牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成及其原核表達

楊 鼎，吳江鴻，祁云霞，趙世華

（1.中國科學院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031）

牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因合成及其原核表達

楊 鼎1，吳江鴻1，祁云霞1，趙世華2

（1.中國科學院內(nèi)蒙古草業(yè)研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031）

牛肌酸激酶是重要的能量代謝酶，尤其是在機體發(fā)生炎癥時，會在局部存在特異性升高，具有潛在的疾病標志物作用。根據(jù)牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列及大腸桿菌（BL21）密碼子的偏愛性，設(shè)計合成54條互相重疊的引物，通過組裝PCR分別合成CK-BB的6個片段CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6；再以基因頭ck-1和基因尾ck-54為引物，以CK-BB1、CKBB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6混合物為模板進行第2輪擴增；將得到的產(chǎn)物連接到pET28b載體上，挑取重組子測序。通過PCR擴增對人工合成的基因進行校正，得到完全正確的CK-BB基因，為重組牛肌酸激酶同功酶CK-BB的規(guī)模化制備奠定了基礎(chǔ)。

牛肌酸激酶同功酶；密碼子優(yōu)化；全基因合成

肌酸激酶 （Creatine Kinase，CK，EC.2.7.3.2）又稱磷酸肌酸激酶（Creatine PhosphoKinase，CPK），分子量為81～82 KDa，是由2個亞基（M和B）組成的二聚體，可逆催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)（見圖1）［1］。該反應(yīng)所產(chǎn)生的能量用于動物體多種生理活動，在動物細胞代謝中起到關(guān)鍵作用。其中在機體組織受到損傷時，如心肌梗死，細胞內(nèi)的CK會被釋放入血，造成血液中CK濃度急劇升高，從而使CK成為診斷該病的指示物質(zhì)，通過檢測血清中CK值即可對心肌梗死做出早期診斷［2］。在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中，困擾養(yǎng)殖戶的常見疾病如奶牛關(guān)節(jié)滑膜炎、子宮內(nèi)膜炎等疾病被發(fā)現(xiàn)時，病情已經(jīng)發(fā)展嚴重，很難治愈。而在這些疾病的發(fā)生發(fā)展過程中，CK都會有不同程度的升高，對于這些疾病的早期診斷具有重要意義［3-4］。

該研究采用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)，將牛肌酸激酶同功酶基因CK-BB按大腸桿菌密碼子的偏愛性進行改造，并克隆到分泌型表達載體pET28b，構(gòu)建大腸桿菌分泌型重組表達載體pET28b-CK-BB，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（E.coli BL21），獲得高效表達CK-BB的大腸桿菌工程菌株，為大規(guī)模制備牛肌酸激酶同功酶CK-BB奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 E.coli BL21（DE3）由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院獸醫(yī)研究所實驗室保存，pET28b質(zhì)粒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等購自寶生物工程（大連）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、膠回收試劑盒等購自天根生化科技（北京）有限公司。引物合成和測序委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

圖1 由肌酸激酶逆催化的肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)

1.2 試驗方法

1.2.1 CK-BB基因遺傳密碼子改造及引物的設(shè)計與人工合成：根據(jù)牛肌酸激酶同功酶CK-BB的氨基酸序列 （GenBank登錄號：AAX08725.1），在Bioedit軟件的輔助下推導出該基因的核苷酸序列，將起始密碼子ATG和終止密碼子TAA分別添加于CK-BB序列的5′端和3′端；使用DNAworks軟件［5］以大腸桿菌密碼子使用頻率為基準，對該基因的密碼子進行優(yōu)化，設(shè)計合成54條互相重疊的40 bp引物（見表1），在引物CK-1和CK-54分別引入NdeⅠ和 XhoⅠ酶切位點。引物合成后經(jīng)脫鹽、PAGE純化，備用。

1.2.2 全基因序列的合成及校正：將相互重疊的引物分為6組，分別進行PCR反應(yīng)，其PCR產(chǎn)物分別命名為CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CKBB5和CK-BB6。再以CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5和CK-BB6為模板，以ck-1和ck-54為引物進行PCR擴增，合成牛肌酸激酶同功酶CK-BB′。對合成后的全基因片段經(jīng)測序分析，發(fā)現(xiàn)合成的片段有堿基缺失、增加、突變的錯誤。以合成的基因CK-BB′為模板，利用PCR法對合成基因進行校正，校正后的牛肌酸激酶同功酶全基因CKBB直接送生工生物工程（上海）股份有限公司進行序列分析。

1.2.3 重組大腸桿菌表達質(zhì)粒pET28b-CK-BB的構(gòu)建：以CK-1（5′-GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGCCTTTCAGCAA-3′，下劃線處為NdeⅠ酶切位點）和CK-54（5′-CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTCTGC-3′，下劃線處為XhoⅠ酶切位點）為引物擴增全長牛肌酸激酶同功酶基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)過NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，插入相同酶切的pET28b載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28b-CK-BB載體。具體方法參照參考文獻［6］進行。

1.2.4 重組大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選：采用質(zhì)粒制備試劑盒提取pET28b-CKBB約5 μg，并用NdeⅠ將其線性化。酶切產(chǎn)物經(jīng)沉淀、洗滌、干燥后，用10 μL水溶解備用。取1 μL重組的pET28b-CK-BB質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）菌株，42℃熱擊90 s，冰上靜置2 min后涂LB平板（含30 μg/mL卡那霉素），37℃培養(yǎng)過夜［7］。

圖2 牛肌酸激酶同功酶CK-BB的人工合成過程

1.2.5 pET28b-CK-BB融合蛋白的誘導表達：挑取表達菌株E.coli BL21（DE3）的單菌落于試管中（4 mL LB培養(yǎng)基，含30 μg/mL卡那霉素），37℃、220 r/min過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)的菌液按1∶100比例分別接種于4 mL LB培養(yǎng)基中，添加30 μg/mL卡那霉素，37℃、220 r/min培養(yǎng)。當OD值達到0.6左右時，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，220 r/min、20℃誘導過夜；37℃繼續(xù)誘導4 h，以未加IPTG誘導劑的菌液作為陰性對照。4 000 r/min離心10 min，收集菌體，棄上清液，菌體用500 μL PBS（pH值7.4）緩沖液懸浮，超聲破碎6 min，超0.5 s停1.5 s，分別離心收集上清液和沉淀。沉淀用500 μL包涵體溶解液 （8 mol/L Urea，50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH值8.0）溶解，取40 μL樣品和10 μL 5× protein loading buffer混勻，沸水浴10 min。

表1 CK-BB全基因合成和擴增編碼DNA引物序列

1.2.6 SDS-PAGE檢測：準備12%的SDS-PAGE和Tris-Gly電泳緩沖液（Tris 30 g，甘氨酸144.0 g，SDS 10 g，定容至1 L），上樣量10 μL，濃縮膠80 V、20 min，分離膠120 V、60 min，凝膠電泳結(jié)束后考染20 min，脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 CK-BB基因片段的獲得 牛肌酸激酶同功酶CK-BB的全基因人工合成過程見圖2。

2.2 小核苷酸片段的組裝 利用組裝 PCR合成200～300 bp的基因片段。得到6個大小分別為286、220、253、265、230、287 bp的片段 CK-BB1、CK-BB2、CK-BB3、CK-BB4、CK-BB5、CK-BB6。

2.3 牛肌酸激酶全基因的合成 獲得的全長基因產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后進行末端A處理，克隆入pET28b載體并轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），篩選并獲得了陽性克隆子。

2.4 質(zhì)粒雙酶切反應(yīng) 結(jié)果見圖3。

圖3 質(zhì)粒pET28b-CK-BB經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切

圖4 人工合成改造后的牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列

2.5 牛肌酸激酶同功酶CK-BB全基因序列 獲得的CK-BB全基因序列測序結(jié)果見圖4。

2.6 SDS-PAGE分析 結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，在37℃沉淀中目的蛋白有明顯表達。

3 討論

在利用原核表達系統(tǒng)表達真核生物的基因時，由于真核生物基因中的一些密碼子對于原核生物來說是稀有密碼子，可能導致表達效率和表達水平很低［8］。影響目的基因在異源宿主中的表達效率的主要因素是不同宿主對密碼子使用頻率存在差異，因此，通過重新設(shè)計和合成宿主偏愛的密碼子可消除利用率低或稀有的密碼子，從而優(yōu)化目的基因的表達。該研究對牛肌酸激酶基因進行了重新設(shè)計和合成，從而優(yōu)化了該基因的表達。具體包括：①選擇使用大腸桿菌偏愛的密碼子，使合成的基因在E.coli BL21中高效表達；②將相鄰片段的連接粘端設(shè)計成互補堿基，使退火后的基因片段之間能很好連接；③在基因兩端設(shè)計了必要的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位點，便于克隆表達。在該基礎(chǔ)上合成了1 180 bp大小的牛肌酸激酶全基因，經(jīng)測序表明人工合成的基因序列正確。結(jié)果表明，運用優(yōu)化基因的合成策略，可以設(shè)計合成優(yōu)化的目的基因序列。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是20世紀70年代發(fā)展起來的在基因工程中應(yīng)用最為廣泛的表達系統(tǒng)，以其成本低、生產(chǎn)率高、操作簡單等優(yōu)點備受青睞，常作為表達重組蛋白的首選表達系統(tǒng)［8］。經(jīng)典的E.coli BL21（DE3）菌株是lon和omp T蛋白酶缺陷型，而且為T7表達系統(tǒng)設(shè)計，添加了T7聚合酶基因。pET系統(tǒng)是在大腸桿菌中克隆和表達重組蛋白最有效的系統(tǒng)，可生產(chǎn)大量目的蛋白［8］。

圖5 SDS-PAGE分析

在寡核苷酸片段的拆分之前對基因進行密碼子優(yōu)化，應(yīng)主要考慮密碼子的使用頻率、G+C含量、限制性酶切位點和RNA二級結(jié)構(gòu)自由能等。有時目的基因內(nèi)某些重復元件還會影響基因在大腸桿菌內(nèi)的穩(wěn)定性，這些都需要在序列設(shè)計時進行檢查，應(yīng)盡量避免。

該研究利用Vienna RNA二級結(jié)構(gòu)在線軟件（http://rna.tbi.univie.ac.at/），采用RNAfold server對CK-BB基因mRNA折疊自由能進行預測。缺省參數(shù)設(shè)置如下：溫度37℃，Na+離子濃度為1 mol/L，次優(yōu)性數(shù)p%=5%，計算折疊結(jié)構(gòu)數(shù)最大值=50，內(nèi)環(huán)/膨脹環(huán)數(shù)最大值=30。在DNA 2.0軟件的輔助下，以E.coli BL21密碼子使用頻率為基準，同時兼顧mRNA二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和G+C含量，在不改變氨基酸順序的前提下，手動對各簡并密碼子進行了優(yōu)化。

4 結(jié)論

設(shè)計并人工合成了由E.coli BL21（DE3）偏愛密碼子組成的CK-BB基因序列，合成了優(yōu)化的牛肌酸激酶同功酶CK-BB基因，成功構(gòu)建了大腸桿菌表達載體pET28b-CK-BB，經(jīng)卡那霉素抗性篩選獲得了高拷貝的菌株，為牛肌酸激酶同功酶CKBB的大規(guī)模表達純化奠定了基礎(chǔ)。

［1］楊鼎，趙世華，吳江鴻，等.幾種肌酸激酶的檢測方法［J］.畜牧與飼料科學，2015，36（8）：16-19.

［2］王臨光，王海波，付強，等.急性冠脈綜合癥診斷中檢測心肌肌鈣蛋白Ⅰ肌紅蛋白及肌酸激酶同工酶及超敏C-反應(yīng)蛋白的意義［J］.河北醫(yī)學，2006，12（1）：1-3.

［3］何德肆，胡述光，歐陽敘向，等.關(guān)節(jié)滑膜炎奶牛血液部分生化指標的變化 ［J］.中國草食動物，2007，27（1）：44-46.

［4］SATTLER T，F(xiàn)üRLL M.Creatine kinase and aspartate aminotransferase in cows as indicators for endometritis［J］. Journal of Veterinary Medicine Series A，2004，51（3）：132-137.

［5］HOOVER D M，LUBKOWSKIJ.DNAWorks：An automated method for designing oligonucleotides for PCR-based gene synthesis ［J］.Nucleic Acids Res，2002，30（10）：e43.

［6］薩母克魯克.分子克隆實驗指南（上冊）［M］.黃培堂，譯.北京：科學出版社，2002：69-71.

［7］郭亮，沈微，王正祥，等.生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茶氨酸的重組大腸桿菌的構(gòu)建 ［J］.食品與生物技術(shù)學報，2005，24（2）：41-45.

［8］解庭波.大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展［J］.長江大學學報自然科學版：醫(yī)學卷，2008，5（3）：77-82.

（責任編輯：趙俊利）

《畜牧與飼料科學》入選《中國學術(shù)期刊影響因子年報》統(tǒng)計源期刊

2015年10月，中國學術(shù)期刊（光盤版）電子雜志社有限公司、中國科學技術(shù)文獻評價研究中心聯(lián)合發(fā)布了《中國學術(shù)期刊影響因子年報（自然科學與工程技術(shù)·2015版）》?！缎竽僚c飼料科學》入選統(tǒng)計源期刊，并獲頒《中國學術(shù)期刊影響因子年報統(tǒng)計刊源證書》?！吨袊鴮W術(shù)期刊影響因子年報》依據(jù)科技期刊在同學科、同研究層次的總被引頻次、影響因子、下載頻次等多項指標，每年按照“優(yōu)入劣汰”的原則對其收錄的科技期刊進行綜合篩選、評定。該年報的學術(shù)影響力已被眾多學術(shù)單位和科研院所廣泛認可，是我國重要的科技期刊學術(shù)水平評價體系之一。

Whole Gene Synthesis and Prokaryotic Expression of Bovine Creatime Kinase Isoenzyme CK-BB

YANG Ding1，WU Jiang-hong1，QI Yun-xia1，ZHAO Shi-hua2
（1.Inner Mongolia Research Center for Prataculture，Chinese Academy of Sciences，Hohhot 010031，China；2.Institute of Veterinary Medicine，Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot 010031，China）

The creatine kinase plays an important role in bovine energy metabolism.When inflammation occurs,there will be a locally-specific increase of CK.According,the creatine kinase may serve as a potential marker of bovine diseases.In this study,a total of 54 mutually overlapped primers were designed and synthesized according to the published amino acid sequence of bovine creatime kinase isoenzyme CK-BB and the codon usage preferred by E.coli（BL21）.A total of 6 DNA fragments of CK-BB gene, including CK-BB1,CK-BB2,CK-BB3,CK-BB4,CK-BB5 and CK-BB6,were synthesized by assembled PCR assay.Using the mixture of the 6 fragments as template,the second round PCR was conducted with head primer ck-1 and tail primer ck-54,and the amplifying product was connected with vector pET28b.The positive recombinants were subsequently identified,cloned and sequenced.A correct synthetic CK-BB gene was obtained by proofreading PCR assay,which lays a foundation for large-scale preparation of bovine isoenzyme CK-BB.

bovine creatime kinase isoenzyme；codon optimization；whole gene synthesis

S852.23

A文章順序編號：1672-5190（2016）02-0029-05

2016－01－15

項目來源：內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院青年創(chuàng)新基金（2013QN JJM11）。

楊鼎（1981—），男，助理研究員，碩士，主要研究方向為獸醫(yī)微生物與免疫學。

趙世華（1962—），男，研究員，主要從事草食家畜傳染病防控技術(shù)研究與推廣工作。