清開靈注射液中水難溶性成分在不同條件下的表觀溶解度測定△

劉瑞新，李宇輝，高曉潔，史新元，喬延江*

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102)

清開靈注射液中水難溶性成分在不同條件下的表觀溶解度測定△

劉瑞新1,2，李宇輝2，高曉潔2，史新元3，喬延江3*

(1.河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000；2.河南中醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450008；3.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100102)

目的測定清開靈注射液中3種水難溶性成分黃芩苷(BCL)、膽酸(CA)、豬去氧膽酸(HA)在不同條件下的表觀溶解度，為增溶研究提供基礎(chǔ)。方法將BCL、CA、HA制成水及不同pH值緩沖液的飽和溶液，采用HPLC法，借鑒《中華人民共和國藥典》2010版一部中清開靈注射液中難溶性成分含量測定方法進行測定。結(jié)果(25.0±0.5)℃、pH 5.78的去離子水中，BCL的表觀溶解度為0.048 7 mg·mL-1，為“幾乎不溶或不溶”范疇；CA的表觀溶解度為0.147 9 mg·mL-1，為“極微溶解”范疇；HA的表觀溶解度非常小，在該高效液相色譜-二級陣列管檢測器(HPLC-DAD)條件下未能檢出；但在一定pH范圍的緩沖溶液中，BCL、CA、HA的溶解度隨pH增大而激增，在pH 7.6的緩沖液中，BCL、CA的溶解度分別相當(dāng)于pH 5.78的去離子水中的1555倍、131倍。結(jié)論在不同pH條件下，3種水難溶性成分的表觀溶解度差異較大，應(yīng)調(diào)節(jié)適宜的pH以滿足制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對各成分含量的要求。

清開靈注射液；表觀溶解度；黃芩苷；膽酸；豬去氧膽酸

溶解性是制藥工業(yè)的重要課題[1]?，F(xiàn)代制藥工業(yè)中公認(rèn)，新發(fā)現(xiàn)的候選藥物平均有多于40%的是水難溶的[2]。中藥品種繁多、成分復(fù)雜、性質(zhì)各異，其有效成分從小分子到大分子，從水溶性到脂溶性甚至脂水均難溶都有存在。目前亦有較多通過體外方法證明有一定藥理活性、具備開發(fā)潛力的中藥成分或成分群，常因其溶解性不佳而無法直接制成用于臨床的、安全、有效、穩(wěn)定的制劑[3-4]。此外，中藥制劑尤其是中藥液體制劑[5]，在其制備或儲藏過程中，可能因雜質(zhì)未除盡、pH值不適當(dāng)，或各種成分之間互相增溶，使藥液暫時處于穩(wěn)定狀態(tài)，而在放置過程中極易發(fā)生氧化、聚合及pH值的改變，導(dǎo)致不溶性物質(zhì)逐漸生成而使微粒數(shù)增加[6]，最終出現(xiàn)渾濁、沉淀、乳光等現(xiàn)象[7]，甚至引發(fā)一系列不良反應(yīng)等[8-9]。因此，除前期對某些單體難溶性成分進行結(jié)構(gòu)修飾，如結(jié)合增溶基團等化學(xué)方法之外，尋找適宜的藥劑學(xué)方法解決中藥難溶性成分的增溶問題意義重大[10-12]，這也是中藥制劑研究中的關(guān)鍵和熱點問題之一。

清開靈注射液(QKL)由北京中醫(yī)藥大學(xué)研制，衍生于清代吳鞠通《溫病條辨》中的安宮牛黃丸，由膽酸、豬去氧膽酸、水牛角(粉)、珍珠母(粉)、黃芩苷等組成，是國家中醫(yī)藥管理局推薦治療急性熱病必備的中成藥，為臨床常用藥。方中膽酸(Cholic Acid，CA)、豬去氧膽酸(Hyodeoxycholic Acid，HA)代替了傳統(tǒng)的牛黃作為君藥，黃芩苷(Baicalin，BCL)為佐藥，三者溶解度均低于10 mg·mL-1，屬微溶(為廣義難溶范疇)，在制備和貯藏過程中有可能受pH、溫度、工藝過程等因素的影響而沉淀析出。

本文對清開靈注射劑中3個難溶性成分的表觀溶解度等物理、化學(xué)屬性進行研究，為后續(xù)的增溶研究提供依據(jù)[13]。筆者主要研究了3個水難溶性成分在去離子水、不同pH的磷酸鹽緩沖液中的表觀溶解度，以及某些成分在乙醇中的表觀溶解度。在新藥研發(fā)過程中重視水難溶性成分，在遵循中醫(yī)方劑組方的基礎(chǔ)上，要確保液體制劑中水難溶性有效成分的含量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料

1.1 試藥

BCL、CA、HA標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥食品藥品檢定研究院，批號分別為110715-200514，100078-200414，100087-200610)；BCL原料(山東魯抗大禹制藥有限公司，批號：08041150，經(jīng)實際測定純度以BCL標(biāo)準(zhǔn)品計為93.2%)；CA原料(福建仙游生化有限公司，批號：08040947，經(jīng)實際測定純度以CA標(biāo)準(zhǔn)品計為97.7%)；HA原料(福建仙游生化有限公司，批號：07092265，經(jīng)測定純度以HA標(biāo)準(zhǔn)品計為79.8%)；甲醇、乙腈為色譜純；水為去離子水、娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀(包括在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD二極管陣列檢測器、HP ChemStation數(shù)據(jù)處理工作站)；Waters 2695 高效液相色譜儀、2996型DAD二極管陣列檢測器、Millennium 色譜管理工作站；Sartorius BP211D型電子天平；PHS-3C精密pH計(上海雷磁儀器廠)；SHA-CA水浴恒溫振蕩器(榮華儀器)；TDL-5-A臺式離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 BCL在水及不同pH值緩沖液中的表觀溶解度測定

2.1.1 不同pH值緩沖液的制備 分別取一定量的十二水磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)和檸檬酸制成100 mL的不同pH的緩沖溶液[14]，見表1。

表1 不同pH的緩沖液

2.1.2 飽和液制備 BCL飽和溶液的制備：稱取BCL原料適量(使適當(dāng)過量)，置50 mL磨口三角瓶中，加適量去離子水(經(jīng)實測pH 5.78)蓋好，旋渦混合30 s[15]，放入(25.0±0.5) ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩24 h，1000 r·min-1離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

BCL在緩沖液中的飽和溶液的制備：分別稱取BCL原料適量(使適當(dāng)過量)，置50 mL磨口三角瓶中，加上述不同pH的緩沖溶液，塞緊，旋渦混合30 s，放入(25.0±0.5) ℃水浴恒溫振蕩器中振蕩24 h，1000 r·min-1離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 含量測定方法 借鑒《中華人民共和國藥典》2010版藥典一部[16]中清開靈注射液中的BCL含量測定方法進行測定，經(jīng)進一步的有關(guān)驗證，方法可靠。色譜圖見圖1。

注：A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.原料。圖1 黃芩苷HPLC圖

色譜條件：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇-水-磷酸(47∶53∶0.2)為流動相；檢測波長為276 nm；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min-1。

對照品溶液的制備：精密稱取BCL對照品適量，置100 mL量瓶中，加70%乙醇適量，使溶解，加流動相1 mL，再加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.052 9 mg·mL-1的對照品溶液Ⅰ；取對照品溶液Ⅰ，用70%乙醇稀釋5倍，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得對照品溶液Ⅱ(質(zhì)量濃度為0.010 6 mg·mL-1)。

供試品溶液的制備：精密量取上述BCL飽和液的續(xù)濾液2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法：分別精密吸取對照品溶液Ⅱ與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.2 CA在水及在不同pH值緩沖液中的表觀溶解度測定

2.2.1 不同pH值緩沖液的制備 參照2.1.1。

2.2.2 飽和液制備 CA飽和溶液的制備：稱取CA原料適量(使適當(dāng)過量)，置50 mL磨口三角瓶中，分別加適量去離子水(經(jīng)實測其pH為5.78)，蓋好，旋渦混合30 s，放入恒溫?fù)u床中振蕩24 h，1000 r·min-1離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

CA在緩沖液中的飽和溶液的制備：分別稱取CA原料適量(使適當(dāng)過量)，置50 mL磨口三角瓶中，加上述不同pH的緩沖溶液，塞緊，旋渦混合30 s，放入恒溫?fù)u床中振蕩24 h，1000 r·min-1離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 含量測定方法 借鑒《中華人民共和國藥典》2010版一部[16]中清開靈注射液中的CA含量測定方法進行測定，經(jīng)進一步的有關(guān)驗證，方法可靠。色譜圖見圖2。

注：A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.原料；C.樣品。圖2 膽酸的HPLC圖

色譜條件：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈-水-磷酸(45∶55∶0.1)為流動相；檢測波長為192 nm；柱溫為40 ℃；流速為1 mL·min-1。

對照品溶液的制備：精密稱取CA對照品適量，置10 mL量瓶中，加60%乙腈使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.099 mg·mL-1的CA對照品溶液Ⅰ；取對照品溶液Ⅰ，用60%乙腈稀釋10倍，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得CA對照品溶液Ⅱ(質(zhì)量濃度為0.110 mg·mL-1)。

供試品溶液的制備：精密量取上述CA飽和液的續(xù)濾液適量，用適宜溶劑(乙腈)稀釋1倍，稀釋液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法：分別精密吸取適宜的CA對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 HA在水、75%乙醇(潛溶)和不同pH值緩沖液中的溶解度測定

2.3.1 不同pH值緩沖液的制備 參照2.1.1。

2.3.2 HA飽和液制備 HA飽和液制備：稱取HA原料適量(使適當(dāng)過量)，置50 mL磨口三角瓶中，分別加適量去離子水(經(jīng)實測pH 5.78)、75%乙醇、pH 7.0、pH 7.6、pH 7.8 和pH 8.0的磷酸鹽緩沖液，蓋好，旋渦混合30 s，放入恒溫?fù)u床中振蕩24 h，1000 r·min-1離心10 min，取上清液以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 含量測定方法 借鑒《中華人民共和國藥典》2010版一部[16]中清開靈注射液中的HA含量測定方法以及文獻(xiàn)方法[17]進行測定，經(jīng)進一步的有關(guān)驗證，方法可靠。色譜圖見圖3。

注：A.標(biāo)準(zhǔn)品；B.原料；C.樣品。圖3 豬去氧膽酸的HPLC圖

色譜條件：同2.2.3。

對照品溶液的制備：精密稱取HA對照品適量，置10 mL量瓶中，加60%乙腈使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.028 mg·mL-1的HA對照品溶液Ⅰ；取對照品溶液Ⅰ，用60%乙腈稀釋10倍，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得HA對照品溶液Ⅱ(質(zhì)量濃度為0.102 8 mg·mL-1)。

供試品溶液的制備：精密量取上述HA飽和液的續(xù)濾液適量，用適宜溶劑(適宜濃度的乙腈)稀釋1倍，稀釋液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。

測定法：分別精密吸取適宜的HA對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 BCL、CA、HA在水中的表觀溶解度

(25.0±0.5)℃、pH 5.78的去離子水中，BCL原料中BCL表觀溶解度以BCL對照品計，為0.048 7 mg·mL-1，屬幾乎不溶或不溶范疇。CA原料中CA的表觀溶解度以CA對照品計，為0.147 9 mg·mL-1，屬極微溶解范疇。HA原料中HA的表觀溶解度非常小，在該HPLC-DAD條件下未能檢出。從后續(xù)試驗中不同pH緩沖液中的溶解度及檢測器的檢測限推斷，其溶解度應(yīng)遠(yuǎn)低于0.3 mg·mL-1，應(yīng)屬極微溶解范疇或更低溶解度范疇。文獻(xiàn)[18]中為0.06 mg·mL-1(20 ℃)，屬幾乎不溶或不溶范疇。此外，在(25.0±0.5)℃、75%乙醇中，在該測定條件下，HA原料中HA的表觀溶解度為187.3 mg·mL-1。

清開靈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對HA的濃度未做適當(dāng)限定和要求。按照其處方組成，假定制備工藝的收率為80%，其濃度應(yīng)為3.0 mg·mL-1。從上述結(jié)果可以看出，其溶解度遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到該濃度。在75%乙醇中，其溶解度較大，故制備工藝中采用75%乙醇溶解。但因其在水中和中性緩沖液中的溶解度非常小，故水沉步驟HA的損失非常大。

3.2 BCL、CA、HA在不同pH緩沖液中的表觀溶解度

結(jié)果見圖4。

注：A.BCL；B.CA；C.HA。圖4 不同pH環(huán)境難溶性成分的表觀溶解度

由圖可知，三成分溶解度均隨pH升高而顯著升高。結(jié)果顯示，BCL、CA、HA自身溶解度均非常小，但在一定pH范圍內(nèi)，其溶解度隨pH增大而激增。如在pH 7.6的緩沖液中，BCL、CA的溶解度分別相當(dāng)于pH 5.8的去離子水中的1555倍、131倍。按中華人民共和國藥典標(biāo)準(zhǔn)，在該溶解度條件下，隨著pH值由4.0逐漸增加至7.8，BCL溶解性能逐步由極微溶解(0.1～1 mg·mL-1)變化至溶解(33～100 mg·mL-1)；隨著pH值由4.0逐漸增加至8.0，CA溶解性能逐步由極微溶解(0.1～1 mg·mL-1)變化至略溶(10～33 mg·mL-1)。

BCL在pH 7.6～8.0時，其溶解度不再升高，甚至有所降低。這是因為BCL在堿性條件下不穩(wěn)定，發(fā)生化學(xué)變化，使得溶解度不再隨pH升高而繼續(xù)升高。由于該磷酸鹽緩沖體系的最大pH為8.0，因此無法預(yù)知pH 8.0以上時BCL的溶解度情況。測試了硼酸緩沖體系在pH 8.0以上時BCL的溶解情況，發(fā)現(xiàn)較上述磷酸鹽緩沖體系中pH 8.0處的溶解度大為降低，但隨著pH升高又逐步升高。緩沖體系的差異使得二者不能統(tǒng)一比較。

清開靈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求其pH應(yīng)在6.8～7.5，BCL濃度應(yīng)為3.5～5.8 mg·mL-1，CA濃度應(yīng)不低于1.5 mg·mL-1。對該緩沖體系中相應(yīng)pH值條件下BCL、CA的表觀溶解度進行類比，其溶解度均能夠達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

在一定pH值范圍內(nèi)，可以對BCL等成分的溶解度進行直觀預(yù)測。可分別給出以下預(yù)測方程：在pH 5.2～7.6時，Y=6.670X2-54.16X+103.3(r=0.998 0)，在pH 4.0～5.8時，Y=2×10-7-07e3.108X(r=0.992 0)。

4 小結(jié)

結(jié)果表明，在(25.0±0.5) ℃、pH 5.78的去離子水中，BCL的表觀溶解度為0.048 7 mg·mL-1，屬幾乎不溶或不溶范疇；CA的表觀溶解度為0.147 9 mg·mL-1，屬極微溶解范疇；HA的表觀溶解度非常小，在該HPLC-DAD條件下未能檢出；但在一定pH范圍的緩沖溶液中，BCL、CA、HA的溶解度隨pH增大而激增，如在pH 7.6的緩沖液中，BCL、CA的溶解度分別相當(dāng)于pH 5.8的去離子水中的1555倍、131倍。根據(jù)清開靈注射液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在pH 6.8～7.5條件下，BCL濃度應(yīng)為3.5～5.8 mg·mL-1，CA濃度應(yīng)不低于1.5 mg·mL-1，HA的濃度未做適當(dāng)限定的要求，對緩沖體系中相應(yīng)pH值條件下BCL、CA的表觀溶解度進行類比，其溶解度均能夠達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求。

[1] 鐘慧，朱源，余江南，等.難溶性天然藥物增溶方法的研究進展[J].中國中藥雜志，2014，39(17)：3226-3231.

[2] Liu R.Water-insoluble Drug Formulation[M].2nd ed.Crc Press,2008.

[3] 黃敬.針對不溶性藥物的注射給藥系統(tǒng)的設(shè)計和研發(fā)[C].//2014第十二屆國際新藥發(fā)明年會.蘇州：國家外國專家局國外人才信息研究中心，2014.

[4] 李緒翠.中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與用藥安全的相關(guān)性[J].藥物流行病學(xué)雜志，2012，21(11)：38-40.

[5] 張海燕，齊云，廖永紅，等.注射劑常用增溶性藥用輔料的安全與增溶研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17(11)：1-4.

[6] 劉睿.中藥注射劑質(zhì)量控制的研究進展[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2013，10(03)：37-42.

[7] 劉春蘭，許月峰.增溶劑的增溶原理及其在制劑生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國藥業(yè)，2008，17(04)：13-14.

[8] 崔宏玉，梁愛華.從中藥注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析其不良反應(yīng)成因[J].中國中藥雜志，2014，39(05)：934-940.

[9] 楊杰鋒.中藥注射劑安全性再評價管理探究及對策[D].濟南：山東大學(xué)，2012.

[10] 張波，張東娜，王洪權(quán)，等.難溶性藥物增溶技術(shù)的研究進展[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2009，25(05)：425-428.

[11] 寧寧.難溶性藥物增溶材料的研究進展[J].新材料產(chǎn)業(yè).2014(06)：46-49.

[12] 汪菊芬，吳旭日，陳依軍.注射用難溶藥物增溶技術(shù)的研究進展[J].藥物生物技術(shù)，2014，21(03)：253-259.

[13] 金云峰，劉瑞新，李宇輝，等.非離子型表面活性劑對清開靈注射液中難溶性成分的增溶研究[J].中國現(xiàn)代中藥，2016,18(02):213-218.

[14] 梁生旺.中藥制劑分析[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003.

[15] 仇峰.黃芩苷和氧化苦參堿的物理化學(xué)性質(zhì)和藥物動力學(xué)研究[D].沈陽：沈陽藥科大，2002.

[16] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[17] 張莉，繆建國.HPLC法測定清開靈注射液中豬去氧膽酸的含量[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2007，14(10)：46-47.

[18] NLM，ChemIDplus Advanced.[EB/OL] [2010-04-13].http：//chem.sis.nlm.nih.gov/chemidplus/.

ApparentSolubilityDeterminationofInsolubleIngredientsinQingkailingInjectionunderDifferentConditions

LIURuixin1,2，LIYuhui2，GAOXiaojie2，SHIXinyuan3，QIAOYanjiang3*

(1.DepartmentofPharmacy，theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine(TCM),Zhengzhou450000,Henan,China; 2.HenanUniversityofTCM,Zhengzhou450008,Henan,China; 3.BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective：Qingkailing Injection which contains three insoluble ingredients：baicalin (BCL)，cholic acid (CA) and hyodeoxycholic acid (HA)，the above three ingredients were used as research carriers and determine the Apparent Solubility under different conditions.MethodsThe saturated solution of BCL，CA，HA into water and buffer solution of different pH value，HPLC was used to determine the contents of insoluble ingredients of Qingkailing Injection and reference to “Chinese Pharmacopoeia” 2010 Edition of method.ResultsIn the deionized water (25.0±0.5) ℃，pH 5.78，the Apparent Solubility of BCL and CA were 0.048 7，0.147 9 mg·mL-1，respectively；BCL belong to the category of “very slightly soluble”,CA belong to the category of “slightly soluble”.The Apparent Solubility of HA were under the LOD by HPLC-DAD；The solubility of BCL，CA and HA all increased remarkably with buffer of a certain pH value，In buffer solution(pH 7.6)，the solubility of BCL，CA were equivalent to 1555 times，131 times of the deionized water (pH 5.78)，respectively.ConclusionUnder the conditions of different pH value，the difference of apparent solubility of three insoluble ingredients is relatively large，and the appropriate value should be adjusted to meet the requirements of the content of each component in the quality standard of the preparation.

Qingkailing Injection；apparent solubility；baicalin；cholic acid；hyodeoxycholic acid

2015-09-28)

國家自然科學(xué)基金(81001646)；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(200708006)

*

喬延江，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥質(zhì)控方法學(xué)與中藥信息學(xué)；Tel：(010)84738620，E-mail：yjqiao@263.net

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.023