LGE組、HGE組的MDA含量均顯著提高（P<0.05）。與EC組比較，EC組、LGE組、HGE組的MDA含量均顯著降低（P<0.05）。這表明力竭運(yùn)動(dòng)能導(dǎo)致大鼠肝組織脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)。絞股藍(lán)多糖能降低大機(jī)體組織脂質(zhì)過氧化，保護(hù)劇烈運(yùn)動(dòng)后自由基介導(dǎo)的氧化損傷。

3 討論

劇烈運(yùn)動(dòng)會(huì)使組織代謝率增加而導(dǎo)致自由基產(chǎn)生產(chǎn)生加速，發(fā)生氧化應(yīng)激。運(yùn)動(dòng)時(shí)自由基產(chǎn)生的具體來源包括線粒體呼吸鏈的電子漏、黃嘌呤氧化酶反應(yīng)、血紅蛋白氧化、中性粒細(xì)胞活化途徑等。運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其中運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度與運(yùn)動(dòng)量無疑是影響細(xì)胞凋亡的重要因素。細(xì)胞凋亡需要啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白家族、Caspase家族、Fas/Fasl腫瘤壞死因子超家族成員、IGF家族等特殊基因來轉(zhuǎn)錄及合成特殊的蛋白質(zhì)[12-13]。其中，Bcl-2家族成員是目前運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞凋亡研究中研究最多的蛋白質(zhì)。有研究表明，Bcl-2蛋白與Bax蛋白兩者的平衡調(diào)節(jié)著細(xì)胞的存亡，Bcl-2與Bax既可以形成同源二聚體，也可以形成異源二聚體。研究發(fā)現(xiàn)，Bax同源二聚體可以使發(fā)生細(xì)胞凋亡，但當(dāng)Bcl-2占優(yōu)勢(shì)時(shí)，會(huì)與Bax結(jié)合形成異源二聚體，剩余的Bcl-2會(huì)使細(xì)胞凋亡受到抑制；但當(dāng)Bax占優(yōu)勢(shì)時(shí)，會(huì)與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體，剩余的Bax就會(huì)使細(xì)胞發(fā)生凋亡[14]。Bax/Bcl-2比值的大小決定細(xì)胞凋亡發(fā)生的走向[15]。本研究結(jié)果顯示，大鼠力竭運(yùn)動(dòng)后，與QC組相比，肝組織Bax的表達(dá)增強(qiáng)，Bcl-2的表達(dá)減弱，Bax/Bcl-2比值升高。這說明Bax與Bcl-2共同調(diào)控力竭運(yùn)動(dòng)致肝組織細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax作為上調(diào)基因促進(jìn)凋亡發(fā)生，Bcl-2作為下調(diào)基因抑制細(xì)胞的凋亡，肝細(xì)胞向著凋亡方向發(fā)展，這可能是力竭運(yùn)動(dòng)引起大鼠肝組織細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控機(jī)制。同時(shí)，研究結(jié)果也表明，大鼠灌胃GMP后進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)，肝組織Bax的表達(dá)減弱。Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)。Bax/Bcl-2比值降低。說明GMP可通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2及Bax/Bcl-2比值，對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)大鼠起到抗肝細(xì)胞凋亡的作用，對(duì)肝組織起到保護(hù)作用。

在劇烈運(yùn)動(dòng)中，SOD、CAT、GPx是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)清除自由基及活性氧產(chǎn)生的第一道防線。SOD能催化O2-·使其發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O2，CAT能催化H2O2分解成O2和H2O·GPx能催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，從而保護(hù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)及功能不受過氧化物的干擾及損害。脂質(zhì)過氧化作用能使細(xì)胞膜的流動(dòng)性以及滲透性發(fā)生改變、損傷DNA以及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)。MDA是脂質(zhì)過氧化最豐富的終產(chǎn)物，也是最常用的評(píng)價(jià)脂質(zhì)過氧化指標(biāo)之一。相關(guān)研究已經(jīng)證實(shí)，劇烈運(yùn)動(dòng)能夠通過增加生物體內(nèi)肌肉、肝、腎等組織中脂質(zhì)過氧化而引起氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，GMP能顯著增加力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織中SOD、GPx和CAT活性，降低MDA含量。這說明GMP在保護(hù)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中展示的重要的抗氧化與降低脂質(zhì)過氧化作用，能保護(hù)劇烈運(yùn)動(dòng)后自由基介導(dǎo)的氧化損傷。其原因可能與破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)有關(guān)，具體原因還有待進(jìn)一步研究。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果為絞股藍(lán)多糖在運(yùn)動(dòng)營養(yǎng)領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論參考。

4 結(jié)論

絞股藍(lán)多糖后能使力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠肝組織Bax的表達(dá)減弱、Bcl-2的表達(dá)增強(qiáng)、Bax/Bcl-2比值降低；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化氫酶（CAT）活性增加；MDA含量降低。絞股藍(lán)多糖對(duì)力竭運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)肝組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

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Protective Effects of Polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum Makino on the Exhaustive Exercise-induced Hepatocyte Apoptosis

XU Yan-feng1，QI Bo2，*
（1.Department of Physical Education，Xinxiang Medical College，Xinxiang 453000，Henan，China；2.Department of Physical Education，Central South University，Changsha 410083，Hunan，China）

The effects of polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum Makino（GMP）on the exhaustive exercise-induced hepatocyte apoptosis of rats was studied.The animal model of exhaustive exercise was used for study.Thirty two male Wistar rats were randomly assigned into quiet control group（QC），exhausting exercises control group（EC），low dose GMP+exhausting exercises group（LGE），high dose GMP+exhausting exercises group（HGE）.The expressions of Bcl-2 and Bax were detected by the immunohistochemical staining and image analyzer.The correlation between the ratio of Bcl-2/Bax and histiocyte apoptosis was analyzed.Meanwhile，main antioxidant enzyme activities and malondialdehyde （MDA）were detected by the spectrophotometric method.After GMP was provided by gavage，the expression of Bax decreased remarkably，and of Bcl-2 increased significantly，the ratio of Bax/Bcl-2 decreased remarkably.GMP could decrease MDA contents and increase superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GPx），catalase（CAT）activities in liver of rats.GMP possessed protective effects on the exhaustive exercise-induced cell apoptosis and oxidative stress.

polysaccharides from Gynostemma pentaphyllum Makino；exhaustive exercise；oxidative stress；hepatocyte；apoptosis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.040

湖南省教育廳科技規(guī)劃項(xiàng)目（20130482）

宿彥峰（1977—），男（漢），講師，碩士研究生，研究方向：體育教育訓(xùn)練學(xué)與運(yùn)動(dòng)生理學(xué)。

*通信作者：齊波（1978—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：運(yùn)動(dòng)生理學(xué)。

2015-07-02