Legumain在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義

王健君， 李曉敏， 何 雷， 周芳芳， 許增祥， 鐘樹志

(1皖南醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，蕪湖 241002； 2皖南醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；3皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科； *通訊作者，E-mail：lxm1980326@sina.com)

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Legumain在大腸癌中的表達(dá)及臨床意義

王健君， 李曉敏， 何 雷， 周芳芳， 許增祥， 鐘樹志

(1皖南醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，蕪湖 241002；2皖南醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室；3皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院病理科；*通訊作者，E-mail：lxm1980326@sina.com)

目的 探討人大腸癌組織中天冬酰胺內(nèi)肽酶(Legumain)的表達(dá)及其與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 方法 制備包含69例大腸腺癌手術(shù)切除標(biāo)本及癌旁組織的組織芯片，采用免疫組織化學(xué)方法檢測Legumain的表達(dá)，分析Legumain表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性；并應(yīng)用RT-qPCR檢測16對大腸癌及癌旁正常組織Legumain mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 Legumain在人大腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Legumain高表達(dá)與腫瘤的漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期相關(guān)(P<0.05)。 結(jié)論 Legumain人大腸癌組織中高表達(dá)，可能促進(jìn)了大腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。

大腸癌； Legumain； 轉(zhuǎn)移； 免疫組織化學(xué)

Legumain即天冬酰胺內(nèi)肽酶，是溶酶體半胱氨酸蛋白酶C13家族的成員，最初在豆類植物種子中被發(fā)現(xiàn)并被命名為液泡加工酶[1]。在人體內(nèi)，Legumain定位于14號染色體上，編碼長度為433個(gè)氨基酸的蛋白，與動(dòng)脈粥樣硬化、腦退行性變、肝臟纖維化、抗原加工處理等病理生理過程密切相關(guān)。Liu等[2]最先發(fā)現(xiàn)Legumain在人多種惡性腫瘤組織中高表達(dá)，隨后研究發(fā)現(xiàn)Legumain在人乳腺癌、橫紋肌肉瘤、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤等惡性腫瘤中也高表達(dá)，且與患者的不良預(yù)后相關(guān)[3-7]。大腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，近年來由于生活方式和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率和死亡率逐年上升，大腸癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因[8]。然而Legumain在大腸癌中的研究少見報(bào)道，因此本研究通過在蛋白和基因水平檢測人大腸癌中Legumain的表達(dá)情況，分析Legumain表達(dá)與大腸癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，初步探討Legumain是否參與了大腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程，進(jìn)一步為大腸癌的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 制備大腸癌及癌旁正常組織的組織芯片

收集皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院大腸癌手術(shù)切除標(biāo)本共69例，所有病例均為2015-01～2016-01期間由普通外科收治的大腸癌患者，患者術(shù)前均未接受放、化療，術(shù)后病理均證實(shí)為腺癌，且無其他腫瘤性疾病。每例標(biāo)本留取腫瘤組織及距腫瘤邊緣大于5 cm處癌旁組織各1塊，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制成供體蠟塊，經(jīng)HE染色觀察確定典型部位。使用北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司組織芯片儀在45 mm×30 mm受體蠟塊上構(gòu)建48個(gè)空點(diǎn)陣(8×6個(gè)點(diǎn)，直徑為1.2 mm)，起始1個(gè)點(diǎn)空缺作為陣列位置標(biāo)志，共制成3塊受體蠟塊。然后用點(diǎn)樣針在供體蠟塊上取標(biāo)本，HE切片比對下在癌及癌旁的典型區(qū)域各取1塊，同一標(biāo)本癌及癌旁組織植入相鄰的孔內(nèi)，以保證癌和癌旁組織的反應(yīng)條件一致，共制備3塊8×6陣列的組織芯片。在烤箱中 60 ℃溶蠟后切片進(jìn)行HE染色及免疫組織化學(xué)染色。

1.2 組織芯片免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用SP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色檢測Legumain的表達(dá)，DAB顯色，用已知陽性大腸癌組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。濃縮型兔抗人Legumain多克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SP試劑盒、PBS緩沖液、枸櫞酸鹽緩沖液和DAB顯色液等均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評價(jià)

組織芯片免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2位高年資病理醫(yī)師獨(dú)立觀察評價(jià)，分別從染色強(qiáng)度和染色比例兩方面進(jìn)行綜合評價(jià)。染色強(qiáng)度分為陰性、弱染色(淡棕黃色)、中染色(棕黃色)、強(qiáng)染色(棕褐色)；染色比例分為<25%和≥25%。染色強(qiáng)度為陰性或弱染色，且染色比例<25%判定為低表達(dá)，其余為高表達(dá)。

1.4 組織總RNA提取及RT-qPCR

使用RNAisoTMPlus(Takara公司)提取大腸癌及癌旁組織總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用BestarTMRealtime PCR Master Mix(SYBR Green法)(DBI公司)進(jìn)行熒光定量PCR(RT-qPCR)，以GAPDH作為內(nèi)參，所用引物：Legumain上游引物5′-GCAGGTTCAAATGGCTGGTAT-3′，Legumain下游引物5′-GGAGTGGGA TTGTCTTCAGAGT-3′，GAPDH上游引物5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-3′，下游引物5′-CCATGGGTGGAATCATATTGGAA-3′，引物由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成。應(yīng)用ABI公司的7500定量PCR儀進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)，程序如下，預(yù)變性95 ℃ 2 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 34 s，延伸72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)算每個(gè)樣本的平均ΔCt，ΔCt=(CtLegumain-CtGAPDH)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件(IBM)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。qPCR數(shù)據(jù)以ΔCt±SD表示，組間差異用雙側(cè)T檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。Legumain在大腸癌及癌旁正常組織中的免疫組織化學(xué)染色差異表達(dá)用χ2檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)。Legumain的表達(dá)與各個(gè)臨床病理參數(shù)間的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Legumain在大腸癌和癌旁正常黏膜中的表達(dá)

Legumain陽性染色位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈彌漫性淡黃色至棕褐色顆粒狀。高表達(dá)Legumain的大腸癌表現(xiàn)為癌細(xì)胞胞質(zhì)呈棕褐色顆粒狀，大部分病例的癌旁正常黏膜Legumain為陰性或弱陽性，僅少數(shù)病例癌旁正常黏膜呈強(qiáng)陽性，主要位于腸黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，且強(qiáng)陽性范圍局限(見圖1)。組織芯片上69例大腸癌組織中48例(69.6%)高表達(dá)Legumain，21 例(30.4%)低表達(dá)；69例相應(yīng)癌旁正常黏膜中13例(18.8%)高表達(dá)Legumain，56例(81.2%)低表達(dá)，大腸癌與相應(yīng)癌旁正常黏膜Legumain表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

A.組織芯片(HE染色)；B.大腸癌組織Legumain表達(dá)(IHC×200)；C.大腸癌組織Legumain表達(dá)(IHC×400)；D.癌旁正常腸黏膜Legumain表達(dá)(IHC×200)；E.癌旁正常腸黏膜Legumain表達(dá)(IHC×400)圖1 大腸癌及癌旁組織芯片HE染色及Legumain免疫組織化學(xué)染色Figure 1 Legumain expression in tissue microarray(TMA) containing colorectal cancer and paired normal colorectal tissue by HE and immunohistochemical staining

表1 大腸癌及癌旁正常組織Legumain的表達(dá)差異例(%)

Table 1 The difference of Legumain expression in colorectal cancer and paired normal colorectal mucosa cases(%)

組織芯片nLegumain低表達(dá)高表達(dá)χ2P大腸癌6921(30.4)48(69.6)35.99<0.001癌旁正常黏膜6956(81.2)13(18.8)

2.2 大腸癌和癌旁正常組織Legumain mRNA的表達(dá)

應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測16對大腸癌及癌旁正常組織Legumain mRNA的表達(dá)，經(jīng)過內(nèi)參對樣本Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后，獲得每一樣本的相對ΔCt值，通過統(tǒng)計(jì)分析表明Legumain mRNA在大腸癌中的表達(dá)明顯高于癌旁正常黏膜(P<0.000 1,見圖2)。

圖2 大腸癌及癌旁正常組織Legumain mRNA的表達(dá)(RT-qPCR)Figure 2 Legumain expression at the mRNA level in colorectal cancer and paired normal colorectal mucosa by RT-qPCR

2.3 Legumain表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

大腸癌中Legumain的表達(dá)在腫瘤是否侵犯漿膜、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移及不同的TNM分期之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在不同患者性別、年齡、腫瘤大小及分化程度之間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

3 討論

大腸癌日益增高的發(fā)病率和死亡率逐漸引起人們重視，其死亡原因主要為大腸癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位突破基底膜進(jìn)入間質(zhì)并侵入血管是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，腫瘤細(xì)胞可以通過分泌組織蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶來降解腫瘤基質(zhì)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，Legumain作為半胱氨酸蛋白酶C13家族的新成員，是否參與了大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，文獻(xiàn)少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過自制大腸癌及癌旁正常黏膜的組織芯片，通過免疫組織化學(xué)的方法檢測大腸癌及癌旁組織Legumain的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)相比正常組織，Legumain在大腸癌高表達(dá)(P<0.05)，這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[9]。

表2 大腸癌Legumain表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的相關(guān)性分析(例)

Table 2 Association between Legumain expression and clinicopathological parameters in colorectal cancers (cases)

變量nLegumain低表達(dá)高表達(dá)χ2P性別0.1460.702 男性411231 女性28919年齡0.0450.831 <65歲25817 ≥65歲441331腫瘤大小2.3980.121 <4cm331320 ≥4cm36828分化程度1.5340.483 高分化1046 中分化471532 低分化12210漿膜侵犯8.8680.003 有47938 無221210淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移4.4850.034 有33627 無361521TNM分期5.1770.023 Ⅰ-Ⅱ351520 Ⅲ-Ⅳ34628

組織芯片具有高通量、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)，但由于組織芯片上的標(biāo)本面積較小，具有片面性的缺點(diǎn)，因此在免疫組化評分判定中不適合根據(jù)陽性強(qiáng)度和范圍評分，我們前期用供體蠟塊進(jìn)行的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)大腸癌Leguamin表達(dá)普遍高于25%，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[10]，將小于25%且染色呈淡黃色彌漫陽性的定為低表達(dá)，其余為高表達(dá)，這種免疫組化結(jié)果判定與受體蠟塊免疫組化結(jié)果相一致。組織芯片上69例大腸癌標(biāo)本中共有48例高表達(dá)Legumain，高表達(dá)Legumain的腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色至棕褐色粗顆粒，有研究分別在乳腺癌[3]和前列腺癌[6]中通過免疫組化方法發(fā)現(xiàn)Legumain在胞質(zhì)內(nèi)陽性表達(dá)方式有兩種：彌漫性陽性著色(diffuse cytoplasmic staining)和囊泡狀陽性著色(vesicular staining pattern)，且囊泡狀陽性與患者的不良預(yù)后相關(guān)，此外，Haugen等[11]在結(jié)腸癌Legumain免疫組織化學(xué)染色切片上觀察到約30%的標(biāo)本腫瘤細(xì)胞核Legumain陽性，且核陽性與患者的不良預(yù)后相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)并未觀察到腫瘤細(xì)胞核呈陽性。組織芯片上69例癌旁正常組織均取自遠(yuǎn)離癌組織的遠(yuǎn)端切緣，術(shù)后證實(shí)未有癌累及，69例正常黏膜僅13例表現(xiàn)為陽性，但陽性部位較局限，強(qiáng)陽性僅表達(dá)于表面黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)。為進(jìn)一步明確大腸癌Legumain的表達(dá)上調(diào)是否存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，本實(shí)驗(yàn)通過RT-qPCR方法檢測16對大腸癌與癌旁正常黏膜Legumain mRNA的相對表達(dá)差異，結(jié)果表明大腸癌mRNA明顯高于癌旁組織(P<0.000 1)。

為進(jìn)一步探討Legumain在大腸癌中表達(dá)上調(diào)的臨床意義，本實(shí)驗(yàn)分析了大腸癌Legumain表達(dá)與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果表明大腸癌Legumain表達(dá)與漿膜是否侵犯、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移以及不同TNM分期的腫瘤之間具有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示Legumain可能促進(jìn)了大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌[12]和胃癌[5]的免疫組化研究中也同樣發(fā)現(xiàn)Legumain表達(dá)在伴有或不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的大腸癌之間表達(dá)具有差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Legumain在腫瘤組織內(nèi)高表達(dá)與腫瘤組織的缺氧、局部pH降低有關(guān)，另外Yamane等[13]報(bào)道p53可以與Legumain基因結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)Legumain的表達(dá)。在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)p53與Legumain的表達(dá)呈正相關(guān)[12]。但Legumain促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的機(jī)制目前仍不清楚，文獻(xiàn)報(bào)道較少，目前認(rèn)為有如下幾種機(jī)制：①Legumain可通過水解活化組織蛋白酶和基質(zhì)金屬蛋白酶，降解腫瘤基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。在對胃癌等的研究中也發(fā)現(xiàn)Legumain的表達(dá)與MMP-2、MMP-9的表達(dá)及活性呈正相關(guān)[10,14]，但Legumain能否直接調(diào)控MMP-2的表達(dá)及活化仍需進(jìn)一步研究。②通過與整合素結(jié)合促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，有研究在遷移中的大腸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞前端發(fā)現(xiàn)Legumain與整合素有重疊[2,12]，Legumain可能通過整合素途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移及轉(zhuǎn)移。③促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，Andrade等[15]在肝癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Legumain可以通過影響細(xì)胞周期，減少處于G2/M期細(xì)胞的比例，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，本研究證明大腸癌組織中Legumain表達(dá)在蛋白和基因水平上均明顯上調(diào)，其上調(diào)表達(dá)與大腸癌的漿膜浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)，Legumain參與了大腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，可能為大腸癌的治療提供新的思路。

[1] Kembhavi AA,Buttle DJ,Knight CG,etal.The two cysteine endopeptidases of legume seeds:purification and characterization by use of specific fluorometric assays[J].Arch Biochem Biophys,1993,303(2):208-213.

[2] Liu C,Sun CZ,Huang HN,etal.Over-expression of Legumain in tumors is significant for invasion metastasis and a candidate enzymatic target for prodrug therapy[J].Cancer Res,2003,63(11):2957-2964.

[3] Gawenda J,Traub F,Luck HJ,etal.Legumain expression as a prognostic factor in breast cancer patients[J].Breast Cancer Res Treat,2007,102(1):1-6.

[4] 李元偉.Legumain在人眼眶橫紋肌肉瘤中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲性的關(guān)系[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2010.

[5] Li N,Liu QL,Su Q,etal.Effects of legumain as a potential prognostic factor on gastric cancers[J].Med Oncol,2013,30(3):621.

[6] Ohno Y,Nakashima J,Izumi M,etal.Association of legumain expression pattern with prostate cancer invasiveness and aggressiveness[J].World J Urol,2013,31(2):359-364.

[7] 吳桐.Legumain在葡萄膜黑色素瘤中的表達(dá)及其對患者預(yù)后影響的研究[D].天津:天津醫(yī)科大學(xué),2010.

[8] Terzic J,Grivennikov S,Karin E,etal.Inflammation and colon cancer[J].Gastroenterology,2010,138(6):2101-2114.

[9] Murthy RV,Arbman G,Gao J,etal.Legumain expression in relation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer[J].Clin Cancer Res,2005,11(6):2293-2299.

[10] 馮倩,劉杞,向榮,等.Legumain在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,36(3):232-235.

[11] Haugen MH,Boye K,Nesland JM,etal.High expression of the cysteine proteinase legumain in colorectal cancer-implications for therapeutic targeting[J].Eur J Cancer,2015,51(1):9-17.

[12] Wu M,Shao GR,Zhang FX,etal.Legumain protein as a potential predictive biomarker for Asian patients with breast carcinoma[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014,15(24):10773-10777.

[13] Yamane T,Murao S,Katoose I,etal.Transcriptional regulation of the legumain gene by p53 in HCT116 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,438(4):613-618.

[14] 湯新躍.幽門螺桿菌感染性胃癌組織中Legumain、MMP-9的表達(dá)及其臨床意義[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015,24(12):1270-1275.

[15] Andrade V,Guerra M,Jardim C,etal.Nucleoplasmic calcium regulates cell proliferation through legumain[J].J Hepatol,2011,55(3):626-635.

Expression and clinical significance of Legumain in colorectal cancer

WANG Jianjun1，LI Xiaomin2*，HE Lei3，ZHOU Fangfang2，XU Zengxiang2， ZHONG Shuzhi1

(1DepartmentofHistologyandEmbryology，WannanMedicalCollege，Wuhu241002，China；2DepartmentofPathology，WannanMedicalCollege;3DepartmentofPathology，YijishanHospitalofWannanMedicalCollege；*Correspondingauthor，E-mail：lxm1980326@sina.com)

ObjectiveTo investigate Legumain expression and its relationship with clinicopathological parameters in colorectal cancer.MethodsExpression of Legumain was examined in tissue microarray(TMA) containing 69 samples of colorectal cancer and paired normal colorectal tissue using immunohistochemistry. The correlation between Legumain expression in colorectal tumor and clinicopathological parameters were analyzed. Additionally, the expression levels of Legumain mRNA were detected in 16 paired colorectal cancer tissues and adjacent normal counterparts by RT-qPCR.ResultsLegumain expression was significantly higher in colorectal cancer than in paired normal colorectal mucosa(P<0.05). Increased Legumain levels were significantly correlated with serosal invasion, lymph nodes metastasis and clinical stage(P<0.05).ConclusionLegumain is highly expressed in colorectal cancer, which may promote the invasion and metastasis of colorectal cancer.

colorectal cancer； Legumain； metastasis； immunohistochemistry

皖南醫(yī)學(xué)院中青年自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(WK200830,WK201412)

王健君，男，1981-03生，碩士，講師，E-mail：39001683@qq.com

2016-06-21

R735.34

A

1007-6611(2016)09-0837-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.013