microRNA-616在肝細胞性肝癌中表達及對上皮-間質轉化的影響

張 立， 張 迪， 李孝彬， 王 煒， 孫學軍， 李 杰， 李軍輝

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院普外科，西安 710004；2西安交通大學第一附屬醫(yī)院普外科；*通訊作者，E-mail:ljh991049@126.com)

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microRNA-616在肝細胞性肝癌中表達及對上皮-間質轉化的影響

張 立， 張 迪， 李孝彬， 王 煒， 孫學軍， 李 杰， 李軍輝

(1西安交通大學第二附屬醫(yī)院普外科，西安 710004；2西安交通大學第一附屬醫(yī)院普外科；*通訊作者，E-mail:ljh991049@126.com)

目的 研究microRNA-616(miR-616)在肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織中的表達，探討其與HCC上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的關系及臨床意義。 方法 用實時定量PCR檢測40例HCC組織及癌旁組織及人正常肝細胞株LO2和6種HCC細胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC97L、HCCLM3和MHCC97H中miR-616表達。經細胞轉染分別在Hep3B細胞中過表達miR-616及在MHCC97H細胞沉默miR-616，通過Western blot、熒光素酶報告檢測方法了解相應HCC細胞中miR-616、E-cadherin及vimentin的表達情況。 結果 與對應的癌旁組織相比，miR-616在腫瘤組織中的表達水平顯著升高(0.031±0.043vs0.12±0.078,P<0.01)。所有6種HCC細胞株的miR-616表達水平均顯著高于人正常肝細胞株LO2(P<0.01)。在Hep3B細胞中過表達miR-616，可降低E-cadherin表達水平(P<0.01)，增加vimentin的表達(P<0.01)。在MHCC97H細胞中抑制miR-616的表達，可增加E-cadherin的表達水平(P<0.01)，降低vimentin表達(P<0.01)。 結論 miR-616可作為HCC一種有價值的臨床生物標志物，靶向干預miR-616，可影響HCC的EMT。

microRNA-616； 肝細胞性肝癌； 上皮-間質轉化； 腫瘤轉移

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的全球發(fā)病率位居惡性腫瘤的第5位，在我國居第2位[1]。雖然在HCC研究方面取得了顯著的成就[2]，但HCC患者的長期預后仍然較差，局部和全身轉移是晚期HCC患者生存期不理想的重要原因[3]。闡明HCC轉移的分子機制，對于確定新的治療靶點有重要的作用。

在人類惡性腫瘤中，microRNA的異常表達和功能扮演著重要角色[4-6]。此外，microRNA現(xiàn)已成為有前途的診斷和預后標志物以及人類癌癥的有吸引力的治療靶點[7,8]。microRNA-616(miR-616)被發(fā)現(xiàn)是一種新的腫瘤相關microRNA，并且研究中發(fā)現(xiàn)miR-616在胃癌[9]、肺癌[10]和前列腺癌[11]患者血清中明顯升高，然而，miR-616在HCC中的表達情況以及在HCC細胞中的潛在作用機制，目前仍需進一步研究。

上皮-間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)是上皮細胞失去極性，經過細胞骨架重塑轉變成具有遷移能力的間充質表型的過程。多項研究證實，EMT是腫瘤侵襲轉移的一個重要步驟[12]，且EMT被認為是腫瘤轉移的標志[13]，可以增加HCC的遷移及侵襲能力[14]，其主要的特征為通過Wnts和Notch信號通路，致使E-cadherin表達減少、vimentin增加。

本研究通過檢測miR-616在HCC組織及不同分化的HCC細胞系的表達，初步探討HCC中miR-616的表達情況及對EMT的影響。

1 材料和方法

1.1 腫瘤組織標本來源

收集2006-01～2009-12期間于西安交通大學附屬第一、二醫(yī)院40例HCC患者的腫瘤組織及癌旁組織(規(guī)定距癌組織2 cm以上)，患者接受手術切除前未接受任何抗腫瘤治療。所有組織標本均保存于液氮備用。本實驗與所有患者或家屬進行充分溝通并簽署試驗知情同意書。

1.2 細胞株及細胞培養(yǎng)

人正常肝細胞株LO2及6種HCC細胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC97L、HCCLM3和MHCC97H(購自中國科學院上海細胞庫)，均培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基(購自HyClone，含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素)中。將對數(shù)生長的細胞懸液均勻地分布于25 cm×25 cm細胞培養(yǎng)瓶中，其中含5 ml培養(yǎng)液，細胞密度為5×104個/ml，每周傳代2次，置于5% CO2、37 ℃的孵箱中培養(yǎng)。

1.3 實時定量PCR(qPCR)分析miR-616表達情況

利用Trizol(購自Life Technologies)從HCC組織或細胞提取總RNA。使用TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒(購自Applied Bio systems)對miR-616進行定量PCR擴增，U6作為內參照。結束后經CFX Manage軟件(美國Bio-Rad)分析，采用2-ΔCt方法計算miR-616相對表達量。

1.4 細胞轉染Hep3B及MHCC97H細胞

miR-616表達載體(HmiR0186-MR04)、miR-616對照載體(CmiR0001-MR04)、miR-616抑制劑(HmiR-AN0721-AM03)和miR-616抑制劑陰性對照(CmiR-AN0001-AM03)，均購自中國GeneCopoeia。上述載體插入SMAD7質粒(pCMV5-SMAD7，購自美國Addgene公司)。用Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen公司)技術將SMAD7質粒轉染Hep3B及MHCC97H細胞并進行相關檢測。

1.5 Western blot實驗檢測EMT

取轉染后的Hep3B及MHCC97H細胞，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗2次，用RIPA裂解緩沖液(購自Bio-Med公司)抽提蛋白。利用BCA法測定蛋白濃度，每孔加樣30 μg，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到PVDF膜。加入一抗稀釋液(購自美國Cell Signaling)：E-cadherin (1 ∶1 000)、vimentin (1 ∶1 000) 和β-actin(1 ∶1 500)，4 ℃過夜。 TBST漂洗膜后，每孔加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗(1∶10 000；購自美國Bio-Rad公司)室溫孵育，并用凝膠成像系統(tǒng)檢測(美國Bio-rad公司)，Image-Pro Plus軟件分析吸光度(A)值。β-actin作為內參，實驗重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 HCC組織及細胞中miR-616的表達顯著升高

與對應的癌旁組織相比，miR-616在40例HCC組織中的相對表達顯著升高(0.031±0.043vs0.12±0.078，P<0.01，圖1A)。

HCC細胞株Hep3B、HepG2、Huh7、MHCC97L、HCCLM3及MHCC97H和人正常肝細胞株LO2相比，6種HCC細胞株的miR-616表達水平均顯著高于人正常肝細胞株LO2(Hep3B:1.78±0.08,HepG2:1.82±0.09,Huh7:1.61±0.04,MHCC97L:2.32±0.10,HCCLM3:4.35±0.15,MHCC97H:4.41±0.16vsLO2:1.02±0.05,P<0.01)；并且HCCLM3及MHCC97H兩種高轉移特性HCC細胞株的miR-616表達水平又明顯高于低轉移特性Hep3B、HepG2、Huh7和MHCC97L細胞株(P<0.01，見圖1B)。說明miR-616在HCC中明顯升高，且與其轉移特性具有相關性。

圖1 MiR-616在HCC組織及各細胞株中的表達Figure 1 The miR-616 expression in different HCC tissues and different cells

2.2 miR-616對HCC細胞EMT的影響

在低轉移特性Hep3B細胞中轉染HmiR0186-MR04及CmiR0001-MR04，可以看到miR-616表達水平相對于對照組明顯升高(16.32±0.98vs1.01±0.05，P<0.01，見圖2A)；在高轉移特性MHCC97H細胞中轉染HmiR-AN0721-AM03及CmiR-AN0001-AM03，可以看到miR-616表達水平相對于對照組明顯降低(1.05±0.09vs7.23±1.01，P<0.01，見圖2B)。

在Hep3B細胞中過表達miR-616后，E-cadherin的表達水平顯著降低(1.00±0.01vs0.33±0.02，P<0.01)和vimentin表達增加(1.01±0.02vs3.78±0.52，P<0.01,見圖3)。在MHCC97H細胞中抑制miR-616的表達，E-cadherin的表達水平顯著升高(1.03±0.01vs2.73±0.22，P<0.01)和vimentin表達降低(1.03±0.01vs0.21±0.02，P<0.01，見圖4)。這些結果表明，HCC細胞中miR-616可以促進其EMT。

圖2 HCC細胞進行相關轉染后miR-616的表達情況Figure 2 The expression of miR-616 in different HCC cells after transfection

圖3 miR-616對于HCC細胞中E-cadherin及vimentin的影響Figure 3 Effects of miR-616 on E-cadherin and Vimentin in HCC cells

圖4 沉默miR-616后MHCC97H細胞中E-cadherin及vimentin表達Figure4 Expression of E-cadherin and Vimentin in MHCC97H cells after miR-616 silencing

3 討論

HCC的發(fā)生發(fā)展過程中有各種分子和眾多的信號轉導通路參與[15,16]。研究證實，microRNA的異常表達和功能在這個過程中發(fā)揮了關鍵作用[17]。microRNA是高度保守的含有19-24核苷酸序列的RNA分子，它能夠通過特異性結合mRNA，在轉錄后水平影響基因表達。

EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，腫瘤的浸潤生長存在EMT現(xiàn)象，可使腫瘤細胞表型改變，從而使其獲得浸潤和轉移的能力[18]，而E-cadherin和vimentin分別是上皮細胞和間質細胞的重要生物標志物[19]。在胰腺癌[18]、乳腺癌[20]、前列腺癌[21]、宮頸癌[22]、肺癌[23]等研究中發(fā)現(xiàn)，E-cadherin表達降低，vimentin表達上升，表明腫瘤中存在E-cadherin向vimentin轉化的EMT現(xiàn)象。

本研究初步觀察了HCC中的miR-616表達情況。HCC與對應癌旁組織之間miR-616表達水平存在差異(P<0.01)；HCCLM3及MHCC97H細胞株具有高轉移性，而Hep3B、HepG2、Huh7和MHCC97L為低轉移HCC細胞株。高、低轉移特性HCC細胞株及人正常肝細胞株LO2之間miR-616表達的差異具有統(tǒng)計學意義，HCC細胞株的miR-616表達高于LO2細胞株，而具高移特性HCC細胞株的miR-616表達又高于低轉移特性HCC細胞株(P<0.01)，該結果提示，miR-616可以增強HCC細胞的侵襲能力。而EMT被認為是腫瘤轉移的標志[13]，EMT增加可以促進HCC的遷移及侵襲能力[14]。本研究在低轉移特性的Hep3B細胞中過表達miR-616，可降低E-cadherin的表達(P<0.01)和增加vimentin的表達(P<0.01)，說明高表達miR-616可以促進Hep3B的EMT，也就可認為促進HCC的遷移及侵襲能力；在MHCC97H細胞中抑制miR-616的表達，可增加E-cadherin的表達(P<0.01)和降低vimentin的表達(P<0.01)，說明低表達miR-616可以抑制MHCC97H的EMT，也就可認為降低HCC的遷移及侵襲能力。該結果表明，miR-616可以通過EMT而改變HCC的轉移能力。

而以往研究發(fā)現(xiàn)Snail、Zeb等轉錄因子及GATA3抑制轉錄因子相互反饋作用而影響EMT[24]，且相關研究中發(fā)現(xiàn)miRNA可通過靶向EMT中的轉錄因子而改變腫瘤的轉移和侵襲能力，p53可誘導miR-34a和miR-192，進而抑制Snail-1和Zeb-2的表達，阻止EMT進程，而miR-200通過抑制轉錄因子GATA3的表達促進EMT進程。而本實驗中miR-616對于EMT信號通路的影響，可能與GATA3相關，需要在進一步研究中予以發(fā)現(xiàn)證實。

綜上所述，本研究結果從臨床病理資料及體外細胞轉染實驗的水平表明，在HCC中miR-616的表達明顯升高，并且與EMT相關。因此，miR-616可以作為一種有價值的臨床標志物，靶向干預miR-616，可以影響HCC的EMT，從而影響其遷移及侵襲能力。

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Expression of microRNA-616 and its effects on epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma

ZHANG Li1, ZHANG Di1, LI Xiaobin2, WANG Wei2, SUN Xuejun2, LI Jie1, LI Junhui1*

(1DepartmentofGeneralSurgery,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;2DepartmentofGeneralSurgery,FirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:ljh991049@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of microRNA-616(miR-616) in hepatocellular carcinoma(HCC), and to explore its relationship with epithelial-mesenchymal transition(EMT) of HCC and its clinical significance.MethodsThe miR-616 expression was detected by real-time quantitative PCR method in specimens of primary cancer and their adjacent non-cancerous tissues from 40 HCC patients and in HCC cells with different differentiation degree. The miR-616 was transfected into Hep3B cells and miR-616 inhibitor was transfected into MHCC97H cells, and then the expression of miR-616 was detected by luciferase reporter assay and the levels of E-cadherin, vimentin were detected by Western blot.ResultsThe expression level of miR-616 in tumor tissues was significantly higher than that of the corresponding adjacent cancer tissues(0.12±0.078vs0.031±0.043,P<0.01). The expression level of miR-616 was significantly higher in 6 kinds of HCC cells than in normal human liver cell line L02(P<0.01). The expression level of E-cadherin was reduced and vimentin was elevated in Hep3B cells with miR-616 overexpression vector transfected(P<0.01). The expression level of E-cadherin was elevated and vimentin was reduced in MHCC97H cells transfected with miR-616 inhibitor(P<0.01).ConclusionMiR-616 can be used as a valuable biomarker for HCC, and it can affect the EMT of HCC by targeting miR-616.

microRNA-616; hepatocellular carcinoma; epithelial-mesenchymal transition; tumor metastasis

陜西省社會發(fā)展科技攻關基金資助項目(2016SF-137)

張立，男，1979-02生，博士，主治醫(yī)師

2016-05-30

R735.7

A

1007-6611(2016)09-0795-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.003