內(nèi)蒙古通遼市某奶牛場乳房炎無乳鏈球菌的分離、鑒定及藥敏試驗

龔團蓮

（內(nèi)蒙古民族大學動物科技學院，內(nèi)蒙古 通遼 028042）

內(nèi)蒙古通遼市某奶牛場乳房炎無乳鏈球菌的分離、鑒定及藥敏試驗

龔團蓮

（內(nèi)蒙古民族大學動物科技學院，內(nèi)蒙古 通遼 028042）

旨在調(diào)查引起內(nèi)蒙古通遼地區(qū)奶牛乳房炎發(fā)生的優(yōu)勢病原菌。采用常規(guī)方法對采集自該地區(qū)某奶牛場的3份臨床型乳房炎患牛奶樣進行優(yōu)勢致病菌的分離鑒定，采用紙片擴散法（K-B法）評價分離菌對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物的敏感性。結果表明，從3份乳樣中共分離到14株菌，經(jīng)生化試驗鑒定為無乳鏈球菌；藥敏試驗結果表明，分離菌對鏈霉素及磺胺嘧啶表現(xiàn)出較強的耐藥性，而卡那霉素、慶大霉素及麥迪霉素對分離菌則表現(xiàn)出較好的抑菌效果。

奶牛；臨床型乳房炎；無乳鏈球菌；藥敏試驗

乳房炎是奶牛三大疾病之一，常給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經(jīng)濟損失，是全球范圍內(nèi)影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的重要因素。截至1999年，全世界約有2.2億頭奶牛，其中1/3的奶?；加懈黝愋腿榉垦?，我國奶牛場乳房炎的發(fā)病率在46%～70%［1-2］。在奶牛乳房炎的臨床診斷中，通常將乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。目前，有130多種病原生物被認為與奶牛乳房炎的發(fā)病有關，主要包括病毒、細菌、支原體、真菌等，而金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌是國際上公認的奶牛乳房炎最重要的致病菌種類，并將這3類病原菌在乳樣中的出現(xiàn)作為奶牛乳房炎診斷的細菌學判定標準［3-4］。研究表明，不同地區(qū)的奶牛場中引起乳房炎發(fā)生的優(yōu)勢病原生物種類存在差異，如國內(nèi)有學者研究表明，天津、蘭州、廣州、昆明、重慶、柳州等地的奶牛場，引起乳房炎發(fā)生的病原菌以無乳鏈球菌為主，而長沙、鄭州等地的奶牛場以停乳鏈球菌為優(yōu)勢病原菌，北京、青島等地則以金黃色葡菌球菌占首位。

鏈球菌是引起乳房炎的主要病原菌之一，其中以無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌及牛鏈球菌的分離率較高。無乳鏈球菌在自然界的分布廣泛，其在土壤、空氣、水源、飼料等自然環(huán)境中大量存在，是重要的動物源條件性致病菌［5］。此外，該菌可以通過奶牛養(yǎng)殖場的擠奶設備、擠奶工人的手臂、蚊蠅等進行機械性傳播，造成奶牛交叉感染［6］。近年來，內(nèi)蒙古通遼市奶牛存欄數(shù)不斷增加，與此同時，奶牛乳房炎的發(fā)病率也呈上升趨勢，但該地區(qū)奶牛乳房炎優(yōu)勢致病菌的種類及其分布尚未探明。此外，通遼地區(qū)的奶牛乳房炎優(yōu)勢致病菌對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物是否已經(jīng)產(chǎn)生耐藥性，程度如何，是否已經(jīng)對臨床治療效果產(chǎn)生影響，仍有待深入研究。為此，筆者對采集自內(nèi)蒙古通遼市某奶牛養(yǎng)殖場的臨床型乳房炎患牛乳樣開展病原菌分離鑒定試驗，并研究分離菌對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物的敏感性，以期為該地區(qū)奶牛乳房炎的防治提供科學的用藥依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 乳樣來源：采集內(nèi)蒙古通遼市某奶牛場臨床型乳房炎患牛乳樣3份。將采集的乳樣放入冰盒中迅速帶回實驗室進行細菌分離。

1.1.2 試驗試劑：鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基由通遼市獸醫(yī)站化驗室提供。生化鑒定所用的細菌微量生化反應管由內(nèi)蒙古民族大學醫(yī)學院惠贈。藥敏紙片由內(nèi)蒙古民族大學生命科學學院提供。

1.1.3 儀器及耗材：隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，購自山東濰坊醫(yī)療器械廠；DF 205電熱鼓風干燥箱，購自北京市第一金屬廠；D-1型自動蒸汽滅菌鍋，購自北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；生物安全柜，購自Thermo ELECTRON Corporation。酒精燈、試管、接種環(huán)、吸管、青霉素瓶、三角瓶、平皿、載玻片、顯微鏡、香柏油、鑷子，均由通遼市獸醫(yī)工作站化驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳樣采集：采集自然發(fā)病、無抗菌藥物治療史的奶牛的患病乳區(qū)乳樣。采樣前首先用溫水對乳房進行清洗，然后用0.5%新潔爾滅消毒乳頭，用消毒紙巾擦干。采樣時棄掉頭3～4把奶，然后采集5～10 mL乳樣至準備好的滅菌青霉素小瓶中，編號后放入冰盒，迅速帶回實驗室進行細菌分離。

1.2.2 細菌分離與培養(yǎng)：將乳樣充分搖勻，取乳樣1 mL，用滅菌的L型涂菌棒將乳樣均勻地涂布于鮮血瓊脂培養(yǎng)基表面，于37℃恒溫箱中恒溫倒置培養(yǎng)24 h。觀察細菌生長情況，根據(jù)菌落形態(tài)及溶血特性，挑取鏈球菌疑似菌落，進行革蘭染色鏡檢［7-8］。

1.2.3 生化鑒定：將符合鏈球菌染色特征的疑似菌落進行純化培養(yǎng)。取純化的菌落進行生化鑒定。生化反應的項目包括葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇、水楊苷、棉子糖、七葉苷發(fā)酵，依據(jù)生化反應試劑配套的判定標準判定分離菌的種類。

1.2.4 藥敏試驗：采用CLSI推薦的紙片擴散法（KB法）對部分分離菌進行藥敏試驗。藥敏試驗按參考文獻［9］報道的方法進行，結果判定標準參照文獻［10］執(zhí)行。藥敏試驗選取的藥物為卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、磺胺嘧啶及麥迪霉素。

2 結果與分析

2.1 細菌分離及培養(yǎng) 從3份乳樣中共分離到14株疑似鏈球菌。在鮮血瓊脂培養(yǎng)基上可見針尖大小、淡灰白色、中央隆起、半透明、表面光滑的菌落生長，菌落周圍呈現(xiàn)出狹窄的輕微溶血環(huán)。涂片染色鏡檢發(fā)現(xiàn)，疑似菌株為革蘭陽性球菌，多呈鏈狀排列，無芽胞，可見莢膜。

2.2 生化鑒定 疑似菌株的生化反應試驗結果見表1。根據(jù)判定標準，將14株疑似鏈球菌判定為無乳鏈球菌。

表1 分離菌株的生化反應結果

2.3 藥敏試驗 考查了 8株分離菌（2#、3#、5#、7#、8#、11#、13#、14#）對獸醫(yī)臨床常用的5種抗菌藥物的敏感性，結果見表2。由表2可知，分離到的無乳鏈球菌對慶大霉素、麥迪霉素高度敏感，對卡那霉素中度敏感，而對鏈霉素、磺胺嘧啶不敏感或耐藥。

表2 藥物敏感性試驗結果mm

3 討論

該試驗從內(nèi)蒙古通遼市某奶牛養(yǎng)殖場采集的3份乳房炎患牛乳樣中共分離出14株細菌，經(jīng)表型鑒定， 判定分離菌均為無乳鏈球菌，按Lancefield′s分類屬于B群鏈球菌成員，呈狹窄溶血。因該試驗未對分離菌株進行血清型鑒定，故未能將各菌株的血清型鑒定出來。由培養(yǎng)特性可知，無乳鏈球菌對培養(yǎng)基的營養(yǎng)要求較高，在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上生長不良，同時，其在含有5%血清的培養(yǎng)基上生長欠佳，菌落極小，不利于挑取單菌落進行后續(xù)試驗。因此，應在初次分離所用的培養(yǎng)基中，提高血清及其他營養(yǎng)物質(zhì)的添加量，從而提高鏈球菌屬細菌的分離率。生化鑒定試驗表明，分離到的14株無乳鏈球菌對不同糖類的發(fā)酵模式存在差異，這可能與各菌株的某些生物學特性不同有關。

藥敏試驗表明，從該奶牛場臨床型乳房炎患牛分離到的無乳鏈球菌對磺胺嘧啶的耐藥性較強，同時對鏈霉素也表現(xiàn)出一定的耐藥性，而對其他氨基糖甙類藥物（卡那霉素和慶大霉素）及大環(huán)內(nèi)酯類藥物（麥迪霉素）的敏感性較高，特別是對麥迪霉素高度敏感。分離菌對上述抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性可能與獸醫(yī)臨床不合理使用這些抗菌藥物密切相關。隨著獸用抗菌藥物在動物養(yǎng)殖業(yè)中的廣泛應用和耐藥菌株數(shù)量的不斷增多，動物源致病菌，特別是食品動物源致病菌對獸醫(yī)臨床常用抗菌藥物的耐藥性越來越強，其傳播擴散也越來越廣泛，這不僅造成獸醫(yī)臨床治療奶牛乳房炎的成功率不斷降低，而且食品動物源耐藥菌株可以通過食物鏈傳遞給人，對公共衛(wèi)生安全造成威脅。目前，新型獸用抗菌藥物的發(fā)開速度遠不及細菌對某類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性的速度，因此，如果不能有效解決這一難題，那么將來在人醫(yī)及獸醫(yī)臨床會有相當多的由耐藥菌引起的重要感染性疾病將面臨無藥可治的困境。隨著人們綠色消費意識的不斷提高，建議有關部門加強公共衛(wèi)生安全教育和奶制品檢測工作。

4 小結

該研究從內(nèi)蒙古通遼市某奶牛場的臨床型乳房炎患牛乳樣中分離到14株無乳鏈球菌，從細菌培養(yǎng)特性、菌落形態(tài)特征、生化反應特征等方面確定了菌株的相關生物學特性。藥物敏感試驗結果為該奶牛場奶牛乳房炎的有效治療提供了科學依據(jù)。

［1］李國江，鄒風馳，宋文庭，等.奶牛隱性乳房炎的檢測與評估［J］.中國奶牛，1998（3）：16-17.

［2］吳國娟，張中文，沈紅，等.北京地區(qū)奶牛乳房炎陽性率及發(fā)生規(guī)律的研究［J］.北京農(nóng)學院學報，2001，16（3）：43-46.

［3］張信軍，李玉軍，莊國宏，等.某奶牛場臨床型乳房炎的病原菌分離與鑒定［J］.畜牧與獸醫(yī)，2000，32（5）：11-13.

［4］邱立，張耀相，楊增岐.奶牛乳房炎病原菌的分離與鑒定［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī)，2006（2）：63-64.

［5］袁永隆，張禮華，劉純傳，等.我國奶牛乳房炎常見病原菌的區(qū)系調(diào)查［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，1992，25（4）：70-76.

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［7］冀玉湞，閏常平，孫文毅，等.奶牛乳房炎病原菌的分離與鑒定［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2005（1）：35-36.

［8］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

［9］陳坤永，翁良樹，吳慕貞，等.深圳地區(qū)奶牛臨床型乳房炎病原菌分離鑒定與藥敏試驗 ［J］.中國獸醫(yī)科技，1999，29（9）：36-38.

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（責任編輯：趙俊利）

Antimicrobial Susceptibility of Streptococcus agalactiae Isolated from Dairy Cows with Clinical Mastitis in Tongliao City of Inner Mongolia

GONG Tuan-lian
（College of Animal Science and Technology，Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028042，China）

The aim of the present study was to determine the dominant species of bacteria associated with bovine mastitis in Tongliao City of Inner Mongolia.Three quarter milk samples were collected from dairy cows with clinical mastitis and were used to isolate pathogenic bacteria by conventional method.The antimicrobial susceptibility test of the isolates was conducted using Kirby-Bauer disk diffusion method.The results revealed that a total of 14 strains were isolated from the 3 samples and they were subsequently phenotypically identified as Streptococcus agalactiae.While reduced susceptibility to streptomycin and sulfadiazine were observed,kanamycin,gentamicin and midecamycin are found as susceptible drugs for the isolated Streptococcus strains.

dairy cow；clinical mastitis；Streptococcus agalactiae；antimicrobial susceptibility test

S858.237.26

A文章順序編號：1672-5190（2016）02-0023-03

2015-12-30

龔團蓮（1967—），女，高級實驗師，主要從事臨床獸醫(yī)學實驗教學工作。