桂枝湯方劑不同提取部位免疫抑制活性的考察

曾俊芬，王新桂，魯建武，宋金春

(1.武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北 武漢　430060；2.湖北省中醫(yī)院藥事部，湖北 武漢　430061)

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桂枝湯方劑不同提取部位免疫抑制活性的考察

曾俊芬1，王新桂2，魯建武1，宋金春1

(1.武漢大學人民醫(yī)院藥學部，湖北 武漢430060；2.湖北省中醫(yī)院藥事部，湖北 武漢430061)

目的篩選桂枝湯方劑免疫抑制活性部位。方法處方藥材分別水煎濃縮為水提部位，乙醇提取為乙醇提取部位。同時將乙醇部位分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部和正丁醇部位。CCK-8法考察桂枝湯不同提取物對ConA激活T細胞和LPS激活B細胞增殖的抑制作用。同時用二硝基氯苯對昆明種小鼠皮膚致敏和誘發(fā)，制成遲發(fā)型超敏反應模型，觀察桂枝湯方劑不同部位對遲發(fā)型超敏反應的干預作用。結(jié)果桂枝湯方劑水提物、乙醇提取物、石油醚萃取部位有顯著免疫抑制功效，乙醇和石油醚提取物效果最佳。濃度200 mg·L-1時T細胞增殖抑制率分別為48.3%、45.9%，B細胞抑制率大于30%。乙醇提取物、石油醚萃取部位對遲發(fā)型超敏反應小鼠耳廓腫脹有顯著抑制作用，對胸腺和脾臟無明顯影響。結(jié)論桂枝湯方劑乙醇提取物和石油醚萃取物為免疫抑制活性部位，能顯著抑制T細胞和B細胞的增殖，抑制小鼠耳廓腫脹，對正常細胞、胸腺、脾臟無毒性。

桂枝湯/分析;化學分餾法;超敏反應,遲發(fā)型;催化域

桂枝湯來源于《傷寒論》，該方由桂枝、生姜、甘草、白芍、大棗組成，有解肌發(fā)表，調(diào)和營衛(wèi)的功效。臨床上常將桂枝湯用來抗過敏反應和抑制炎癥，以及治療風濕等疾病[1]。過敏反應、風濕等屬于自身免疫性疾病，有研究表明桂枝湯可通過免疫抑制和抗炎作用達到抗過敏治療風濕的作用[2-4]，但并未有其活性部位的研究報道。免疫抑制作用被廣泛應用于控制一些異常的免疫應答反應，中藥來源的免疫抑制劑有作用廣、毒性小、藥價低等特點，開發(fā)與研究中藥的免疫抑制作用，具有廣闊前景。本文以免疫抑制作用為考察指標對桂枝湯不同部位的免疫抑制活性進行了探討。

1　材料

1.1實驗動物BALB/c小鼠，體重18～20 g，4～6周齡，購自華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心，動物合格證號:SCXK(鄂) 2014-0013。清潔級雄性昆明小鼠，體重(20±2)g，購自武漢大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK(鄂)2015-0007。

飼養(yǎng)溫度(22±1) ℃，濕度(55±5)%，12 h光暗循環(huán)。飼料和水均在消毒后由動物自由攝取，所有實驗均嚴格按照實驗動物有關條例進行。

1.2藥物及試劑桂枝(批號20141103)、生姜(批號20150201)、甘草(批號20141005)、白芍(批號20141010)、大棗(批號20150304)均購于湖北天濟中藥飲片有限公司；RPMI Medium 1640 培養(yǎng)基(Gibco，批號：11875093)；二甲基亞砜(DMSO，上海國藥)；小牛血清(Logan)；刀豆蛋白A(Con A，Sigma，批號：C5275)；LPS(Sigma，批號：L2630)；CCK-8(碧云天生物技術研究所，批號：C0038)。2,4-二硝基氯苯(DNCB)(上?；瘜W試劑公司，批號：20140317)，地塞米松磷酸鈉注射用粉針(浙江仙琚制藥股份有限公司，批號：140208)。

1.3儀器設備CO2培養(yǎng)箱：德國Heraeus公司；SW-C型超凈工作臺：上海錦屏儀器儀表有限公司；SPECTRAMAX Plus型酶標儀：美國Molecular Devices；TL-18M臺式高速冷凍離心機：上海市離心機械研究所；BL150S電子天平：德國Sartorius；直徑8 mm的金屬打孔器。

2　方法

2.1藥品制備按桂枝湯處方配齊藥物(桂枝10 g、芍藥 10 g 、生姜 10 g 、甘草 7 g 、大棗 10 g)47 g，水煎2次合并藥液，過濾濃縮為水提部位8.5 g(浸膏得率18.1%)備用。另按方將藥物粉碎(235 g)，95%乙醇室溫提取3次，每次一周，提取液減壓濃縮后得乙醇提取部位39 g(得率16.6%)，取適量乙醇提取部位備用。其余乙醇提取部位用熱水混懸，分別用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、 正丁醇溶液萃取并減壓濃縮各萃取液，分別得石油醚部位6.1 g干浸膏、氯仿部位3.8 g干浸膏、乙酸乙酯部6.7 g干浸膏和正丁醇部位7.6 g干浸膏。

2.2小鼠脾淋巴細胞懸液的制備BALB/c小鼠，頸椎脫臼處死后摘取脾臟，PBS清洗后放至Mesh網(wǎng)上研磨，1500 rpm離心15 min，棄上清加入紅細胞裂解液3 mL，混勻并避光5 min，再加入7 mL PBS終止裂解液，1 800 r·min-1，離心10 min，棄上清，加入含小牛血清的RPMI-1640 3 mL混勻，吸取10 μL混懸液，加入90 μL臺酚藍染色計數(shù)，細胞活率達95%以上，制成密度為5×109個·L-1的脾淋巴細胞。

2.3CCK-8法檢測化合物對小鼠脾臟淋巴細胞活性的影響[5]實驗分為空白對照組(100 1500 rpmμL細胞懸液+100 μL RPMI-1640)，細胞毒實驗組(100 μL細胞懸液+50 μL化合物+50 μL RPMI-1640)，ConA對照組(100 μL細胞懸液+50 μL ConA+50 μL RPMI-1640)，LPS對照組(100 μL細胞懸液+50 μL LPS+50 μL RPMI-1640)，T細胞實驗組(100 μL細胞懸液+50 μL ConA+50 μL萃取物)，B細胞實驗組(100 μL細胞懸液+50 μL LPS+50 μL萃取物)。實驗組各部位取適量干浸膏，DMSO溶解后再RPMI-1640稀釋至所需濃度。

小鼠脾臟淋巴細胞懸液2.5×106/孔接種于96孔板，加入ConA(終濃度5 mg·L-1)，加入LPS(終濃度10 mg·L-1)，同時加入不同部位提取物(濃度分別為10、50、200 mg·L-1)，并設相應的無ConA、LPS對照孔以及無藥物對照孔(建立ConA激活的T細胞增殖模型和LPS激活的B細胞增殖模型)，每組濃度設3個孔。放置于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，結(jié)束培養(yǎng)前8～10 h加入CCK-8溶液。至培養(yǎng)結(jié)束，于酶標儀450 nmol·L-1(參比650 nmol·L-1)處測定OD值。分別計算細胞存活率和細胞增殖抑制率，當抑制率大于10%即可考慮有免疫抑制活性的趨勢。通過檢測T細胞和B細胞的變化，反映受試藥物對免疫調(diào)節(jié)的影響，從而說明桂枝湯不同部位的免疫抑制作用，結(jié)果見表1。

細胞存活率=(試驗組OD平均值 / 空白對照組OD平均值)×100%

抑制率=[(試驗組OD平均值-對照組OD平均值) /對照組OD平均值] ×100%

2.4遲發(fā)型超敏反應小鼠模型[6]將小鼠隨機分為8組，每組10只，分別為模型組、水提組、乙醇提組、石油醚萃取組、氯仿萃取組，乙酸乙酯萃取組、正丁醇萃取組、陽性對照組(地塞米松)。各組小鼠每天給藥一次，連續(xù)給藥7 d。實驗第1天將各組小鼠腹部刮毛面積約2 cm×2 cm，第2天和第3天于刮毛部位涂5%二硝基氯苯(DNCB)丙酮溶液。第7天用1%DNCB丙酮溶液涂布于左耳進行攻擊，右耳涂布丙酮溶液作為對照。攻擊24 h后(即第8天)于給藥后1 h，小鼠處死，用打孔器在左右耳同一位置打下兩只耳片，并取出胸腺及脾臟，稱重，計算腫脹度，胸腺和脾臟指數(shù)。

表1　桂枝湯方劑不同部位對T細胞和B細胞增殖的抑制率

注：與對照組比較,aP<0.05,bP<0.01。

3　結(jié)果

3.1桂枝湯方劑對免疫細胞增殖的抑制作用實驗結(jié)果如表1所示，所有部位在高濃度時對ConA誘導的T細胞增殖均有一定的免疫抑制功效。除氯仿和乙酸乙酯萃取物，其它部位對LPS誘導B細胞增殖也有不同的抑制作用。水提物、乙醇提物、石油醚萃取部位高濃度時均能顯著抑制T細胞增殖，尤其乙醇提取物和石油醚萃取物在50和200 mg·L-1時抑制效果相當，對T細胞抑制率分別大于30%和45%(P<0.05；P<0.01)，在200 mg·L-1時對B細胞抑制率大于30%(P<0.05)，同時結(jié)果還顯示所有部位對正常細胞沒有影響。

3.2對遲發(fā)型超敏反應小鼠的作用實驗結(jié)果表明桂枝湯方劑的乙醇提物、石油醚萃取物能減輕小鼠耳廓的腫脹程度，與模型組相比這兩組耳廓腫脹度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明對小鼠的變應性接觸性皮炎有明顯的改善作用。而桂枝湯方劑各組對免疫器官胸腺和脾臟無顯著抑制作用(表2)。

表2　桂枝湯方劑對遲發(fā)型超敏反應小鼠的影響

注：與模型組比較，aP<0.05,bP<0.01。

4　討論

脾臟是機體重要的免疫器官，是成熟的T、B 細胞存在和參與免疫應答的重要場所。脾內(nèi)淋巴細胞中T細胞占約40%，B細胞占約55%，因此體外培養(yǎng)小鼠原代脾淋巴細胞被認為是研究淋巴細胞比較合適的方法。ConA和脂多糖(LPS)作用于脾細胞，可分別刺激T淋巴細胞和B淋巴細胞增殖，是用來檢測兩種細胞功能的常規(guī)方法。CCK-8法靈敏度高，數(shù)據(jù)可靠，重現(xiàn)性好，且對細胞毒性低，已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。本課題中運用CCK-8法對植物提取物進行活性篩選，能快速檢測試藥對小鼠脾臟淋巴細胞活性的影響。實驗結(jié)果顯示氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物高濃度時(200 mg·L-1)也有一定抑制作用，但低劑量時對B細胞增殖幾乎無影響。水提物、乙醇提物、石油醚萃取部位ConA誘導的T細胞增殖和LPS誘導B細胞增殖均有顯著抑制作用，且乙醇和石油醚的活性優(yōu)于水提物。

2,4-二硝基氯苯誘導的遲發(fā)型超敏反應是一種皮膚接觸小分子半抗原所引起的接觸性超敏反應，是T細胞介導的炎癥反應。本研究采用這種典型的遲發(fā)型超敏反應的動物模型，以期追蹤其該作用的活性部位。結(jié)果顯示桂枝湯方劑的乙醇提物、石油醚萃取物對遲發(fā)型超敏反應引起的小鼠變應性接觸性皮炎有明顯的改善作用，提示桂枝湯方劑抑制遲發(fā)型超敏反應的免疫抑制作用部分為乙醇提物和石油醚萃取部分。

水提物是桂枝湯處方各藥材經(jīng)過高溫煎煮得到，藥材在煎煮過程中高溫對各藥材中的成分產(chǎn)生影響，其有效成分會隨高溫減少發(fā)生化學變化，影響藥效。乙醇提取物是在室溫條件下提取，溫度未對各藥材成分產(chǎn)生影響，且三次提取能較完全將藥材中有效成分提取，因而其藥效得以充分發(fā)揮。本試驗中乙醇提取部位用極性由低到高的不同溶劑萃取，得到不同極性的部位，易使極性相同的活性成分富集而使不同部位產(chǎn)生不同活性。桂枝湯方劑中主要藥材為桂枝、生姜、甘草、白芍等，桂枝主要成分為桂皮醛、桂皮酸、醋酸苯丙酯、醋酸桂皮脂、肉桂醇、香豆素等揮發(fā)油[7]，研究發(fā)現(xiàn)桂枝揮發(fā)油有免疫抑制功能[8-9]；生姜中含有有α-姜烯、反-β-金合歡烯、α-金合歡烯、β-紅沒芍烯等揮發(fā)油，有抗炎作用，且能抑制T細胞增殖的免疫抑制作用[10]，同時桂枝湯方劑中的甘草含有甘草素、甘草查耳酮A和甘草酸具有抗炎抗變態(tài)的作用[11]，白芍中主要成分為白芍苷，其具有較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[12]。石油醚極性較低，萃取桂枝湯乙醇提取部位時易將其中低極性的揮發(fā)油成分富集在石油醚部位，石油醚萃取部位可能因富含揮發(fā)油而免疫抑制活性優(yōu)于其他萃取部位。

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Screening for immunosuppressive function on different fraction of Guizhi Decoction

ZENG Junfen1,WANG Xingui2,LU Jianwu1,et al

(1.DepartmentofPharmacy,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China;2.DepartmentofPharmacy,HubeiProvincialHospitalofTCM,Wuhan430061,China)

ObjectiveTo screen the immunosuppressive fraction of Guizhi decoction.MethodsMedicinal materials of Guizhi decoction was extracted by water and ethanol to get water extraction and ethanol extraction.Ethanol extraction was extracted with petroleum ether,chloroform,ethyl acetate,n-butanol to get petroleum ether fraction,chloroform fraction,ethyl acetate fraction,and n-butanol fraction respectively.CCK-8 method was used to detect the activity of different extracts on lymphocytes in the spleen of mice.ConA and LPS were added to the spleen cells of BALB/c mice to activate T cells and B cells respectively.Different extracts of Guizhi decoction were added to the activated spleen cells to investigate the immunosuppressive effect.The model of delayed-type hypersensitivity was established by sensitizing the skin of Kunming mice with DNCB.Effects of different fractions of Guizhi decoction were observed on delayed-type hypersensitivity mice.ResultsWater extraction,ethanol extraction and petroleum ether fraction had significant immunosuppression.Ethanol extraction and petroleum ether fraction showed the greatest activities with inhibitory rates of T cells 48.3% and 45.9%,and B cells inhibitory rate was more than 30% at the concentration of 200 mg·L-1.Ethanol extraction and petroleum ether fraction could alleviate obviously the degree of swollen-auricle of mice and without significant influence on spleen and thymus.ConclusionsThe ethanol extraction and petroleum ether fraction were the main immunosuppressive fraction,which could significantly inhibit the proliferation of T and B cells and alleviate the swollen-auricle of mice without toxicity to normal cells and spleen and thymus.

Guizhi decoction/analysis;Chemical fractionation;Hypersensitivity,delayed;Catalytic domain

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.09.004

2016-03-23，

2016-06-11)