微波輔助提取金釵石斛多糖的響應(yīng)面優(yōu)化*

荊　晶，王曉紅，張倩茹，張婉婷，王　剛

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義　563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義　563099)

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技術(shù)與方法

微波輔助提取金釵石斛多糖的響應(yīng)面優(yōu)化*

荊晶1，王曉紅1，張倩茹1，張婉婷2，王剛1

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563099; 2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 藥劑科，貴州 遵義563099)

目的 使用響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取金釵石斛多糖的工藝。方法 金釵石斛多糖提取率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法優(yōu)化金釵石斛多糖微波輔助提取工藝，采用Box-Behnken進(jìn)行制備工藝設(shè)計(jì)，綜合分析料液比、提取時間、提取溫度因素之間的交互作用對提取率的影響。結(jié)果 金釵石斛多糖提取的最優(yōu)條件是：料液比(A)為1∶28.2，提取時間(B)為10.68 min，提取溫度(C)為67.30 ℃，提取率預(yù)測值為18.91%。實(shí)際平均提取率為19.75%，相對誤差小于1%，水提醇沉法多糖提取率(12.38%)之間具有極其顯著性差異。結(jié)論 微波輔助法能提高金釵石斛多糖提取率，采用響應(yīng)面法對該方法進(jìn)行工藝優(yōu)化，所得工藝條件穩(wěn)定可靠，方便可行。

金釵石斛；多糖；微波；提取率；響應(yīng)面分析

金釵石斛(DendrobiumnobileLindl.)為蘭科石斛屬多種植物的莖[1]。它具有很多藥用價值，可“強(qiáng)陰益精，厚腸胃，壯筋骨，暖水臟，補(bǔ)腎益力，輕身延年”[2-3]。金釵石斛是我國珍貴的藥材，貴州赤水的金釵石斛是中國國家保護(hù)二類珍稀瀕危植物[4-5]。金釵石斛的化學(xué)成分類型主要有多糖、生物堿、酚、菲類等[6-7]，其中多糖和生物堿是最為重要的活性成分，具有增強(qiáng)免疫、抗菌、抗腫瘤等多種功效[8]。

關(guān)于金釵石斛多糖的提取方法，大多采用傳統(tǒng)的水提醇沉回流提取法[9]，微波提取是最近幾年發(fā)展起來的一種方法，與傳統(tǒng)方法比較它有許多優(yōu)點(diǎn)，如耗時少、操作方便且簡單、節(jié)約溶劑、含量高、選擇性好等[10]。劉文等[11]用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究微波輔助提取金釵石斛工藝，所采用的藥材品種和所選擇的工藝條件與本文不同，正交試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)可以考察各因素對因變量的影響，但無法考察各因素之間交互作用的綜合影響。本文采用單因素實(shí)驗(yàn)，確定選取響應(yīng)面法設(shè)計(jì)的因素及水平，該設(shè)計(jì)優(yōu)化金釵石斛多糖的微波提取工藝，可以更全面考慮各因素之間的交互影響，為金釵石斛藥材的合理開發(fā)利用及工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試劑與儀器金釵石斛(產(chǎn)地：貴州赤水)，無水葡萄糖(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，硫酸(分析純，成都市科龍化工試劑廠)，苯酚(分析純，廣東省汕頭市西隴化工廠)，食用酒精，無水乙醇(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

彈簧度盤秤(ATZ-10，南寧市仁和彈簧度盤秤廠)，電子天平(BS110S，北京賽多利斯天平有限公司)，電熱恒溫水浴鍋(DK-2000-L，天津泰斯特儀器有限公司)，電子調(diào)溫電熱套(98-1-B型，天津泰斯特儀器有限公司)，小型粉碎機(jī)(XFB-200，長沙市中誠制藥機(jī)械有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000，上海光學(xué)儀器廠)，恒溫干燥箱(101-4型，重慶市松朗電子儀器有限公司)，紫外分光光度計(jì)(T6新世紀(jì)，北京普析通用儀器有限公司)，微波萃取儀(XH-100B，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1金釵石斛多糖提取工藝流程藥材預(yù)處理：新鮮金釵石斛洗凈切碎，烘干至恒重，粉碎過篩，得到金釵石斛藥材粉末。提取工藝流程：稱取2 g藥材粉末，按照一定料液比加入純化水，在微波提取后濾過，再二次提取，合并，濃縮濾液，80%乙醇進(jìn)行醇沉處理，濾過，恒溫干燥后即可得到金釵石斛多糖粗提取物。

1.2.2多糖含量的測定

1.2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密稱取葡萄糖0.1 g加水使溶解，定容于100 mL容量瓶中，可得葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶中，加苯酚1 mL搖勻，加濃硫酸5 mL，定容至刻度線，放置5 min，沸水浴20 min。以2 mL蒸餾水同法做空白對照，在494 nm處測吸光度[12]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程y=13.505x+0.050 2(R2=0.999 2)，表明多糖在0.102～1.224 mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

1.2.2.2樣品多糖含量測定精密吸取金釵石斛多糖提取液1 mL，加5%苯酚1.0、5.0 mL濃硫酸，放冷至室溫，以2 mL蒸餾水作空白對照，于494 nm處測定其吸光度值，回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線，濾液多糖濃度，換算出多糖質(zhì)量，得到多糖含量[13]。

1.2.3單因素試驗(yàn)單因素試驗(yàn)以金釵石斛多糖含量作為響應(yīng)值，分別考察微波提取時間、料液比(M/V)、提取溫度、微波提取功率、微波前冷浸時間等對響應(yīng)值的影響。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析，擬合各因素和響應(yīng)值(金釵石斛多糖提取率)之間的函數(shù)關(guān)系，比較各因素對含量的影響。選取料液比、微波提取時間及微波提取溫度進(jìn)行3因素3水平Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)化微波輔助提取金釵石斛多糖的工藝條件。因素水平設(shè)計(jì)(見表1)。

表1響應(yīng)面分析因素與水平

水平因素料液比(A,kg/L)提取時間(B,min)提取溫度(C,℃)-11∶2085001∶30106011∶401270

2　結(jié)果

2.1單因素試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，單因素實(shí)驗(yàn)得到最佳微波提取時間為10 min，最佳料液比為1∶30，最佳提取溫度為60 ℃，最佳微波提取功率為500 w。從選取的4個因素來看，微波提取時間、料液比和提取溫度對金釵石斛多糖提取率影響較大，而微波提取功率對多糖提取率的影響比較不顯著。

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)如表2所示，一共選擇不同條件下的17個實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)，其中12個點(diǎn)為析因點(diǎn)，5個為零點(diǎn)，析因點(diǎn)為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維定點(diǎn)；零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，其中零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，估算試驗(yàn)誤差。綜合分析表中數(shù)據(jù)結(jié)果得金釵石斛多糖提取率回歸方程為Y= +18.54-0.082×A+0.83 ×B+0.76 ×C-0.25×A×B-1.37 ×A×C+0.21 ×B×C-3.79 ×A2-1.69 ×B2-0.77 ×C2。

圖1　單因素試驗(yàn)結(jié)果

表2響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

試驗(yàn)號A(kg/L)B(min)C(℃)提取率(%)1-10-112.302-11015.70310114.32400016.88510-118.63600018.82700017.09811013.85900018.901000018.7711-1-1011.761201-113.981301116.52140-1-111.24151-1017.58160-1113.6217-10115.21

表3響應(yīng)面回歸模型方差分析

方差來源平方和自由度均方和FP顯著性模型98.543910.94911.5720.0020P<0.05A0.05410.0540.0580.8173P>0.05B5.44515.4455.7550.0475P<0.05C4.62114.6214.8840.0628P>0.05AB0.25510.2550.2700.6196P>0.05AC7.53517.5357.9630.0257P<0.05BC0.18110.1800.1910.6753P>0.05A260.441160.44163.8800.0001P<0.001B212.079112.07912.7670.0091P<0.05C22.48812.4882.6300.1490P>0.05殘差6.62370.946失擬項(xiàng)5.43331.8116.0840.0568P>0.05純誤差1.19140.298總和105.16616

2.2.1響應(yīng)面圖與等高線分析根據(jù)回歸方程得到所優(yōu)化的3個工藝因素：料液比(A)、提取時間(B)及提取溫度(C)之間，A與C交互作用關(guān)系最為顯著，其次為A與B，B與C之間交互作用不顯著。

由圖2可知，提取時間與料液比之間的交互作用不顯著，在一定料液比條件下，多糖提取率隨著微波提取時間的增加，出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，最初升高比較快，然后隨著時間繼續(xù)增加略有下降趨勢。說明提取時間過長，溶液溫度過高，會導(dǎo)致已提取多糖發(fā)生降解，降低其提取產(chǎn)率。

圖2　Y= f (A,B)料液比和提取時間對提取率影響的響應(yīng)面及等高線

由圖3可知，料液比和提取溫度之間的交互作用非常顯著，溫度較低的條件下，隨著料液比的增大，提取率快速提高后緩慢下降；在較高溫度條件下，隨著料液比的增加，提取率緩慢增加后快速下降。

圖3　Y= f (A,C)料液比和提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面及等高線

由圖4可知，提取時間與提取溫度之間的交互作用不顯著，在一定的提取時間條件下，隨著提取溫度的增加，提取率穩(wěn)定在16%～18%，在提取時間為10 min時，提取溫度對金釵石斛多糖提取率幾乎沒有影響。

圖4　Y= f (B,C)提取時間和提取溫度對提取率影響的響應(yīng)面及等高線

2.2.2金釵石斛多糖微波輔助提取最佳工藝條件的確定通過Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到金釵石斛多糖微波輔助提取最佳工藝條件為：料液比為1∶28.2，提取時間為10.68 min，提取溫度為67.30 ℃，預(yù)計(jì)提取率為18.91%。為了方便實(shí)際操作，將實(shí)驗(yàn)條件簡化為料液比1∶30，提取時間11 min，提取溫度65 ℃，取3批樣品，進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)際平均提取率為19.75%，與預(yù)測值之間相對偏差低于1%，因此基于響應(yīng)面法所得到的微波輔助提取工藝參數(shù)可靠，得到的金釵石斛多糖提取條件具有實(shí)際應(yīng)用價值(見表4)。

提取方法提取率(%)樣品1樣品2樣品3平均提取率(%)P微波輔助法19.75±0.1219.87±0.2319.63±0.1519.750.0009水提醇沉法11.88±0.2712.40±0.7812.85±0.6612.38<0.0010

微波輔助法、水提醇沉法各樣品組之間比較P>0.05；兩種實(shí)驗(yàn)方法平均提取率之間比較P<0.001。

2.3水提醇沉法對比實(shí)驗(yàn)對同批次金釵石斛樣品，采用傳統(tǒng)的水提醇沉取法[14]進(jìn)行了提取實(shí)驗(yàn)，平行提取3次，得到平均提取率為12.38%，兩種實(shí)驗(yàn)方法所得提取率之間差異在0.001水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，微波輔助法提取率明顯高于傳統(tǒng)水提醇沉法(見表4)。

3　討論

金釵石斛中的多糖一般都采用傳統(tǒng)的水提醇沉法，但其存在溶劑量消耗大，操作復(fù)雜，提取率低等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選用了微波輔助提取金釵石斛中的多糖，以提取率為響應(yīng)值，在單因素條件下考察了微波溫度、微波功率、微波時間和浸提時間對多糖得率的影響[15]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化了金釵石斛多糖提取工藝，選出了最佳提取工藝條件。同一批次樣品通過傳統(tǒng)水提醇沉法對金釵石斛多糖的提取率為12.38%[14]，采用響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)微波輔助提取，平均提取率為19.75%。采用該方法預(yù)測結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相差較小，且可以綜合考慮各因素之間的組合影響，比其他工藝優(yōu)化方法更為精準(zhǔn)高效[16]。因此，本文所得到的微波輔助提取金釵石斛多糖工藝條件，可為石斛多糖的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)及金釵石斛藥材的綜合利用開發(fā)提供理論依據(jù)。

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[收稿2016-05-13;修回2015-06-28]

(編輯：王靜)

Response surface optimization of microwave-assisted extraction of polysaccharides fromDendrobiumnobileLindl.

JingJing1,WangXiaohong1,ZhangQianru1,ZhangWanting2,WangGang1

(1.Pharmacy School of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective Response surface methodology was utilized to optimize the extraction process of polysaccharide fromDendrobiumnobileLindl (DLP) which could be used for the development ofDendrobiumnobileLindl.Methods The extraction rate of DLP is used to be response value. On the basis of single factors experiment, using response surface method to optimiza the extraction of DLP by microwave-assisted extraction and analysing the interaction of various factors effect on the extraction rate.Results The optimal condition for extraction of DLP is solid-liquid ratio (A) is 1∶28.2, extraction time (B) is 10.68 min, and the extraction temperature(C) is 67.30 ℃. The predicted extraction rate is 18.91% and the actual value is 19.75%. The relative error is less than 1%. And the traditional extracted method reached a significant difference in DLP extraction rate at 12.38%.Conclusion Microwave-assisted methodis superior to the traditional water extraction and alcohol precipitation method in DLP extraction rate, which is stable, reliable, convenient and feasible.

DendrobiumnobileLindl.; polysaccharide; microwave; extraction rate; response surface analysis

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81560569)。

王剛，男，博士，副教授，研究方向：中藥活性成分與食品科學(xué)，E-mail:wg8855350@163.com。

R283.6

A

1000-2715(2016)04-0418-05