均勻設(shè)計法優(yōu)選紅景天苷提取工藝的研究

蒲忠慧，陳希文，王雄清，劉紅軍，孫小程，趙順?gòu)?/p>

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部中藥材標準化重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽621006）

均勻設(shè)計法優(yōu)選紅景天苷提取工藝的研究

蒲忠慧1，2，陳希文2，王雄清2，劉紅軍2，孫小程2，趙順?gòu)?

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，教育部中藥材標準化重點實驗室，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川成都611137；2.綿陽師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川綿陽621006）

采用均勻設(shè)計法，選用U6（64）均勻設(shè)計試驗對紅景天苷提取工藝進行優(yōu)選，采用紫外分光光度法測定其含量，以紅景天苷得率為指標，考察乙醇濃度、料液比、浸漬時間、提取時間對紅景天苷含量的影響。結(jié)果表明紅景天苷的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，料液比1∶5（g/mL），提取時間為3h。

均勻設(shè)計法；紅景天；提取工藝

紅景天為景天科（Crassulaceae）紅景天屬（Rhodiola L.）多年生草本或亞灌木野生植物，主要是以莖和根入藥，其味甘、澀，性寒[1]。古代藏醫(yī)藥文獻《四部醫(yī)典》記載紅景天擁有“性涼、清熱、滋補元氣”的藥用功效[2]，另一部藥典《晶珠本草》顯示紅景天還具有養(yǎng)肺等功效[3]?，F(xiàn)代醫(yī)藥學(xué)證明[4]紅景天還具有抗微波輻射（如電腦、手機等）、抗耐缺氧、抗疲勞、延緩機體衰老等一系列作用。紅景天含紅景天苷、黃酮、紅景天素、多糖以及苷元酪醇等有效成分[5-7]，紅景天苷具有抗衰老、抗疲勞、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、催眠鎮(zhèn)靜以及對心血管系統(tǒng)、肝臟和X線照射的保護作用[8-11]。此前，有關(guān)紅景天苷提取的研究，多采用傳統(tǒng)（如正交設(shè)計試驗）的提取方法[12-19]，傳統(tǒng)的紅景天苷提取方法所得產(chǎn)品收率低或者雜質(zhì)多，且試驗過程復(fù)雜，因此紅景天苷提取分離技術(shù)的研究越來越受到重視。

近年來興起的均勻設(shè)計法，是尋找中藥最佳提取工藝優(yōu)化等方面行之有效的有力工具，既可節(jié)省人力、物力，又能達到正交試驗所確定的最優(yōu)條件的效果。因此，本研究擬采用均勻設(shè)計法，以紅景天苷得率為指標，考察乙醇濃度、液料比、浸漬時間、提取時間對紅景天苷含量的影響，優(yōu)選出紅景天苷最佳提取工藝，并對其結(jié)論進行了驗證，為紅景天苷提取工藝的選擇提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅景天：產(chǎn)地為四川，購于成都中藥材市場。按照《中華人民共和國藥典》（2010年版二部）鑒定為景天科植物紅景天（Rhodiola rosea L.）的干燥根莖。

紅景天苷標準品（批號：20140927）：上海金穗生物科技有限公司。

所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

中草藥粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；i9型雙光束紫外可見分光光度計：濟南海能儀器股份有限公司；KQ2200E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-DC（Ⅲ）循環(huán)水式多用真空泵：上海道京儀器有限公司；DHG-905285-Ⅲ電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；EL204-IC電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅景天苷的提取

將購買的紅景天粉碎，過篩，稱取紅景天粉末25 g，置于圓底燒瓶內(nèi)，按照一定的料液比加入一定濃度的乙醇在恒定溫度下回流提取2次，合并濾液，減壓濃縮除去乙醇，干燥至恒重，稱量，計算粗提物得率。

1.3.2 紅景天苷提取工藝優(yōu)化

采用均勻設(shè)計試驗，選取對紅景天苷提取率影響較大的因素：乙醇濃度（χ1）、浸漬時間（χ2）、提取時間（χ3）、料液比（χ4），進行U6（104），即四因素六水平均勻設(shè)計優(yōu)選提取紅景天苷（見表1），每個因素6水平，以紅景天苷得率為指標確定最佳提取工藝。試驗安排方法見表2。

表1 紅景天苷提取工藝均勻設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Salidroside

表2 紅景天苷提取工藝均勻設(shè)計試驗方案Table 2 Pilot programs of uniform design experiments for optimizing extraction processing of Salidroside

1.3.3 紅景天苷標準液的制備

精密稱取紅景天苷標準品10 mg，然后加甲醇定溶至50 mL的容量瓶中，搖勻即得200 μg/mL紅景天苷標準液。然后精密吸取紅景天苷標準液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL的容量瓶中，加甲醇定溶，搖勻即得；然后于275 nm處測定吸光度。

1.3.4 含量測定

精密稱取紅景天粗提物6.00mg，然后加入到10mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解，定容搖勻；使用紫外分光光度計測其在275 nm處的吸光度值，再根據(jù)紅景天苷標準品的回歸曲線得到相應(yīng)的紅景天苷濃度。

紅景天苷提取率/%＝（紅景天苷濃度/紅景天粗提物濃度）×100。

1.3.5 驗證試驗

按照紅景天苷提取的優(yōu)化條件進行驗證試驗。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Office辦公軟件excel處理數(shù)據(jù)，以紅景天苷提取率為因變量，以乙醇濃度（%）、料液比、浸漬時間（h）、提取時間（h）為自變量，進行多元回歸分析，根據(jù)回歸方程的回歸系數(shù)、F值及其顯著性檢驗，得出紅景天苷提取的最佳工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅景天苷標準曲線的繪制

紅景天苷標準曲線見圖1，以紅景天苷標準液的濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制線性曲線。

圖1 紅景天苷標準曲線Fig.1 The standard curve of Salidroside

由圖1可知，其回歸方程為y＝0.005 2x+0.009 3，式中y：吸光度；x：紅景天苷標準曲線中對應(yīng)的紅景天苷濃度（μg/mL）。決定系數(shù)R2＝0.999 6，表示在紅景天苷濃度 20 μg/mL～100 μg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度值線性關(guān)系良好。

2.2 均勻設(shè)計試驗結(jié)果

采用均勻設(shè)計試驗得出的紅景天粗提物及紅景天苷含量結(jié)果見表3。

表3 紅景天粗提物及其紅景天苷的含量Table 3 Yield and total polysaccharide content of Salidroside

由表3可知，紅景天粗提物及其得率4號試驗組最少，分別為8.38 g和33.52%；3號試驗組最多，分別為10.56 g和42.24%。根據(jù)標準曲線回歸方程計算出各試驗樣品中紅景天苷含量：1號試驗組最低，分別為1.91 g和7.64%；3號試驗組最高，分別為2.43 g和9.72%。即當(dāng)乙醇濃度為70%，浸泡時間30 min，提取時間1 h，料液比1∶15（g/mL）的條件下，紅景天粗提物及其紅景天苷的含量最高。

2.3 均勻設(shè)計試驗統(tǒng)計分析

采用excel對試驗結(jié)果進行回歸分析，其輸出結(jié)果分別見表4至表7。

表4 回歸統(tǒng)計Table 4 Regression statistics

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

表6 系數(shù)表Table 6 Coefficient table

表7 殘差分析表Table 7 Residual analysis

根據(jù)回歸統(tǒng)計結(jié)果：線性回歸系數(shù)R2為0.961966，F(xiàn)＝3.100 271 43＞Significance F，表面線性關(guān)系可信；由系數(shù)表得到截距Intercep為17.61以及各項系數(shù)，其中因素2系數(shù)值太小，被棄去，從而得到該回歸方程為Y＝17.61-9.85χ1+0.21χ3-0.225χ4。最后根據(jù)回歸方程試驗優(yōu)化方案，χ1和χ4的系數(shù)為負數(shù)，說明其因素的值越小越好；χ3的系數(shù)為正數(shù)，即其值越大越好。由此得到紅景天苷的最佳提取工藝：乙醇濃度為60%，料液比 1 ∶5（g/mL），提取時間為 3 h（其中浸漬時間判定為影響較小或無影響）。同時根據(jù)表4回歸統(tǒng)計的擬合系數(shù)以及表7殘差分析得出：在此條件下，紅景天苷的預(yù)期得率為（12.98±0.92）%。

2.4 驗證性試驗

稱取同一批次的紅景天25 g，于圓底燒瓶內(nèi)，加入60%的乙醇 125 mL（料液比 1 ∶5，g/mL），提取 2次，每次3h，合并濾液，過濾，真空干燥。再按照上述各試驗步驟測定紅景天苷的含量，得到紅景天苷得率為12.45%。

3 結(jié)論

通過對均勻設(shè)計法優(yōu)化紅景天苷提取工藝的研究，結(jié)果表明乙醇濃度、料液比、提取時間對紅景天苷得率影響顯著，而浸漬時間對紅景天苷得率影響幾乎很小。經(jīng)過均勻設(shè)計試驗回歸統(tǒng)計分析優(yōu)選紅景天苷的最佳提取工藝為：乙醇濃度為60%，料液比1∶5（g/mL），提取時間為3 h，次條件下紅景天苷得率為12.45%。

[1] 陳雪梅,周凡,馬芹,等.不同紅景天屬植物的藥理活性研究進展[J].新疆中醫(yī)藥.2013,31(3)：88-91

[2] 宇妥·元丹貢布.四部醫(yī)典[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1987：36

[3] 帝瑪爾·丹增,彭措.晶珠本草[M].上海：上?？萍汲霭嫔?1986：108

[4] 謝宗萬,范崔生,朱兆儀.全國中草藥匯編(下冊)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,1978：280

[5] 王強,阮曉,李荷迪,等.珍稀藥用資源植物紅景天研究現(xiàn)狀、問題與對策[J].自然資源學(xué)報,2007,22(6)：880-888

[6] 吳少雄,王保興,郭祀遠,等.大花紅景天揮發(fā)油化學(xué)成分的研究[J].食品科學(xué),2005(8)：321-323

[7] 王莉.小叢紅景天藥用有效成分提取與分析[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2013：9

[8] 文鏡,郭豫,常平.紅景天提取物抗氧化作用的實驗觀察[J].中國臨床康復(fù),2005,9(11)：125-128

[9] Mao GX,Deng HB,Yuan LG,et al.Protective role of salideroside against aging in amouse model induced by D-galactose[J].Biomed Environ Sci,2010,23(2)：161-166

[10]Zhu Y,Shi Y P,Wu D,,et al．Salideroside protcets against hydrogen peroxide-induced injury in cardiac H9c2 cells via PI3K-Akt Dependent pathway[J].DNA Cell Biol,2011,30(10)：809-819

[11]葉莎莎,曾耀英,尹樂樂．紅景天苷對小鼠腹腔巨噬細胞體外增殖,凋亡,吞噬,ROS和NO產(chǎn)生的影響 [J].細胞與分子免疫學(xué)雜志,2011,27(3)：237-241

[12]郭娜,盛后財,金星,等.紅景天苷提取工藝研究進展[J].北方園藝,2015(8)：190-193

[13]董彥莉.超聲波法提取紅景天苷工藝條件的優(yōu)化[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2011(18)：64-65

[14]王建元.紅景天有效成分提取工藝及微量元素研究[D].成都：西南交通大學(xué),2013：7-9

[15]楊曉艷,蘆啟琴,張曉峰.HPLC法測定不同溶劑對紅景天中紅景天苷提取率的影響[J].分析實驗室,2008(S1)：295-297

[16]張俊鈺,周斌,江濤,等.我國紅景天提取工藝和含量測定研究概況[J].中藥材,2003(12)：908-910

[17]劉萊,王東凱,顧艷麗.紅景天提取工藝的優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥,2004(4)：221-222

[18]吳少雄,郭祀遠,李琳,等.超聲波法提取大花紅景天有效成分的工藝研究[J].食品科技,2006(1)：46-49

[19]李晨,陳東生,陳娟,等.紅景天中紅景天苷和酪醇提取工藝研究[J].中藥材,2006(11)：1239-1241

Uniform Design Method for Optimizing the Extraction Technology of Salidroside

PU Zhong-hui1，2，CHEN Xi-wen2，WANG Xiong-qing2，LIU Hong-jun2，SUN Xiao-cheng2，ZHAO Shun-jiao2
（1.Pharmacy College，Chengdu University of TCM，The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine，State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research，Development and Utilization of Chinese Medicine Resources，Chengdu 611137，Sichuan，China；2.College of Life Science and Technology，Mianyang Normal University，Mianyang 621006，Sichuan，China）

The extraction process of Salidroside was assayed by U6（64）uniform design test to investigate the optimal extraction process.Taking the content of Salidroside measured by UV spectroscopy as index，the influence of ethanol concentration，liquid ratio，extraction time on the the content of Salidroside were determined.Results showed that the optimal extraction process was as follows：the concentration of ethanol was 60%，liquid ratio of 1 ∶5（g/mL），and extract time was 3 hours.

uniform design method；Rhodiola rosea L.；extraction technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.014

蒲忠慧（1982—），女（漢），講師，在讀博士，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

2015-06-17