不同濃度玻璃化冷凍保護液及冷凍載體對驢卵母細胞成熟率的影響

杜興雨 ，王彥妮 ，張焱如 ，曹俊偉

（1.內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

不同濃度玻璃化冷凍保護液及冷凍載體對驢卵母細胞成熟率的影響

杜興雨1，2，王彥妮1，2，張焱如1，2，曹俊偉1，2

（1.內蒙古農業(yè)大學生命科學學院，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古自治區(qū)生物制造重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

為了比較不同冷凍液及冷凍載體對驢卵母細胞成熟率的影響，試驗設計4個濃度梯度（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）冷凍液和3種冷凍載體分別對生發(fā)泡（germinal vesicle，GV）期驢的卵母細胞進行玻璃化冷凍，對解凍后的卵母細胞進行體外成熟，通過比較卵母細胞的成熟率反映其冷凍效果。結果表明，冷凍液Ⅱ的卵母細胞成熟率（28.13%）顯著（P＜0.05）高于其他 3 組，但顯著（P＜0.05）低于正常組（51.77%），在不同冷凍載體對驢卵母細胞成熟率的影響試驗中，使用開放式拉長塑料細管（OPS）的卵母細胞成熟率（28.13%）顯著（P＜0.05）高于普通玻璃細管組（11.67%），但與 GMP 管組（23.53%）差異不顯著（P ＞0.05）。

驢；玻璃化冷凍；卵母細胞；成熟率；載體

隨著體外受精及體細胞核移植技術的日益成熟，科研人員對卵母細胞的需求量日益增加［1］，加之人工授精及受精后胚胎的發(fā)育、基因工程、體細胞克隆、瀕危動物的保存等都需要大量的卵母細胞，所以卵母細胞的冷凍保存就成了當今的熱點研究內容，卵母細胞的冷凍方法大體分為程序化冷凍和玻璃化冷凍2種方法，而程序化冷凍因其昂貴的設備及繁瑣的操作未被廣泛使用，玻璃化冷凍最早是由Rall提出來的，玻璃化冷凍以快速、操作簡單而著稱，因此省去了繁瑣的冷凍步驟及昂貴的儀器設備，從而大大減少了冷凍的成本［2］，同時玻璃化冷凍過程中高濃度的保護劑由液態(tài)迅速轉化成玻璃態(tài)，從而減少甚至沒有冰晶的形成，保護了卵母細胞不受物理損傷，其冷凍效果優(yōu)于程序化冷凍而被廣泛應用于生產及科研中。該研究以驢的卵母細胞為冷凍對象，分別設計4個濃度的冷凍保護液以及選用了3種不同冷凍載體，旨在分析不同濃度冷凍保護液及不同載體對生發(fā)泡 （germinal vesicle，GV）期驢卵母細胞成熟率的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 卵巢：驢卵巢采自青島市膠南區(qū)周邊屠宰場。將剛屠宰后的驢卵巢取出并置于4℃的生理鹽水（含100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素）中，2～4 h內運回實驗室。

1.1.2 開放式拉長塑料細管 （open pulled straw，OPS）的制作：選用規(guī)格為0.25 mL的凍精管，將加熱臺預熱到100℃左右，然后將凍精管的中間部分放在加熱臺上均勻加熱，雙手輕拉使其長度為30cm左右，保持拉力5 s左右使其變硬，用手術刀將其中間切開，這樣就得到2根細管，放在75%的酒精中過夜備用。

1.1.3 GMP管的制作：用的材料為0.25 mL的玻璃管，將玻璃管在酒精燈上加熱后拉長至直徑為0.85 mm左右，切斷后浸在75%酒精中過夜備用。

1.2 主要試劑和溶液的配制

1.2.1 玻璃化冷凍保護液

玻璃化冷凍保護液按梯度分為4組，分別為：Ⅰ組25%DMSO+25%EG+50%M199+0.25 mol/L Sucrose；Ⅱ組20%DMSO+20%EG+60%M199+0.25 mol/L Sucrose；Ⅲ組 15%DMSO+15%EG+70%M199+0.25 mol/L Sucrose；Ⅳ組 10%DMSO+10%EG+80%M199+0.25 mol/L Sucrose。

1.2.2 預平衡液

預平衡液 1：M199+0.25 mol/L Sucrose。

預平衡液2：各組玻璃化冷凍保護液中DMSO、EG濃度的一半，M199及蔗糖濃度不變。

解凍液：M199+蔗糖梯度濃度（0.5、0.25、0 mol/L）。

1.2.3 成熟液

“其實將石頭雕成孔明燈，還不算難，難的是，他們在牡丹花的不同花瓣間，都鑿出了暗道，暗道里藏下由萬花谷里采摘來的花瓣，這樣隨著熱氣的縈繞，不同的暗道發(fā)出不同的聲響，落下不同的花瓣，至于聲音如何混雜在一起，發(fā)出不同的聲調，花瓣又如何調和，產生不同的氣味，這個就不是我能想出來的了?！?/p>

M199+10%FBS+100 μg/mLFSH+10 μg/mL LH+200 ng/mL IGF-I+0.11 mg/mL sodium pyruvate+10 μL/mL ITS+25 mg/mL gentamycin。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵母細胞的收集：該試驗參考趙高平等采用切割法收集卵母細胞，具體操作為把處理好的卵巢放入盛有割卵液的直徑為10 cm的玻璃培養(yǎng)皿中，先用手術刀劃破卵巢表面的卵泡，使其中的卵泡液流入玻璃皿中，再用小匙刮卵泡壁，并用割卵液沖洗卵泡壁和小匙。

1.3.2 卵母細胞的玻璃化冷凍

1.3.2.1 細管法（staw）的冷凍與解凍

細管法的冷凍：GV期驢卵母細胞經過2步預平衡處理后分為五段式裝管，分別依次吸入0.5 cm Sucrose、0.5 cm空氣、1 cm含有GV期驢卵母細胞的冷凍保護液、0.5 cm空氣、0.5 cm Sucrose，熱鉗封口后直接投入液氮中保存。

細管法的解凍：將凍存2周以上的含驢卵母細胞麥管取出后，在空氣中停留15 s左右，再放入37℃的水浴鍋中輕輕振蕩15 s左右，拿出后擦拭去表面的水分，剪去兩端后用移液器將含卵母細胞的內容物吹入37℃含0.5 mol/L蔗糖的解凍液中，10 min中后，將卵母細胞移入37℃含0.25 mol/L蔗糖的解凍液平衡10 min，最后，將卵母細胞移入37℃含0 mol/L蔗糖的解凍液平衡10 min，洗卵液洗滌2～3次，放入成熟液中培養(yǎng)。

1.3.2.2 開放式拉長塑料細管（OPS）冷凍和解凍：開放式拉長塑料細管（OPS）冷凍：GV期驢卵母細胞經過2步預平衡處理后，將OPS管的末端浸入含卵母細胞的冷凍保護液中，利用虹吸作用吸入卵母細胞，每次吸入5～8 μL液體，每次吸入5～7個卵母細胞，然后迅速投入液氮中保存。

1.3.2.3 開放式毛細玻璃管法（GMP）的冷凍和解凍：開放式毛細玻璃管法（GMP）的冷凍和解凍的步驟與OPS的相同。

1.3.3 不同濃度冷凍保護液對驢卵母細胞成熟率的影響：將采集的卵母細胞隨機分為5組，分別為正常組、冷凍組Ⅰ、冷凍組Ⅱ、冷凍組Ⅲ、冷凍組Ⅳ。其中，正常組直接進行體外成熟培養(yǎng)，作為對照組；另外4組分別用冷凍保護液Ⅰ、冷凍保護液Ⅱ、冷凍保護液Ⅲ、冷凍保護液Ⅳ進行冷凍，采用OPS管法冷凍，解凍后進行體外成熟培養(yǎng)，30～32 h后統(tǒng)計其成熟情況，每組試驗進行3次。

1.3.4 不同冷凍載體驢卵母細胞成熟率的影響：將采集到的卵母細胞隨機分為3組，分別用普通玻璃細管、GMP管、OPS管進行冷凍，所用的冷凍保護液為冷凍保護液Ⅱ，解凍后進行體外成熟培養(yǎng)，30～32 h后統(tǒng)計其成熟情況，每組試驗進行3次。

1.4 數據分析 試驗數據采用卡方檢驗進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 不同濃度冷凍保護液對驢卵母細胞成熟率的影響 該試驗采用了4種不同配比的冷凍保護液對GV期驢卵母細胞進行冷凍，解凍后對卵母細胞進行成熟培養(yǎng)，結果如表1所示。由表1可以看出，其中冷凍保護液Ⅱ的卵母細胞成熟率 （28.13%）顯著（P＜0.05）高于其他 3組的成熟率，但都顯著（P＜0.05）低于對照組，說明冷凍對卵母細胞的成熟率有影響，其中冷凍保護液Ⅱ的驢卵母細胞成熟率優(yōu)于其他3組。

2.2 不同冷凍載體對驢卵母細胞成熟率的影響選用普通玻璃細管、OPS管、GMP管作為冷凍載體，冷凍GV期的驢卵母細胞，解凍后卵母細胞成熟率統(tǒng)計如表2。表2數據顯示用該3種冷凍載體冷凍驢卵母細胞時，OPS管組卵母細胞成熟率（28.13%）顯著 （P＜0.05）高于普通玻璃細管組（11.67%），與 GMP 管組（23.53%）差異不顯著（P＞0.05）。

表1 不同濃度冷凍保護液的驢卵母細胞成熟率

表2 不同冷凍載體對驢卵母細胞成熟率的影響

3 討論

冷凍保護劑的選擇是決定卵母細胞冷凍成功與否的關鍵因素，冷凍保護劑種類與濃度的不同對卵母細胞的冷凍效果有著重要影響［3］。因此對于低溫耐受性較差的卵母細胞來說，選擇合適的冷凍保護劑種類、濃度及組合是試驗成功與否的關鍵。許多學者指出，冷凍保護劑的聯合使用效果明顯優(yōu)于單一冷凍保護劑［4］。一些研究者指出玻璃化冷凍過程中添加DMSO是必須的，DMSO有助于紡錘體的聚集，并可提高卵母細胞的存活率及成熟率［5］，與乙二醇配合使用可以有效防止解凍時出現“脫玻璃化”現象的產生［6］。李國浩等通過冷凍成熟的牛卵母細胞得出冷凍保護液中加入10%DMSO+10%EG卵裂率及囊胚率最高［7］，而栗穎華通過冷凍未成熟卵母細胞卻得出20%DMSO+20%EG 會獲得較高的成熟率［8］，說明不同時期的卵母細胞所需的冷凍保護液的濃度差異較大。該試驗選取驢GV期的卵母細胞作為冷凍對象，設計了4組冷凍保護液，通過卵母細胞的成熟率來反映冷凍效果的好壞，試驗結果證明，20%DMSO+20%EG+60%M199+0.25 mol/L Sucrose的組合冷凍效果最好。

隨著科技水平的提高，應用于卵母細胞的冷凍載體也越來越多，如電子顯微鏡銅網法［9］、開放式拉長塑料細管法（OPS）［10］、毛細玻璃管、固體表面法（SSV）［11］等，這些方法所要達到的目的是盡量縮減冷凍保護液的體積從而使其具有更快的降溫速率。該試驗選用了3種冷凍卵母細胞的載體，普通玻璃細管由于降溫速率較慢，形成玻璃化的效果較差且操作過于復雜，不但在冷凍效果方面不如其他2種冷凍載體，而且由于對操作者有著較高的要求而不適宜大規(guī)模應用。GMP管法操作簡單，解凍后卵母細胞成熟率和OPS管無顯著差異，但由于GMP管是玻璃管，在投入液氮中容易斷裂造成卵母細胞丟失而造成浪費，所以OPS管為最適合的冷凍載體。而GMP管和OPS管一個共同的缺點是它們都是開口的，這就要求操作者要對這2種冷凍載體進行充分的消毒，且在液氮無污染的情況下才能保證試驗順利完成?？偠灾煌浔壤鋬霰Ｗo劑及不同的冷凍載體都會對卵母細胞的冷凍效果產生一定的影響，選擇適當的冷凍保護劑和冷凍載體都是必要的。

［1］GALLI C，DUCHI R， CROTTI G，et al.Bovine embryo technologies［J］.Theriogenology，2003，59（2）：599-616.

［2］RALL W F，FAHY G M.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196 degrees C by vitrification［J］.Nature，1985，313（6003）：573-575.

［3］BEGIN I，BHATIA B，BALDASSARRE H，et al.Cryopreservation of goat oocytes and in vivo derived 2-to 4-cell embryos using the cryoloop（CLV）and solid-surface vitrification （SSV） methods［J］.Theriogenology，2003 ，59（8）：1839-1850.

［4］ALBARRACíN J L，MORATó R，ROJAS C，et al.Effects of vitrification in open pulled straws on the cytology of in vitro matured prepubertal and adult bovine oocytes［J］.Theriogenology，2005，63（3）：890-901.

［5］ISACHENKO V，MONTAG M，ISACHENKO E，et al.Aseptic vitrification of human germinal vesicle oocytes using dimethyl sulfoxide as a cryoprotectant ［J］.Fertil Steril，2006，85（3）：741-747.

［6］周崇，侯云鵬，周光斌，等.小鼠孵化囊胚細管法和OPS法玻璃化冷凍保存技術的研究［J］.中國農業(yè)大學學報，2004（5）：26-31.

［7］李國浩，禹學禮，栗穎華，等.封閉式拉長細管冷凍牛卵母細胞的研究［J］.畜牧與獸醫(yī)，2011（9）：41-44.

［8］栗穎華，禹學禮，張德勛，等.不同濃度玻璃化冷凍液對牛未成熟卵母細胞發(fā)育能力的影響 ［J］.家畜生態(tài)學報，2013（6）：36-39.

［9］BOS-MIKICH A，WOOD M J，CANDY C J，et al.Cytogenetical analysis and developmental potential of vitrified mouse oocytes［J］.Biol Reprod，1995，53（4）：780-785.

［10］VAJTA G,HOLM P,KUWAYAMA M，et al.Open Pulled Straw （OPS）vitrification:a new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos ［J］.Mol Reprod Dev，1998，51（1）：53-58.

［11］DINNYéS A,DAI Y,JIANG S，et al.High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation,in vitro fertilization,and somatic cell nuclear transfer［J］.Biol Reprod，2000，63（2）：513-518.

Effect of Different Vitrificated Cryopreservation Solutions and Loading Devices on in vitro Maturation Rate of Donkey Oocytes

DU Xing-yu1，2，WANG Yan-ni1，2，ZHANG Yan-ru1，2，CAO Jun-wei1，2
（1.College of Life Sciences，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010018，China；2.Inner Mongolia Biological Manufacturing Key Laboratory，Hohhot 010018，China）

The aim of the present study was to evaluate the effect of different vitrificated cryopreservation solutions and loading devices on in vitro maturation rate of donkey oocytes.Four concentration gradient of solutions （Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ）and 3 sets of loading devices were included in this study.The GV-stage oocytes of donkey were cryopreserved by using different solutions and loading devices and were subsequently matured in vitro after thawing.The maturation rate of donkey oocytes was served as an index to compare their performance in cryopreservation.The results demonstrated that the maturation rate of oocytes cryopreserved by solutionⅡ （28.13%）was significantly higher than that of oocytes cryopreserved by the other 3 solutions （P＜0.05）,but was significantly lower than that of oocytes in control （51.77%，P＜0.05）.The maturation rate of oocytes cryopreserved by OPS （28.13%） was significantly higher than that of oocytes cryopreserved by ordinary glass straws（11.67%，P＜0.05）,but was not significant different compared with that of oocytes cryopreserved by GMP（23.53%，P＞0.05）.

donkey；vitrificated cryopreservation；oocytes；maturation rate；loading devices

S822.3

A文章順序編號1672-5190（2016）03-0004-03

2016-03-13

項目來源：國家自然科學基金（31460292）。

杜興雨（1990—），男，碩士研究生，主要研究方向為動物遺傳育種。

曹俊偉（1970—），男，副教授，博士，碩士生導師，主要研究方向為動物遺傳育種。

（責任編輯：錢英紅）