武定雞脂聯(lián)素基因的PCR-RFLP分析

丁相紅，吳培福，周杰瓏，陳粉粉

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

武定雞脂聯(lián)素基因的PCR-RFLP分析

丁相紅，吳培福，周杰瓏，陳粉粉

（西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224）

采用PCR-RFLP方法對(duì)武定雞67個(gè)個(gè)體的脂聯(lián)素基因（NC_006096）第2外顯子上的c.C565G突變位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。MvaⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單酶切，結(jié)果顯示，在該位點(diǎn)有AA、AB和BB 3種基因型；對(duì)該位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)特性分析，經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，表明在該位點(diǎn)群體處于平衡狀態(tài)。

武定雞；脂聯(lián)素基因；PCR-RFLP

脂聯(lián)素（adiponectin）是脂肪細(xì)胞特異性分泌的一種細(xì)胞因子，是至今發(fā)現(xiàn)的唯一與肥胖呈負(fù)相關(guān)的脂肪細(xì)胞特異性蛋白，是生物體能量平衡、葡萄糖和脂肪代謝以及攝食的重要調(diào)控因子［1］。脂聯(lián)素基因作為重要疾病的候選基因在小鼠上研究較深入［2-4］，作為調(diào)控體脂沉積的候選基因，在豬、牛和家禽上均有報(bào)道［1，5-8］。

李生等［9］就AA雞的脂聯(lián)素基因表達(dá)，及其與皮下脂肪和腹腔內(nèi)脂肪含量的關(guān)系做了研究，結(jié)果表明，其前期后期表現(xiàn)出不同的正負(fù)相關(guān)。黃煌［1］在研究固始雞與安卡雞資源群脂聯(lián)素基因多態(tài)性及生長(zhǎng)與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)性時(shí)，發(fā)現(xiàn)了4個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與主要經(jīng)濟(jì)性狀（屠宰率、半凈膛率、腹脂重和腿肌重等）顯著相關(guān)。該研究利用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) （polymerase chain reactionrestriction fragmentlength polymorphism，PCRRFLP）技術(shù)對(duì)武定雞脂聯(lián)素基因在c.C565G的多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)，以期為豐富武定雞的遺傳基礎(chǔ)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 該試驗(yàn)以采集自云南省武定縣獅山鎮(zhèn)、萬(wàn)德鎮(zhèn)和高橋鎮(zhèn)共67只武定雞的血液樣本為試驗(yàn)材料。翅靜脈采血1～2mL，其中雌性個(gè)體37只，雄性個(gè)體30只，血樣∶無(wú)水乙醇=1∶2保存，帶回實(shí)驗(yàn)室于-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組DNA制備 采用北京全式金生物技術(shù)有限公司微量全血DNA提取試劑盒 （Easy Pure Blood Genomic DNA Kit，EE121）提取武定雞血樣基因組DNA，提取后的DNA采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和核酸蛋白分析儀測(cè)定濃度后，-20℃保存。1.3 引物設(shè)計(jì) 引物用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。設(shè)計(jì)3對(duì)脂聯(lián)素引物擴(kuò)增測(cè)序，分析測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)存在脂聯(lián)素基因第2外顯子上的c.C565G突變位點(diǎn)。 選用黃煌［1］發(fā)表的酶切引物 （F：5′-ACGAGCAGAACCACTACG-3′；R：5′-TGAGGTGCA GCAAGACAG-3′）進(jìn)行酶切片段擴(kuò)增。

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR的反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqMix12.5 μL；模板 DNA（10 pmol/μL）2.5 μL；上下游引物（10 pmol/μL）各 1.5 μL；用滅菌水補(bǔ)足至 25 μL。

PCR 反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃/5min；94℃/30 s、56 ℃/45s、72℃/30s，35 個(gè)循環(huán)；72℃/10min；16℃/∞。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，Marker用 Trans2K Plus。

圖2 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果（204 bp）

表1 武定雞脂聯(lián)素基因第2外顯子MvaⅠ-RFLP的基因型頻率與等位基因頻率

表2 武定雞脂聯(lián)素基因突變位點(diǎn)的多態(tài)信息含量、雜合度、有效等位基因數(shù)及χ2值

1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP分析 選用MvaⅠ限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單酶切。酶切反應(yīng)體系：10 μL PCR產(chǎn)物置于 0.2mL Eppendorf離心管中，而后加入 0.5 μL （10 U/μL）內(nèi)切酶，2 μL Buffer，7.5 μL雙蒸水，于37℃消化過(guò)夜。酶切產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.6 群體多態(tài)性分析 遺傳純合度（homozygosity，Ho）與雜合度（heterozygosity，He）以及多態(tài)信息含量（polymorphism information content，PIC）等指標(biāo)的計(jì)算參照文獻(xiàn)方法［1］。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果 對(duì)提取的DNA進(jìn)行電泳檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，提取DNA目的條帶清晰，無(wú)雜帶，可用于后續(xù)試驗(yàn)分析。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，其結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，擴(kuò)增片段的特異性好，大小約為200 bp，表明PCR擴(kuò)增獲得了目的片段。

2.3 脂聯(lián)素基因PCR-RFLP分析 經(jīng)MvaⅠ內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行單酶切的結(jié)果表明（見(jiàn)圖3），所檢測(cè)的67個(gè)個(gè)體中，有3種基因型個(gè)體，分別記為 AA 型（204 bp）、AB 型（204 bp+156 bp+48 bp）和BB型（156 bp+48 bp）。脂聯(lián)素基因第2外顯子MvaⅠ-RFLP的基因頻率與等位基因頻率的分布情況見(jiàn)表1。

圖3 脂聯(lián)素基因MvaI-RFLP

2.4 脂聯(lián)素突變位點(diǎn)的群體遺傳學(xué)特性 對(duì)酶切產(chǎn)物的群體遺傳學(xué)指標(biāo)分析結(jié)果（見(jiàn)表2）表明，群體PIC＜0.25，脂聯(lián)素基因在該位點(diǎn)屬于低度多態(tài)；P＞0.05表明整個(gè)群體在該位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)。

3 討論

武定雞是我國(guó)著名的地方優(yōu)良雞種，以肥育性能好、肉質(zhì)鮮嫩等特性而聞名于世。而有關(guān)武定雞脂聯(lián)素基因的單核苷酸多態(tài)性及對(duì)生產(chǎn)、繁殖性能效應(yīng)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。該試驗(yàn)中武定雞脂聯(lián)素基因在酶切位點(diǎn)（NC_006096）第2外顯子上的c.C565G突變位點(diǎn)PIC＜0.25，脂聯(lián)素基因在該位點(diǎn)屬于低度多態(tài)；P＞0.05表明整個(gè)群體在該位點(diǎn)處于平衡狀態(tài)，而黃煌［1］在固始雞與安卡雞F2資源群體中該位點(diǎn)屬于中度多態(tài)位點(diǎn)且群體處于極不平衡狀態(tài)（P＜0.01）。該研究中的酶切結(jié)果顯示該位點(diǎn)有3種基因型，BB型只檢測(cè)到1只，這可能是長(zhǎng)期的選擇造成的結(jié)果，也可能是B基因在該群體中分布較少，分析的樣本量不夠所導(dǎo)致。

［1］黃煌.雞脂聯(lián)素基因多態(tài)性及其與經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性研究［D］.鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［2］薛攀，華燕艷，崔小川.脂聯(lián)素與肺癌合并COPD患者肺功能、年齡、性別的相關(guān)性分析［J］.實(shí)用癌癥雜志，2016，31（2）：258-260.

［3］宋薇，陳愛(ài)榮.脂聯(lián)素與惡性腫瘤相關(guān)性研究進(jìn)展［J］.甘肅醫(yī)藥，2016（3）：178-181.

［4］李晶，程文俊，馬宇虹.脂聯(lián)素在心血管疾病中的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016（9）：76-79.

［5］楊彥杰，昝林森，王洪寶.秦川牛脂聯(lián)素基因SNPs檢測(cè)及其與胴體、 肉質(zhì)性狀的相關(guān)性 ［J］.遺傳，2009，31（10）：1006-1012.

［6］吳蕓.豬脂聯(lián)素基因遺傳多態(tài)性及其與肉質(zhì)性狀的相關(guān)性研究［D］.貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2008.

［7］董飚，龔道清，孟和，等.鴨脂聯(lián)素基因單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)及群體遺傳分析［J］.遺傳，2007，29（8）：995-1000.

［8］劉大林，俞亞波，魏岳，等.脂聯(lián)素基因?qū)┖｜S雞體重及屠體性狀的遺傳效應(yīng)［J］.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2009，30（1）：31-34.

［9］李生，王洪超，叢立新.AA肉雞脂聯(lián)素基因表達(dá)與皮下脂肪和腹腔內(nèi)脂肪含量的關(guān)系 ［J］.飼料研究，2015（19）：1-3.

PCR-RFLP Analysis on Adiponectin Gene of Wuding Chicken

DING Xiang-hong，WU Pei-fu，ZHOU Jie-long，CHEN Fen-fen
（College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming 650224，China）

The polymorphism of c.C565G mutation site in second exon of adiponectin gene （NC_006096） from 67 Wuding Chicken was assessed by PCR-RFLP.Single enzyme digestion of the PCR products was performed with restriction enzyme of MvaⅠ.The results revealed that 3 genetypes（AA,AB and BB）were found in the locus.The population genetics characteristics were analyzed by Chi-square （χ2） fitness test and the results demonstrated that the locus of c.C565G was under equilibrium condition.

Wuding Chicken；adiponectin gene；PCR-RFLP

S831.2；Q51

A文章順序編號(hào)：1672-5190（2016）08-0025-02

2016-07-05

項(xiàng)目來(lái)源：云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（2012Y230）；云南省特色優(yōu)勢(shì)重點(diǎn)學(xué)科生物學(xué)一級(jí)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（50097505）。

丁相紅（1993—），男，所學(xué)專業(yè)為動(dòng)物科學(xué)。

陳粉粉（1976—），女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，碩士，主要研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)與家畜育種。

（責(zé)任編輯：慕宗杰）