貴州優(yōu)良地域種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞周期的影響*

劉　流，郭　侃，晏　容,2，劉　云，李曉飛,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；2.貴州省普通高等學(xué)校 特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義　563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

貴州優(yōu)良地域種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞周期的影響*

劉流1，郭侃1，晏容1,2，劉云2,3，李曉飛1,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 寄生蟲學(xué)教研室，貴州 遵義563099；2.貴州省普通高等學(xué)校 特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義563099)

目的 研究貴州羅甸縣城區(qū)及茂井鎮(zhèn)地區(qū)南方大斑蝥(MylabrisphalerataPallas)和黃黑小斑蝥(MylabriscichoriiLinnaeus)體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞周期的影響。方法 斑蝥三氯甲烷提取物的水浸液獲取結(jié)合斑蝥素; 應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化; 采用PI標記結(jié)合流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化。結(jié)果 羅甸縣城區(qū)及茂井鎮(zhèn)斑蝥的結(jié)合斑蝥素均能使細胞數(shù)量明顯減少, 出現(xiàn)固縮、體積變小等現(xiàn)象; 茂井鎮(zhèn)南方大斑蝥和黃黑小斑蝥可使S期細胞比率下降, G2/M期細胞比率明顯增加, 出現(xiàn)G2/M期阻滯; 羅甸城區(qū)南方大斑蝥和黃黑小斑蝥可使G0/G1期細胞比率明顯增加, S期細胞比率下降。結(jié)論 貴州羅甸縣城區(qū)南方大斑蝥、黃黑小斑蝥及茂井鎮(zhèn)地區(qū)南方大斑蝥、黃黑小斑蝥4種來源斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素可能是通過阻滯人肝癌HepG2細胞周期而抑制其生長。

結(jié)合斑蝥素; 南方大斑蝥; 黃黑小斑蝥; 肝癌HepG2細胞; 細胞周期

藥用昆蟲作為我國傳統(tǒng)藥物的天然來源, 以其藥性溫和、毒性作用小的特點, 受到臨床的廣泛關(guān)注。中藥斑蝥屬昆蟲綱鞘翅目芫菁科昆蟲, 是南方大斑蝥(大斑芫菁MylabrisphalerataPallas)或黃黑小斑蝥(眼斑芫菁,MylabriscichoriiLinnaeus)的干燥蟲體[1]。其體內(nèi)斑蝥素(cantharidin, CA)已被證實對肝癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等惡性腫瘤具有抑制作用[2-6], 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素是以游離斑蝥素和結(jié)合斑蝥素兩種形式存在, 其中結(jié)合斑蝥素的體外抗腫瘤活性高于游離斑蝥素[7], 并且存在地域差異性。例如貴州羅甸縣城區(qū)及茂井鎮(zhèn)境內(nèi)的南方大斑蝥和黃黑小斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于其它地區(qū)同種斑蝥[8], 但其機制不清。

研究表明, 細胞周期在腫瘤細胞的生長調(diào)控中具有重要作用, 通過改變細胞周期來阻止腫瘤細胞無限增殖已受到人們關(guān)注。如王浴生[9]研究發(fā)現(xiàn), 斑蝥素通過影響細胞周期的進程, 促進腫瘤細胞凋亡, 從而抑制腫瘤細胞增殖。在此基礎(chǔ)上, 本文擬對貴州優(yōu)良地域種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞周期的影響進行探討, 初步明確其體外抗癌效應(yīng), 為這一優(yōu)良地域種的開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料斑蝥蟲體收集自貴州省羅甸城區(qū)及茂井鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū), 經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院李曉飛博士鑒定蟲體為南方大斑蝥或黃黑小斑蝥。人肝癌細胞HepG2細胞由遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心提供。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Hyclone公司)、PI試劑盒(美國eBioscience公司), 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器超凈工作臺(蘇州凈化公司, 型號JJ-CJ-IFD); 3131型CO2培養(yǎng)箱(THERMO FORMA 3131); 超純水制備系統(tǒng)(美國Millpore公司, 型號MillI-Q);FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司, 型號TY 1218)。

1.3實驗方法

1.3.1結(jié)合斑蝥素提取純化[10]南方大斑蝥和黃黑小斑蝥蟲體烘干后用粉碎機粉碎, 干燥后置于容器中, 加足量三氯甲烷, 搖勻, 靜止24 h, 過濾, 殘渣用三氯甲烷沖洗3次, 干燥, 獲得去除游離斑蝥素的斑蝥粉末, 取重量為20倍的蒸餾水浸泡24 h, 過濾, 分別得南方大斑蝥結(jié)合斑蝥素(以下簡稱為BCMP)和黃黑小斑蝥結(jié)合斑蝥素(以下簡稱為BCML), 抽濾除菌, 備用。

1.3.2細胞培養(yǎng)人肝癌細胞HepG2采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清), 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。待細胞長至對數(shù)生長期, 棄培養(yǎng)液, PBS沖洗, 0.25%胰蛋白酶消化, 加培養(yǎng)液吹打均勻成單細胞懸液, 取100 μL細胞懸液(含8 000～10 000個細胞)接種96孔培養(yǎng)板, 于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將所選優(yōu)良地域種群的BCMP和BCML稀釋后分別作用于HepG2肝癌細胞, 并設(shè)空白對照組, 于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,置于倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況及形態(tài)變化。

1.3.3PI標記結(jié)合流式細胞術(shù)檢測HepG2細胞周期消化HepG2細胞, 將細胞接種于6孔板2塊, 加入培養(yǎng)基于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h, 棄培養(yǎng)液, PBS洗滌2次, 分別加入含BCMP和BCML的培養(yǎng)基2 mL, 使藥液終濃度分別為各自對HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)[11], 同時設(shè)空白對照組(加與實驗組等量的培養(yǎng)基), 每組設(shè)3個復(fù)孔, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, PBS洗滌1次, 10%緩沖液洗滌1次, 調(diào)整細胞濃度為1×106～5×106/ mL, 取100 μL細胞懸液放入含有100 μL10%緩沖液的EP管中, 加5 μL PI于細胞懸液中,2～8 ℃避光、混勻, 進流式檢測。

2　結(jié)果

2.1茂井鎮(zhèn)和羅甸城區(qū)兩種斑蝥結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞形態(tài)的影響與對照組比較茂井鎮(zhèn)和羅甸城區(qū)BCMP、BCML對HepG2細胞形態(tài)的影響(見圖1), 細胞數(shù)目明顯減少, 形態(tài)不規(guī)則, 并出現(xiàn)固縮、體積變小現(xiàn)象, 細胞貼壁差。

2.2茂井鎮(zhèn)和羅甸城區(qū)兩種斑蝥結(jié)合斑蝥素對HepG2細胞周期的影響茂井和羅甸的BCMP和BCML以各自的IC50處理HepG2細胞24 h后細胞周期的變化結(jié)果(見表1), 與空白對照組比較, 兩產(chǎn)區(qū)兩種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素均可對HepG2細胞的周期產(chǎn)生影響, 茂井BCMP和BCML可使S期細胞數(shù)百分比下降, G2/M期細胞數(shù)百分比明顯增加, 出現(xiàn)G2/M期阻滯; 羅甸BCMP和BCML可使G0/G1期細胞百分比明顯增加, S期細胞百分比下降,出現(xiàn)G0/G1期阻滯。

表1茂井和羅甸兩種斑蝥結(jié)合斑蝥素作用HepG2細胞24 h周期變化的統(tǒng)計分析(%)

組別G0/G1SG2/M空白對照組57.26±2.9735.19±3.187.54±0.60茂井BCMP67.05±3.4412.32±1.94*20.63±1.97*茂井BCML63.61±4.079.89±1.84*26.50±2.70*羅甸BCMP73.20±3.54*15.53±2.16*11.27±1.45羅甸BCML74.04±3.75*15.28±2.34*10.68±1.51

與空白對照組比較, *P<0.05。BCMP:南方大斑蝥結(jié)合斑蝥素; BCML: 黃黑小斑蝥結(jié)合斑蝥素。

A: 空白對照組; B: 茂井BCMP組; C: 茂井BCML組; D: 羅甸BCMP組; E: 羅甸BCML組?！　D1　茂井鎮(zhèn)和羅甸城區(qū)兩種斑蝥結(jié)合斑蝥素作用HepG2細胞48 h的形態(tài)變化

3　討論

細胞周而復(fù)始經(jīng)歷G1→S→G2→M的變化階段, 這種生長、分裂循環(huán)即稱為細胞周期。由于細胞周期在腫瘤細胞的增殖調(diào)控中起著重要作用, 因此有許多抗腫瘤藥物是通過阻滯腫瘤細胞周期以抑制細胞增殖和促進細胞凋亡而發(fā)揮抗癌作用的[12]。例如抗癌藥物斑蝥素通過影響細胞周期來發(fā)揮抑癌作用。

本研究通過水提法提取純化出羅甸城區(qū)及茂井鎮(zhèn)產(chǎn)區(qū)南方大斑蝥和黃黑小斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素, 前期實驗已證實其對人肝癌HepG2細胞有明顯抑制作用, 本文在此基礎(chǔ)上考察體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對人肝癌HepG2細胞周期的影響。結(jié)果表明, 茂井BCMP和BCML使細胞G2/M期細胞數(shù)百分比明顯增加, 出現(xiàn)了G2/M期阻滯; 羅甸BCMP和BCML致G0/G1期細胞百分比明顯增加,出現(xiàn)G0/G1期阻滯。提示這些地域種斑蝥體內(nèi)結(jié)合斑蝥素都能干預(yù)人肝癌HepG2細胞的周期變化, 減慢細胞的增殖速率, 這可能是其抑制腫瘤細胞生長的原因之一。后續(xù)分子機制的實驗正在進行之中, 我們將陸續(xù)報道。

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：2015年版一部[S]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社, 2015: 331.

[2] Kok S H, Chui C H, Lam W S, et al. Apoptotic activity of a novel synthetic cantharidin analog on hepatoma cell lines[J]. Int J Mol Med, 2006, 17(5): 945-949.

[3] Li W, Xie L, Chen Z, et al. Cantharidin, a potent and selective PP2A inhibitor, induces an oxidative stress-independent growth inhibition of pancreatic cancer cells through G2/M cell-cycle arrest and apoptosis[J]. Cancer Sci, 2010, 101(5): 1226-1233.

[4] Chen Y J,Kuo C D,Tsai Y M, et al. Norcantharidin induces anoikis through Jun-N-terminal kinase activation in CT26 colorectal cancer cells[J]. Anticancer Drugs, 2008, 19(1): 55-64.

[5] Huan S K, Lee H H, Liu D Z, et al. Cantharidin-induced cytotoxicity and cyclooxygenase 2 expression in human bladder carcinoma cell line[J]. Toxicology, 2006, 223(1): 136-143.

[6] Kok S H, Chui C H, Lam W S, et al. Apoptogenic activity of a synthetic cantharimide in leukaemia:implication on its structural activity relationship[J]. Int J Mol Med, 2006, 18(6): 1217-1221.

[7] 李曉飛, 婁方明, 晏容, 等. 芫菁體內(nèi)斑蝥素和結(jié)合斑蝥素抗腫瘤活性的比較研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥, 2013, 24(3): 535- 538.

[8] 郭侃, 李曉飛, 晏容, 等. 貴州及周邊地區(qū)斑蝥資源抗人肝癌HepG2細胞的活性研究[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2016, 32(5): 648-650.

[9] 王浴生. 中藥藥理與應(yīng)用[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 1983: 1113.

[10] 李曉飛, 曹嵩, 婁方明, 等. 芫菁體內(nèi)結(jié)合斑蝥素對胃癌SGC-7901細胞增殖的抑制作用[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2013, 25(7): 963-966.

[11] 晏容, 劉云, 朱欣婷, 等.不同斑蝥素類物質(zhì)對人肝癌細胞HepG2增殖作用的研究[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生, 2015, 31(21): 3209-3211

[12] Fan Y Z, Fu J Y, Zhao Z M, et al. Effect of norcantharidin on proliferation and invasion of human gallbladder carcinoma GBC-SD cells[J]. World J Gastroenterol, 2005, 11(16): 2431-2437.

[收稿2016-06-27;修回2016-07-25]

(編輯：王靜)

The effect on cell cycle of human hepatoma HepG2 cells by bound cantharidin from excellentMylabrislocal breed in Guizhou Province

LiuLiu1，GuoKan1，YanRong1,2，LiuYun2,3，LiXiaofei1,2

(1.Department of Parasitology,Basic Medicine School, Zunyi Medical University;2.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines; 3.Medical and Biological Research Center, Zunyi Medical University, Zunyi 563003, China)

Objective To investigate the influence on cell cycle of human hepatoma HepG2 cells by bound cantharidin collected fromMylabrisphalerataPallas,Mylabriscichorii, respectively, in Luodian District, Guizhou Province.Methods Bound cantharidin was extracted fromMylabriswater soluble matter by trichloromethane. The cell cycle change was detected by flow cytometry (FCM) with PI markers.Results The ratio of S-phase cells showed a significantly decrease, while the ratio of G2/M phase cells showed an increase, which appeared G2/M phase arrest, after the 24 hrs treatment of BCMP and BCML in Maojing Town respectively. By contrastedly, the ratio of G2/M phase cells showed a significantly increase and a narrow increase of G0/G1phase cells, which appeared G0/G1phase arrest and decrease ratio of S-phase cells, in the treatment of BCMP and BCML in Luodian Town respectively.Conclusion The effects on growth of HepG2 cells by bound cantharidin extracted from cantharis mainly attributed to the retardant of the cell cycle.

conjugated cantharidin;MylabrisphalerataPallas;MylabriscichoriiLinnaeus;human hepatoma HepG2 cells; cell cycle

國家自然科學(xué)基金資助項目(NO：81260488)；貴州省科技廳中藥現(xiàn)代化項目(NO：黔科合ZY字[2013]3012)；貴州省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目(NO：黔科合SY字[2012]3082)；貴州省教育廳特色重點實驗室建設(shè)項目(NO：黔科合KY字[2014]212)。

李曉飛，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥用昆蟲及昆蟲毒素，E-mail:lixiaofei35@mail.com。

R931

A

1000-2715(2016)04-0372-03