4種誘抗劑對三七生長、抗病性及相關(guān)酶活性的影響△

左應(yīng)梅，簡邦麗，黃正鴻，楊紹兵，楊天梅，楊維澤，楊美權(quán)，許宗亮，張金渝*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云縣農(nóng)業(yè)局，云南 臨滄 675803；3.寧蒗縣植保植檢站，云南 麗江 674300)

4種誘抗劑對三七生長、抗病性及相關(guān)酶活性的影響△

左應(yīng)梅1，簡邦麗2，黃正鴻3，楊紹兵1，楊天梅1，楊維澤1，楊美權(quán)1，許宗亮1，張金渝1*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650200；2.云縣農(nóng)業(yè)局，云南 臨滄 675803；3.寧蒗縣植保植檢站，云南 麗江 674300)

目的為了探討茉莉酸甲酯(MeJA)、苯并噻二唑(BTH)、DL-β氨基丁酸(BABA)、3-丙酮基-3-羥基羥吲哚(AHO)對三七生長和抗病性的影響。方法在三七上噴施不同濃度的誘抗劑，然后測定其生長指標(biāo)，抗病性，過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等防御酶活性。結(jié)果各種試劑處理后，三七的株高、莖粗、葉長、葉寬等生長性狀得到改善，但植株葉片防御酶活性和植株抗病性的變化并不一致，其中MeJA 50 mg·L-1和AHO 200 mg·L-1處理的三七植株的生理指標(biāo)總體上好于對照，抗病性明顯比對照高。結(jié)論采用MeJA 50 mg·L-1和AHO 200 mg·L-1噴施三七植株，可以使株高、莖粗、葉片長寬和單株根干重增加，并降低植株發(fā)病率和病情指數(shù)，可以考慮在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

三七；誘抗劑；生長指標(biāo)；誘導(dǎo)抗病性；防御酶活性

三七Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen是五加科人參屬植物，是云南獨具特色的生物資源，它的根是著名的傳統(tǒng)重要中藥材。由于三七生長環(huán)境陰蔽潮濕，其獨特的生長環(huán)境易引起多種病害，嚴(yán)重影響著三七的產(chǎn)量與質(zhì)量，極大地制約著三七產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1]?，F(xiàn)在生產(chǎn)上采用栽培措施及化學(xué)防治雖有一定的效果，但隨之而來的環(huán)境污染和產(chǎn)生抗性等一系列問題也日益突出。植物病害誘抗劑在很低濃度下即可被植物識別為信號物質(zhì)，誘發(fā)植物自身的免疫系統(tǒng)，最終使植物獲得抵御病害的能力[2]。因此植物病毒誘抗劑可以使植物更好地抵御病害，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，使植物更好的生長，提高三七的產(chǎn)量和品質(zhì)。

茉莉酸甲酯(MeJA)、苯并噻二唑(BTH)、DL-β-氨基丁酸(BABA)、3-丙酮基-3-羥基羥吲哚(AHO)這4種誘抗劑分別在水稻[3-5]、香蕉[6]、辣椒[7-8]、黃瓜[9-11]、番茄[12-13]、棉花[14]、苧麻[15]等多種作物上已有誘導(dǎo)抗病的研究，而在三七上很少見報道。

本研究采用MeJA、BTH、BABA和AHO等4種誘抗劑的不同濃度對三七進(jìn)行處理，然后觀測三七生長性狀，測定防御酶活性變化，調(diào)查抗病性的強弱，探討利用誘抗劑來解決三七在種植及生長過程中的一些不利因素。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

試驗于2013年2月5日至11月25日在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所的小哨試驗基地進(jìn)行，以大小一致、來源相同、無破損及病害的一年生三七苗為材料，采用盆栽方式。選擇茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)、苯并噻二唑(Benzothiadiazole，BTH)、DL-β氨基丁酸(DL-β-aminobutyric acid，BABA)、3-丙酮基-3-羥基羥吲哚(3-acetonyl-3-hydroxyoxindole，AHO)等4種誘抗劑，每種誘抗劑設(shè)3個濃度(表1)，對照采用清水處理(CK)。每個盆按株行距10 cm×10 cm定植(4株/盆)，每個處理6盆，3次重復(fù)。于2013年5月10日噴施一次誘抗劑，以后間隔40 d噴施一次，共5次。

1.2 調(diào)查指標(biāo)及方法

1.2.1 生長指標(biāo)及產(chǎn)量的測定 于2013年11月25日，最后一次噴施誘抗劑20 d后，每個處理選擇具有代表性的5個植株，3次重復(fù)，測定株高、莖粗、小葉長和寬及地下部分干物質(zhì)產(chǎn)量。

1.2.3 防病效果的測定 于2013年11月25日，最后一次噴施誘抗劑20 d后，將三七植株挖出，觀察統(tǒng)計發(fā)病情況，發(fā)病植株的評判標(biāo)準(zhǔn)為：葉片有黃色、黑褐色或水浸狀暗色病斑、葉緣皺褶、凋葉較多、根部有銹斑和裂痕等。植株發(fā)病率(%)=發(fā)病樣本數(shù)/調(diào)查樣本數(shù)×100。病情指數(shù)=普遍率×嚴(yán)重率(嚴(yán)重率用百分率表示)，式中普遍率指田間病害發(fā)生程度，以株為單位，用出現(xiàn)病癥的植株數(shù)占總調(diào)查植株數(shù)的百分?jǐn)?shù)來表示(普遍率=調(diào)查染病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))；嚴(yán)重率，是指植物受害的嚴(yán)重程度，根據(jù)植株染病情況分少、5%、10%、25%、40%、65%、80%、100%八個嚴(yán)重率等級(嚴(yán)重率=受病植株嚴(yán)重率之和/病株數(shù)×100)[16]。

1.2.4 防御酶活性測定 第一次噴施誘抗劑后的 5 d、10 d和30 d分別取5株測定其過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

酶液提?。悍Q取新鮮三七葉片約0.500 0 g于預(yù)冷的研缽中，加適量預(yù)冷的0.05 mol·L-1(pH7.8)磷酸緩沖液、少量石英砂和聚乙烯吡咯烷酮在冰浴上研磨成漿，轉(zhuǎn)移至刻度離心管中，用緩沖液沖洗研缽2～3次，使終體積為8 mL。將提取液于4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min，上清液用于SOD、POD、CAT活性測定。

超氧化物歧化酶(SOD)總活性采用NBT(淡藍(lán)四唑)光還原法測定，以抑制NBT光還原反應(yīng)50%所需的酶量為一個酶活性單位(U)，活性以U·g-1(FW)表示；過氧化物酶(POD)活性采用愈刨木酚顯色法測定，以每分鐘OD470變化0.01為一個過氧化物酶活性單位(U)，活性以U·g-1(FW)表示；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定以1 min內(nèi)OD240降低0.01為一個酶活性單位(U)，活性以U·g-1(FW)表示[17]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

利用Microsoft Excel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，利用JMP7軟件的Tukey HSD法α=0.05水平上檢驗不同處理之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘抗劑處理對三七抗病性誘導(dǎo)的影響

由表1可知，誘抗劑處理后只有AHO 500 mg·L-1、AHO 200 mg·L-1、MeJA 100 mg·L-1、MeJA 50 mg·L-1和BTH 50 mg·L-1的病情指數(shù)和發(fā)病率比對照低，其中處理MeJA 50 mg·L-1的發(fā)病率和病情指數(shù)分別比對照降低10.0和9.8個百分點；處理AHO 200 mg·L-1發(fā)病率和病情指數(shù)分別比對照降低8.4和7.0個百分點，二者的防治效果較好。不同誘抗劑及其不同濃度處理后三七植株的發(fā)病情況存在差異，如MeJA 和BTH處理的植株抗病率隨著濃度的增加而降低；而AHO處理的植株抗病率隨著濃度的增加而增加，說明在同種藥劑中，誘抗劑濃度對于植株的誘抗性很重要，應(yīng)選擇每種藥劑較好的濃度作為試驗處理。

表1 不同誘抗劑處理對三七抗病性誘導(dǎo)的影響

2.2 誘抗劑處理對三七生長指標(biāo)的影響

由表2可知，各種誘抗劑處理三七植株后，除了MeJA200 mg·L-1處理的莖粗，MeJA 100 mg·L-1處理的株高、莖粗比對照差外，其余處理的植株生長性狀均得到不同程度改善。其中AHO 500 mg·L-1的株高、莖粗、葉長、葉寬最好，AHO 200 mg·L-1次之。

表2 誘抗劑處理對三七植株生長指標(biāo)的影響

注：同列數(shù)據(jù)后小寫英文字母不同者表示差異顯著，表3同。

2.3 誘抗劑處理對三七生物量的影響

由表3可知，各種誘抗劑處理三七植株后，除了MeJA 50 mg·L-1、AHO 100 mg·L-1、AHO 200 mg·L-1、AHO 500 mg·L-1的全株干重和單株根干重比CK增加外，其余處理均比CK減少。其中MeJA 50 mg·L-1和AHO 200 mg·L-1的全株干重分別比CK增加30.2%和17.5%；單株根干重的增加幅度最大，分別比CK增加35.7%和21.1%。

表3 誘抗劑處理對三七植株生物量的影響

2.4 誘抗劑處理對三七葉片防御酶活性的影響

由圖1-A可知，隨著誘抗劑處理時間的增長，各種誘抗劑誘導(dǎo)葉片的CAT酶活性的增幅總體上呈上升的趨勢，其中BTH 200 mg·L-1的酶活性增幅較大，在噴施藥劑30 d內(nèi)酶活性顯著高于對照。

由圖1-B可知，隨著誘抗劑處理時間的增長，各種誘抗劑誘導(dǎo)葉片的POD酶活性的增幅總體上呈先升高再降低的趨勢，處理后期下降趨勢減緩，但大多數(shù)酶活性均高于對照。MeJA 100 mg·L-1的酶活性增幅較大，在處理10 d內(nèi)酶活性較高。AHO 200 mg·L-1POD酶活性在噴施藥劑30 d時降到最低。

由圖1-C可知，隨著誘抗劑處理時間的增長，除了BABA 1000 mg·L-1、MeJA 50 mg·L-1和AHO 100 mg·L-1處理的SOD酶活性呈下降趨勢，其余處理的SOD酶活性增幅總體呈上升趨勢。其中BTH 200 mg·L-1SOD酶活性在噴施藥劑30 d內(nèi)顯著高于對照。

注：圖中A1、A2、A3分別為 200、100、50 mg·L-1的MeJA溶液；B1、B2、B3分別為200、100、50 mg·L-1 的BTH溶液；C1、C2、C3分別為1500、1300、1000 mg·L-1 的BABA溶液；D1、D2、D3分別為 500、200、100 mg·L-1 的AHO溶液；CK為對照(清水);同一圖例中不同小寫字母表示P值在0.05水平差異顯著。圖1 誘抗劑對三七葉片防御酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

誘導(dǎo)抗性在植物中的應(yīng)用是一個具有廣闊前景的環(huán)境友好型的控制植物病蟲害的方法，降低了植物的生理、生態(tài)損失，降低殘毒和對天敵的傷害作用[18]，而且還對人畜安全、抗菌譜廣、可減少使用化學(xué)農(nóng)藥，保護(hù)環(huán)境，有效的避免農(nóng)藥 3R(抗藥性、再猖獗、殘留)問題[19]。本試驗篩選出利用MeJA 50 mg·L-1和AHO 200 mg·L-1噴施三七植株，可以使株高、莖粗、葉長、葉寬、單株根干重和植株抗病率增加?？梢钥紤]在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。

植物被誘導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性常常是通過酶的催化調(diào)節(jié)實現(xiàn)的，防御酶活性升高是誘導(dǎo)抗性產(chǎn)生的重要機制之一[20]。MeJA是新發(fā)現(xiàn)的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是植物誘導(dǎo)抗病研究領(lǐng)域應(yīng)用較廣的一種高活性激發(fā)子。許多研究表明，外源MeJA 能誘導(dǎo)植物相關(guān)防御酶活性增強，提高植物抵御病原物侵入的能力。在本試驗中，較低濃度的MeJA誘導(dǎo)效果最好，隨著濃度的升高，誘導(dǎo)效果反而下降，這與MeJA 誘導(dǎo)水稻抗稻瘟病[21]和水稻抗白葉枯病菌結(jié)果類似[22]。試驗中MeJA 50 mg·L-1處理的CAT和POD酶活性增加，植株抗病性最好，這表明該濃度的MeJA可誘導(dǎo)增強防御酶活性，提高三七植株抵抗病原菌侵染的能力。BTH是首個人工合成的誘抗劑，其自身沒有抑菌活性，但施用外源的 BTH 可以很好地誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，從而抵抗病原菌的侵染。本試驗中BTH處理的CAT 和SOD酶活性的增加，與甜瓜[23]、芒果[24]上的結(jié)果一致。而BTH 200 mg·L-1處理的CAT和SOD酶活性顯著增加，持續(xù)時間最長，但抗病性較差，未能證明其在三七生長中有很好的預(yù)防作用。BABA是一種由番茄根系分泌的非蛋白氨基酸，對環(huán)境安全，具有高效誘抗作用，被認(rèn)為是一種應(yīng)用前景極為廣泛的植物化學(xué)誘導(dǎo)劑[25]。本試驗中，BABA 1500 mg·L-1處理的植株的酶活性增加，但抗病性最差，與水稻[26]上的結(jié)果不一致，未能證明其在三七生長中有很好的預(yù)防作用。AHO是從馬藍(lán)Strobilanthescusia中分離得到的一種天然產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)其對煙草花葉病(TMV)有較好的抑制效果[27-28]，目前AHO處理提高作物防御酶活性，增強抗病性的研究報道較少。本試驗中，AHO 500 mg·L-1和AHO 200 mg·L-1處理CAT和SOD酶活性增加，且兩者的誘抗效果均比對照好，這表明該濃度的AHO可誘導(dǎo)增強防御酶活性，提高三七植株抵抗病原菌侵染的能力。

綜上所述，在三七植株上施用MeJA 50 mg·L-1處理的CAT和POD酶活性增加，植株抗病性最好，而更高濃度的MeJA施用，誘導(dǎo)效果反而下降。AHO 200 mg·L-1處理CAT和SOD酶活性增加，植株抗病性較好，而濃度更高或更低，誘導(dǎo)效果反而下降。這表明，MeJA、AHO在三七上的使用，誘導(dǎo)效應(yīng)并不是隨著誘抗劑濃度的升高而增強，二者的噴施濃度分別以50 mg·L-1和200 mg·L-1最好。此外，BTH 200 mg·L-1處理的CAT和SOD酶活性顯著增加，BABA 1500 mg·L-1處理的植株3種酶活性均增加，但兩個處理的抗病性均較差，這表明誘抗劑對作物具有專屬性，某些處理的生長指標(biāo)，防御酶活性以及染病情況不能確定其誘導(dǎo)性的好壞。試驗中酶活性在后期有下降趨勢，可能由于各種藥劑的處理時間，方式及有效使用濃度的影響；誘抗劑處理后并沒有進(jìn)行接種實驗，屬于自然發(fā)病，主要是探討幾種誘抗劑對三七病害的綜合防治效果。在以后的試驗中，增加誘抗劑的濃度范圍，誘抗劑處理時間，確定病原菌的種類，與抗病有關(guān)的生化指標(biāo)測定等與誘抗性有關(guān)的因素應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行機理研究。

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EffectsofFourChemicalInducersonGrowthDiseaseResistanceandtheActivitiesofRelatedEnzymesinPanaxnotoginseng

ZUOYingmei1，JIANBangli2,HUANGZhenghong3，YANGShaobing1，YANGTianmei1，YANGWeize1，YANGMeiquan1，XUZongliang1，ZHANGJinyu1*

(1.InstituteofMedicinalPlant，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming650200，China;2.AgricultureBureauofYunCounty,Lincang675803,China;3.PlantPortectivestationofNinglangCounty,Lijiang674300,China)

Objective：In order to investigate the effects of Methyl jasmonate(MeJA)，Benzothiadiazole(BTH)，DL-β-aminobutyric acid(BABA)，and 3-acetonyl-3-hydroxyoxindole(AHO)treatments on growth and disease resistance ofPanaxnotoginseng.MethodsDifferent concentrations of different inducers were used toP.notoginseng，then growth indexes，disease index and the defensive enzymes activities ofP.notoginsengwere observed and detected.ResultsAll the inducers could improve plant growth including plant height，stem diameter，the length and width of leaves，but the defensive enzymes activities and disease resistance were different.Compared with the different treatments，the effects of MeJA 50 mg·L-1and AHO 200 mg·L-1treatments were better than other treatments on physiological indexes，and the disease resistance.ConclusionThe application of MeJA 50 mg·L-1and 200 mg·L-1AHO sprayingP.notoginseng，could make the plant height，stem diameter，the length and width of leaves，the root dry weight of per plant increased，and reduced the incidence and disease index，can be applied in production.

Panaxnotoginseng；inducers；growth indexs；induce resistance；defensive enzymes activities

2015-08-05)

云南省科技廳項目(2011CG024)

*

張金渝，研究員，研究方向：藥用植物資源與育種學(xué)；Tel：(0871)65033575，E-mail：jyzhang2008@126.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2016.8.019