蒙脫石對黃曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）的體外吸附效果

陳光明，謝玲玲，王 瑩，劉建軍，劉桂蘭，劉愛玲

（瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司，天津 300300）

蒙脫石對黃曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）的體外吸附效果

陳光明，謝玲玲，王 瑩，劉建軍，劉桂蘭，劉愛玲

（瑞普（天津）生物藥業(yè)有限公司，天津 300300）

旨在比較蒙脫石對黃曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）的體外吸附效果。分別在pH值3.0和pH值6.5的條件下，采用ELISA方法評價蒙脫石對AFB1和ZEN的體外吸附效果。結(jié)果表明，pH值3.0條件下，蒙脫石對AFB1的吸附率和吸附量分別為88.00%、440.00 μg/g，對ZEN的吸附率和吸附量分別為7.50%、37.50 μg/g；pH值6.5條件下，蒙脫石對AFB1的吸附率和吸附量分別為84.00%、420.00 μg/g，對ZEN的吸附率和吸附量分別為6.60%、33.00 μg/g。綜上提示，蒙脫石對AFB1的吸附效果較好，對ZEN的吸附效果較差。

蒙脫石；AFB1；ZEN；吸附效果

霉菌毒素是霉菌在生長過程中產(chǎn)生的有毒次級代謝產(chǎn)物，在飼料中檢出率很高［1］。目前已知的能污染飼料的霉菌毒素有100多種，其中對動物危害最嚴(yán)重的霉菌毒素有黃曲霉毒素B1（AFB1）和玉米赤霉烯酮（ZEN）等［2］。霉菌毒素對畜牧業(yè)的危害已受到廣泛關(guān)注，向飼料中添加能夠吸附霉菌毒素的物質(zhì)是成熟、可行的去毒方法，若毒素在腸道內(nèi)不被吸收，則直接被排出體外［3］。近年來，開發(fā)新型高效霉菌毒素吸附劑是飼料添加劑研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。由于動物的胃液pH值范圍在3.0左右，腸道的pH值范圍在6.5左右，因此筆者選擇pH值3.0和pH值6.5條件下模擬動物的胃液和腸道酸堿度，評價蒙脫石對AFB1和ZEN的體外吸附效果。

1 材料與方法

1.1 吸附劑 市售蒙脫石。

1.2 霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品 AFB1和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品各1mg，購自Pribolab公司。

1.3 儀器設(shè)備與試劑 酶標(biāo)儀、恒溫振蕩器、離心機(jī)等；ELISA試劑盒，購自無錫百奧森科技有限公司。

1.4 緩沖溶液的配制 檸檬酸緩沖液：80.3%的0.1 mol/L檸檬酸溶液與19.7%的0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，調(diào)節(jié)pH值至3.0；磷酸氫鈉緩沖液：65.3%的0.067 mol/L磷酸二氫鉀溶液與34.7%的0.067 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合，調(diào)節(jié)pH值至6.5。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)霉菌毒素反應(yīng)液的制備 霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制：分別取AFB1和ZEN標(biāo)準(zhǔn)品1 mg溶于100 mL甲醇溶液中，制成濃度為10 μg/mL的儲備液，-20℃避光保存；標(biāo)準(zhǔn)霉菌毒素反應(yīng)液：分別用pH值3.0的檸檬酸緩沖液和pH值6.5的磷酸鹽緩沖液將霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋10倍，得到濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)霉菌毒素（AFB1和ZEN）反應(yīng)液。

1.6 試驗(yàn)分組 對照組：濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)霉菌毒素（AFB1和ZEN）反應(yīng)液，設(shè)置3個平行，結(jié)果取平均值；試驗(yàn)1組：將蒙脫石20 mg加入到10 mL的標(biāo)準(zhǔn)AFB1反應(yīng)液中（按0.2%的比例，目前市場上脫霉劑與飼料混合的比例多為0.2%），設(shè)置3個平行，結(jié)果取平均值；試驗(yàn)2組：將蒙脫石20 mg（按0.2%的比例）加入到10 mL的標(biāo)準(zhǔn)ZEN反應(yīng)液中，設(shè)置3個平行，結(jié)果取平均值。

1.7 試驗(yàn)步驟 將試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組放入37℃、120 r/min的恒溫?fù)u床中振蕩孵育90 min，然后5 000 r/min離心10 min，收集上清液；將試驗(yàn)1組的上清液稀釋500倍，試驗(yàn)2組的上清液稀釋50倍，用ELISA法檢測上清液中剩余的霉菌毒素含量；將對照組中1 μg/mL的AFB1標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液稀釋500倍，將1 μg/mL的ZEN標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)液稀釋50倍；檢測方法和結(jié)果處理方法參照酶聯(lián)免疫試劑盒說明書進(jìn)行；利用系列AFB1標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、0.1、0.25、0.5、1、2 ng/mL）測得的吸光度OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；利用系列ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、1、2.5、5、10、20 ng/ mL）測得的吸光度OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的常用對數(shù)值（lgC），縱坐標(biāo)為各標(biāo)準(zhǔn)孔OD值與0 ng/L標(biāo)準(zhǔn)孔OD值的比值［B（標(biāo)準(zhǔn)液）/B（0 ng/L）］。

利用以下公式計算吸附率Y（%）和吸附量Q（μg/g）。

Y=（C0-C）/C0×100%

Q=V×（C0-C）×N/m

其中：C0、C分別為反應(yīng)前、反應(yīng)后霉菌毒素的濃度 （ng/mL）；V為溶液的體積 （mL）；N為稀釋倍數(shù)；m為蒙脫石的質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1和ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線 建立的AFB1和ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖1和圖2。由圖1可知，AFB1的回 歸方程為 y=-0.3813x+0.3449，R2= 0.9922；由圖 2可知，ZEN的回歸方程為y=-0.3682x+0.6113，R2=0.9919。

圖1 AFB1的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 ZEN的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 吸附率Y和吸附量Q 由表1可知，在pH值3.0條件下，蒙脫石對AFB1的吸附率和吸附量分別為88.00%、440.00 μg/g，對ZEN的吸附率和吸附量分別為7.50%、37.50 μg/g；pH值6.5條件下，蒙脫石對 AFB1的吸附率和吸附量分別為 84.00%、420.00 μg/g，對 ZEN的吸附率和吸附量分別為6.60%、33.00 μg/g。在pH值3.0和pH值6.5的條件下，蒙脫石對AFB1的吸附率和吸附量都大于ZEN。

表1 不同pH值條件下蒙脫石對霉菌毒素的吸附率和吸附量

3 討論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，蒙脫石對AFB1的吸附效果較好，而對ZEN的吸附效果較差。在吸附劑與霉菌毒素的結(jié)合過程中，霉菌毒素的物理和化學(xué)性質(zhì)是關(guān)鍵因素［4］。Sharom等［5］研究表明，有機(jī)化合物被吸附的量取決于其在水中的溶解性，水溶性越強(qiáng)，其被吸附的量越大。該研究中選取的2種霉菌毒素，AFB1的水溶性較ZEN強(qiáng)。AFB1（結(jié)構(gòu)見圖1）分子量為312，極性很強(qiáng)，是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，?個雙呋喃環(huán)（A和B）和1個氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀–和D）［6］。ZEN（結(jié)構(gòu)見圖2）的分子量為318，是含2個酚羥基的內(nèi)酯，溶于水，只有在堿性環(huán)境下酯鍵才打開，是弱極性或雙極性分子［7］。極性霉菌毒素（如AFB1）可被蒙脫石有效吸附，而非極性霉菌毒素（如ZEN）則幾乎不能被蒙脫石吸附［8］。

圖1 AFB1結(jié)構(gòu)

圖2 ZEN結(jié)構(gòu)

圖3 蒙脫石的晶體結(jié)構(gòu)

蒙脫石（晶體結(jié)構(gòu)見圖3）帶大量負(fù)電荷，對不飽和分子（如帶有缺電子部分的AFB1）有優(yōu)先選擇吸附的能力。AFB1結(jié)構(gòu)中含2個羰基，羰基中帶正電荷的碳原子通過共用蒙脫石表面的電子，與蒙脫石發(fā)生吸附現(xiàn)象［9］。Phillips等［10］提出，蒙脫石的外表面吸附能力很弱，主要吸附位點(diǎn)在蒙脫石的平面層間域。AFB1除末端的雙呋喃環(huán)外，其余部分呈平面結(jié)構(gòu)，更容易進(jìn)入平面層間域。而呈現(xiàn)空間立體結(jié)構(gòu)的ZEN分子因空間位阻效應(yīng)難以進(jìn)入蒙脫石的層間域。

但是，并非所有的蒙脫石對ZEN的吸附率都很低。姚志成等［11］報道，改性后的蒙脫石（通過納米改性或?qū)娱g修飾）對ZEN有很高的吸附率。在pH值7.0的條件下，當(dāng)ZEN的濃度為1 000～2 000 ng/ mL時，加入一定量的改性后的蒙脫石，使其濃度為2.5 mg/mL，結(jié)果顯示，改性后的蒙脫石對ZEN的吸附率達(dá)到92%以上。

4 結(jié)論

在pH值3.0和pH值6.5的條件下，蒙脫石對AFB1的吸附效果較好，而對ZEN的吸附效果較差。

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（責(zé)任編輯：趙俊利）

Performance of Montmorillonite in Absorbing AFB1and ZEN in Vitro

CHEN Guang-ming，XIE Ling-ling，WANG Ying，LIU Jian-jun，LIU Gui-lan，LIU Ai-ling
（Tianjin Ringpu Bio-technology Co.,Ltd.，Tianjin 300300，China）

The study was conducted to compare the performance of montmorillonite in absorbing AFB1and ZEN in vitro. Commercially available ELISA kits were used to assess the adsorption efficiency of montmorillonite for AFB1and ZEN under the condition of pH value 3.0 and 6.5,respectively.The results showed that under the condition of pH value 3.0,the adsorption rate and adsorption capacity of montmorillonite for AFB1were 88.00%and 440.00 μg/g,and those for ZEN were 7.50%and 37.50 μg/ g;under the condition of pH value 6.5,the adsorption rate and adsorption capacity of montmorillonite for AFB1were 84.00%and 420.00 μg/g,and those for ZEN were 6.60%and 33.00 μg/g.It was demonstrated that montmorillonite performed well in absorbing of AFB1in vitro;however,it showed poor ability in absorbing ZEN.

montmorillonite；AFB1；ZEN；adsorption efficiency

S816.7

A文章順序編號：1672-5190（2016）02-0007-03

2016－01－05

陳光明（1987—），男，研發(fā)工程師，碩士，主要研究方向?yàn)槲⑸鷳B(tài)與酶制劑。