波爾山羊鉤端螺旋體病的診斷

崔占偉，黃建軍，黃 真，余連喜

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.湖北省江陵縣畜牧獸醫(yī)局，湖北 江陵 434101）

波爾山羊鉤端螺旋體病的診斷

崔占偉1，黃建軍2，黃 真2，余連喜2

（1.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025；2.湖北省江陵縣畜牧獸醫(yī)局，湖北 江陵 434101）

對某羊場送檢的1月齡病羊，進(jìn)行臨床觀察、問診及實驗室檢測。病羊精神萎靡，眼結(jié)膜發(fā)黃，尿液呈茶黃色；剖檢可見心包和腹腔有大量淡黃色透明積液，血液和腹腔積液涂片鏡檢，發(fā)現(xiàn)疑似鉤端螺旋體。以靜脈血和腹腔積液中提取的DNA為模板，用鉤端螺旋體16S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR檢測，均呈核酸陽性，擴(kuò)增出與陽性對照同等大小的片段，表明病羊為鉤端螺旋體感染。

波爾山羊；鉤端螺旋體；診斷

鉤端螺旋體病又稱“外耳病”（Weil′s diseases），是由鉤端螺旋體（leptospira interrogans sensu lato，簡稱鉤體）引起的一種在世界各地都廣泛流行的人獸共患的自然疫源性傳染?。?］。鉤端螺旋體可感染包括人在內(nèi)的多種動物，鼠、兔等嚙齒類動物是其主要的傳染源。該病最早由外耳（Weil）于1886年首次報道［2］，我國關(guān)于該病的報道最早見于1937年湯澤光報道的廣州3例人“外耳病”［3］。該病對人和動物健康危害較大，尤其在雨水充沛、氣候濕潤的南方更為嚴(yán)重，是我國重點防治的人畜共患傳染病之一［4］。

2015年10月持續(xù)的秋雨過后，湖北省某羊場不斷出現(xiàn)1月齡左右羔羊死亡現(xiàn)象。臨床觀察病羔羊精神萎靡，消瘦無力，眼結(jié)膜發(fā)黃，部分腹瀉，尿液呈茶色。剖檢可見肝臟出血，心包和腹腔可見大量淡黃色透明積液。采集病羊血液和心包積液涂片，經(jīng)實驗室診斷確診為羊鉤端螺旋體病。

1 材料與方法

1.1 樣本及處理 病羊為某波爾山羊羊場送檢的1月齡羔羊。剖檢前進(jìn)行臨床觀察，靜脈采血制備涂片，頸靜脈抽取抗凝血以備DNA提取。剖檢時依據(jù)病變情況，按病理學(xué)方法進(jìn)行取材。

1.2 主要試劑與設(shè)備 瑞氏—吉姆薩染液，購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；rTaq酶、dNTP等PCR試劑和DNA Marker為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。DNA提取試劑盒為上海捷瑞生物有限公司產(chǎn)品。陽性對照DNA模板pMDT-lep-16S質(zhì)粒，為長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院實驗室構(gòu)建保存。

PCR儀、凝膠成像分析系統(tǒng)為美國伯樂公司產(chǎn)品；生物顯微鏡為寧波順宇公司產(chǎn)品；高速離心機(jī)為德國Sigma 1-14。

1.3 PCR引物 根據(jù)GenBank發(fā)表的鉤端螺旋體16S rDNA基因序列［5-6］，設(shè)計1對特異性引物，具體序列，上游引物 F：5′-CGCGTCTTAAACATGCAAG TCAAGC-3′，下游引物 R：5′-CCGGTGTTACCTTGAC TCT-3′，目的片段長度270 bp，引物由武漢擎科創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 問診與臨床診斷 觀察送檢病羊臨床癥狀，并詳細(xì)詢問畜主羊場相關(guān)情況。

1.5 血液和積液涂片制備與鏡檢 剖檢前取適量耳靜脈血，按照常規(guī)方法制備血液涂片；剖檢時取腹腔積液按照常規(guī)方法制備積液涂片，自然干燥，瑞氏—吉姆薩染液進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 DNA提取與PCR診斷 取頸靜脈抗凝血或腹水 2 mL，12 000 r/min，離心 10 min，棄上清液，留沉淀，加入試劑盒中的組織細(xì)胞裂解液和蛋白酶K，55℃消化30 min，按照DNA提取試劑盒說明書的具體步驟，進(jìn)行DNA提取，所得DNA在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR體系采用25 μL體系進(jìn)行，具體組成：10×buffer 2.5 μL，25 mmol/L 的 Mg2+1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L，each）2.0 μL， 上游引物 1 μL， 下游引物 1 μL，DNA 模板 1 μL，rTaq 酶 1.25U， 加滅菌去離子水至 25 μL。

循環(huán)條件為：預(yù)變性94℃3 min；（94℃30 s，56℃ 30 s，72℃ 40 s）×33個循環(huán)；72℃終末延伸10 min，4℃低溫10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊場狀況及羊群臨床癥狀 羊場存欄成年波爾山羊200只，羔羊約30只，以沿河灘涂地放牧為主，2015年10月持續(xù)的秋雨之后，第1次出圈放牧之后第7天，死亡1月齡左右羔羊1只，隨后發(fā)現(xiàn)部分羔羊精神萎靡，四肢無力，尿黃、腹瀉，大羊暫未見異常。

2.2 剖檢與染色鏡檢 送檢的病羊采血后處死，剖檢發(fā)現(xiàn)血液稀薄凝固不良，心包和腹腔有大量淡黃色清亮的積液。膀胱潴留尿液呈深茶色，心肌和肝臟上有少量出血點，膽汁稀薄，淡黃色。

耳靜脈血液涂片（圖1A、1B）和腹腔積液涂片（圖1C、1D），瑞氏—吉姆薩染色，均可見大量螺旋體存在，紅細(xì)胞嚴(yán)重變形，多呈三角形或多邊形，僅見少量的正常圓盤狀紅細(xì)胞。

2.3 PCR結(jié)果 以靜脈血和腹腔積液中提取的DNA為模板，用鉤端螺旋體16S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從血液和腹腔積液提取的DNA中均擴(kuò)增出與陽性對照同等大小，約270 bp的條帶（見圖2）。

圖1 血液和腹腔積液涂片（瑞氏—吉姆薩染色，640×）

3 討論

鉤端螺旋體病是自然疫源性人獸共患傳染病，鼠、兔等嚙齒類動物是其主要的傳染源。該病在我國廣泛流行，據(jù)報道已有26個省、自治區(qū)發(fā)現(xiàn)鉤端螺旋體病，尤其是湖北、湖南、浙江、福建等省更是高發(fā)區(qū)［7］。根據(jù)統(tǒng)計，我國鉤端螺旋鉤體病的年平均發(fā)病率約為十萬分之七，平均死亡率約為1.02%，嚴(yán)重威脅著人民的健康和影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［8］。該研究通過臨床問診與觀察、剖檢及實驗室涂片鏡檢和PCR檢測，對湖南省某波爾山羊養(yǎng)殖場發(fā)病的1月齡波爾山羊進(jìn)行診斷。檢查結(jié)果，病羊臨床表現(xiàn)消瘦，四肢無力，精神不振。剖檢可見心包和腹腔有大量淡黃色透明積液，心肌和肝臟表面可見少量的出血點，膽汁稀薄，淡黃色，腎臟呈土黃色，膀胱積有深茶色尿液。血涂片和腹腔積液涂片均可見大量的螺旋狀病原體，用鉤端螺旋體16S rDNA特異性引物進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果呈核酸陽性，確診為羊鉤端螺旋體病。

圖2 PCR檢測結(jié)果

鉤端螺旋體病的發(fā)生常常與環(huán)境衛(wèi)生有著密切的關(guān)系，病原往往隨嚙齒類動物的糞尿排出，污染水源或者畜禽飼料［9-10］。人或動物飲用了被污染的水或者進(jìn)食了被污染的食物或飼料，便會造成感染。該次羊群發(fā)病在10月持續(xù)的秋雨之后，分析其原因可能是小羊在放牧?xí)r飲用了被鉤端螺旋體污染的水，或食用被污染的牧草。10月正是兩湖地區(qū)的秋收季節(jié)，田間果實豐富，老鼠外出活動增加，另外，連續(xù)陰雨造成的積水有可能使安家在低洼地方的老鼠不得不向羊群牧地或者羊場、羊舍等高地遷移，因此增加了病原的污染和傳播范圍，也增加了人畜與病原接觸的機(jī)會。

［1］賀潔，馬永康，楊向東.鉤端螺旋體病研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)動物防制，2010，12（26）：1110-1113.

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［3］YE C L，YAN W W，Mc DONOUGH P L，et al.Serodiagnosis of equine leptospirosis by enzyme-linked immunosorbent assay using four recombinant protein markers［J］.Clin Vaccine Immunol.2014， 21（4）：478-483.

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［10］姜明美.羊鉤端螺旋體病的流行特點、癥狀與診斷［J］.養(yǎng)殖技術(shù)顧問，2014，8（5）：98.

S858.262.63

A文章順序編號1672-5190（2016）03-0100-02

2016－01－29

崔占偉（1986—），男，碩士研究生，主要研究方向為動物疾病防控。

余連喜（1984—），男，獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)行政管理工作。

（責(zé)任編輯：趙景娣）