梁志遠(yuǎn)， 甘秀海， 楊小生，吳　英， 黃　玉

( 1. 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550018； 2. 貴州省、中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550002 )

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響應(yīng)面法優(yōu)化干花豆總黃酮提取工藝研究

梁志遠(yuǎn)1， 甘秀海1， 楊小生2*，吳英1， 黃玉1

( 1. 貴州師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550018； 2. 貴州省、中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室， 貴陽 550002 )

干花豆(Fordiacauliflora)的主要有效成分為黃酮類、生物堿、有機(jī)酸等，具有益智、抗衰老、抗炎等作用。目前的研究主要集中在化學(xué)成分及藥理活性等方面，對總黃酮成分提取工藝優(yōu)化報道較少。該研究以新鮮干花豆為材料，以總黃酮提取量為評價指標(biāo)，在提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時間單因素實驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化了干花豆總黃酮提取工藝，同時測定了總黃酮對1, 1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)清除能力。結(jié)果表明：干花豆總黃酮提取最佳工藝條件為提取溫度78 ℃、料液比為1∶30(g·mL-1)、乙醇濃度71%和提取時間為187 min。在此條件下，總黃酮得率預(yù)測值為10.61 mg·g-1，實際為10.53 mg·g-1，理論值與預(yù)測值的相對誤差為0.76%；干花豆總黃酮對DPPH和OH自由基清除能力IC50值分別為14.09和78.43 μg·mL-1，弱于Vc(8.11和67.95 μg·mL-1)。該提取工藝穩(wěn)定合理，準(zhǔn)確可靠，是提取干花豆總黃酮的可行方法。該研究結(jié)果為干花豆中總黃酮成分的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

干花豆, 總黃酮, 響應(yīng)面法, 抗氧化性

干花豆(Fordiacauliflora)為豆科蝶形花亞科干花豆屬植物，又名水羅傘、玉郎傘、野京豆等，有很高藥用價值，主要分布于兩廣和云南。廣西的壯、瑤族用于風(fēng)濕骨痛、跌打損傷、骨折、小兒癡呆、小兒疳積、肌痿癥、體虛及產(chǎn)婦身體復(fù)元等癥(廣西衛(wèi)生廳，1963；廣西衛(wèi)生局，1974)。近代藥理研究表明，干花豆有抗衰老(韋奇智等，2003)、抗炎(湯祖青等，2003)、抗氧化(吳植強(qiáng)等，2004)等功效。干花豆中含有多種有效成分，已從中分離得到多個黃酮(戴斌等，2003；戴向東等，2003；梁志遠(yuǎn)等，2006)化合物，對其總黃酮提取方法有些報道(李光儀等，2006；黃錦威等，2008)，但系統(tǒng)性研究目前尚未見。

為了充分利用我國的藥用植物資源，本研究用乙醇回流法提取干花豆總黃酮，探討了提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時間等因素對總黃酮得率的影響，通過響應(yīng)面分析(response surface methodology，RSM)進(jìn)行提取條件優(yōu)化，并測定總黃酮對1, 1-二苯基苦基苯肼自由基(DPPH·)和羥基自由基(·OH)的清除作用，旨在為干花豆總黃酮的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 原料及處理方法干花豆采自云南西雙版納，經(jīng)昆明植物研究所崔景云高級工程師鑒定。將新鮮干花豆切片自然風(fēng)干，粉碎后過40 目篩，50 ℃恒溫烘干4 h，干燥器中冷卻待用。1.1.2 試劑與儀器蘆丁對照品(>98%)，貴州省迪大科技有限責(zé)任公司；1, 1-二苯基苦基苯肼(DPPH)，美國SIGMA 公司；其余試劑均為分析純。UV2450紫外-可見分光光度計，日本島津公司；BSA124S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器公司；HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器，金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁對照品溶液制備及測定波長選定參照孫春艷等(2006)的方法，稍有改動。精密稱取經(jīng)干燥恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用60%的乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，即得濃度為0.20 mg·mL-1蘆丁對照品溶液。移取蘆丁對照品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加入1.0 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；再加入1.0 mL 10% Al(NO3)3溶液，搖勻，靜置6 min；再加入5 mL 4%NaOH溶液，用60%乙醇定容至刻度，搖勻，靜置15 min，變化波長在400～600 nm測定吸光度(A)。由于在504 mn時具有最大A值，所以確定504 mn為工作波長。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制分別精密移取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只25 mL容量瓶中，按“1.2.1”項下方法測定A。以A為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)吸收曲線?；貧w方程式：A= 0.0101C+ 0.0383，相關(guān)系數(shù)r=0.9996，說明蘆丁在0.004～0.040 mg·mL-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

1.2.3 總黃酮提取及含量測定精確稱取干花豆粉末1.00 g于100 mL具塞錐形瓶中，按一定的料液比、乙醇濃度，提取溫度和提取時間下進(jìn)行總黃酮提取，趁熱過濾，定容至50 mL，即干花豆總黃酮提取液。精密移取1.0 mL干花豆總黃酮提取液，按“1.2.1”項下方法測定其吸光度，計算總黃酮含量。

1.2.4 單因素試驗在保持其他條件不變的情況下，分別以不同的提取溫度(50、60、70、80 ℃)、料液比(1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 )、乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)和提取時間(120、150、180、210、240 min)為單因素，考察各因素對干花豆總黃酮得率的影響。

1.2.5 總黃酮提取工藝的優(yōu)化根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理(任雪峰等，2014)，在單因素試驗結(jié)果最優(yōu)水平基礎(chǔ)上，以提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時間4個因子為自變量(分別以X1、X2、X3、X4表示)，以總黃酮得率作為響應(yīng)值，采用四因子三水平的響應(yīng)面法進(jìn)行試驗。響應(yīng)面因素和水平取值見表1。

表 1　響應(yīng)面試驗因素水平表

1.2.6 總黃酮對DPPH·清除率的測定參照陳建平等(2012)的方法，用無水乙醇配制一系列濃度的干花豆總黃酮溶液，精密移取干花豆總黃酮和0.2 mmol·L-1的DPPH·無水乙醇溶液各2 mL于10 mL比色管中，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm處測其吸光值(Ai)，用無水乙醇代替干花豆總黃酮溶液，測定其吸光值(Ao)，用2 mL無水乙醇代替DPPH乙醇溶液，測定其吸光值(Aj)。用一系列濃度的Vc溶液代替干花豆總黃酮溶液。平行測定3次，取其平均值。計算公式：

DPPH·清除率(%) = [1-(Ai-Aj)/Ao]×100

1.2.7 總黃酮對·OH清除率的測定參考陳建平等(2012)的方法，稍有改動。10 mL比色管中加入pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液(PBS)2 mL、1.5 mmol·L-1鄰二氮菲溶液1.5 mL和1 mL蒸餾水，混合均勻后加入7.5 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液1 mL，混勻后再加入0.01% H2O21 mL，用蒸餾水定容至刻度，于37 ℃下恒溫反應(yīng)60 min，在536 nm處測其吸光度Ao，以1 mL 蒸餾水代替H2O2重復(fù)上述操作，測得吸光度A1，以1 mL一系列濃度的干花豆總黃酮溶液代替1 mL蒸餾水，測得吸光值A(chǔ)2。取磷酸鹽緩沖溶液2.0和8.0 mL蒸餾水于試管中，混勻作空白管。用一系列濃度的Vc溶液代替干花豆總黃酮溶液。平行測定3次，取其平均值。公式如下：

·OH清除率(%)=(A2-A0)/(A1-A0)×100

2　結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取溫度對總黃酮得率的影響由圖1可知，隨著提取溫度的升高，總黃酮得率隨著增加，70 ℃時達(dá)到最大值。因此，選擇70 ℃為提取溫度。

圖 1　提取溫度對總黃酮得率的影響Fig. 1　Effects of extraction temperature on total flavonoid yield

圖 2　料液比對總黃酮得率的影響Fig. 2　Effects of solid to liquid ratio on total flavonoids yield

圖 3　乙醇濃度對總黃酮得率的影響Fig. 3　Effects of ethanol concentrtation on total flavonoid yield

圖 4　提取時間對總黃酮得率的影響Fig. 4　Effects of extraction time on total flavonoid yield

2.1.2 料液比對總黃酮得率的影響由圖2可知，總黃酮得率隨著料液比的升高而上升，在1∶30時達(dá)到最大值，再提高料液比對提高得率沒有影響，選擇料液比為1∶30(g·mL-1)。

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響由圖3可知，隨著乙醇濃度的提高，總黃酮得率也隨著增加，在70%時達(dá)到最大值。因此，選擇乙醇濃度為70%。

2.1.4 提取時間對總黃酮得率的影響由圖4可知，隨著提取時間的增加，總黃酮得率不斷增加，在180 min時提取量達(dá)到最大值，再延長提取時間，得率反而下降。因此，提取時間選擇180 min。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計與結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果按照Box-Benhnken的中心組合試驗方案進(jìn)行了四因子三水平共29個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，29個試驗點分為24個析因點和5個零點對總黃酮的乙醇提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

2.2.2 模型的建立及顯著性檢驗利用Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到總黃酮得率(Y)對因素X1、X2、X3及X4相應(yīng)的二次方程模型：

Y=10.476-0.024A-0.093B+0.126C+0.537D-0.103AB-0.023AC+7.500AD+0.078BC+0.025BD-0.023CD-0.755A2-0.646B2-0.772C2-1.118D2

同時，對表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，其結(jié)果見表3。

由表3可知，該模型設(shè)計結(jié)果極顯著(P<0.001)，表明響應(yīng)值與預(yù)測值之間有良好的擬合度，回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9990，顯示響應(yīng)值的變化99.90%來源于X1(提取溫度)、 X2(料液比)、 X3(乙醇濃度)和X4(提取時間)4個變量； 同時失擬檢驗P>0.05， 說明未知因素對實驗結(jié)果影響較小。因此，該模型可用于預(yù)測干花豆總黃酮得率的實際情況。各因素中一次項X2、X3、X4及二次項X12、X22、X32、X42為極顯著，一次X1為顯著，交互項X2X3為極顯著，由此可見，各具體試驗因素對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系。由表3還可知，所選因素對響應(yīng)值影響強(qiáng)弱次序為X4>X3>X2>X1，即提取時間>乙醇濃度>料液比>提取溫度。

表 2　響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表 3　 回歸模型參數(shù)檢驗

注： ***差異極顯著(P<0.001)；**差異高度顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

Note： ***very significant differences(P<0.001)；**highly significant differences(P<0.01)；*significant differences(P<0.05).

圖 5　提取溫度(X1)和料液比(X2)交互作用對總黃酮得率(Y)的響應(yīng)面圖Fig. 5　Response surface plots showing the effects of extraction temperature (X1) and solid liquid ratio (X2) on total flavonoid yield (Y)

圖 6　提取溫度(X1)和乙醇濃度(X3)交互作用對總黃酮得率(Y)的響應(yīng)面圖Fig. 6　Response surface plots showing the effects of extraction temperature (X1) and ethanol concentration (X3) on total flavonoid yield (Y)

圖 7　提取時間(X4)和提取溫度(X1)交互作用對總黃酮得率(Y)的響應(yīng)面圖Fig. 7　Response surface plots showing the effects of extraction time (X4) and extraction temperature (X1) on total flavonoid yield (Y)

圖 8　料液比(X2)和乙醇濃度(X3)交互作用對總黃酮得率(Y)的響應(yīng)面圖Fig. 8　Response surface plots showing the effects of solidto liquid ratio (X2) and ethanol concentration (X3) on total flavonoid yield (Y)

圖 9　料液比(X2)和提取時間(X4)交互作用對總黃酮得率(Y)的響應(yīng)面圖Fig. 9　Response surface plots showing the effects of solidto liquid ratio (X2) and extraction time (X4) on total flavonoid yield (Y)

圖 10　乙醇濃度(X3)和提取時間(X4)交互作用對總黃酮得率(Y)的響應(yīng)面圖Fig. 10　Response surface plots showing the effects of ethanol concentration (X3) and extraction time (X4) on total flavonoid yield (Y)

2.2.3 響應(yīng)面分析及優(yōu)化在其它因素為零水平上選擇提取溫度、料液比、乙醇濃度、提取時間四個變量中的兩個交互因素對總黃酮得率的影響進(jìn)行分析，回歸優(yōu)化響應(yīng)面分別見圖5-10。

由圖5-10可知，此實驗?zāi)Ｐ投寄苓_(dá)到極值點。為確定最佳響應(yīng)值的因素水平組合，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行分析，得出優(yōu)化條件為提取溫度77.8 ℃，料液比1∶29.4(g·mL-1)，乙醇濃度70.6%，提取時間187.2 min，考慮到實際操作性，將工藝參數(shù)修正為提取溫度78 ℃，料液比1∶30(g·mL-1)，乙醇濃度71%，提取時間187 min。

2.2.4 驗證性試驗采用修正后優(yōu)化工藝參數(shù)條件按“1.2.3”項下方法，重復(fù)三次試驗，干花豆總黃酮得率為10.53 mg·g-1，此條件下干花豆總黃酮的理論預(yù)測得率為10.61 mg·g-1，兩者相比，相對誤差為0.76%，說明響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果可靠。

2.3 抗氧化能力的測定結(jié)果

根據(jù)1.2.6項和1.2.7項下的方法，測定不同濃度干花豆總黃酮樣品對DPPH和OH自由基的消除能力，利用Origin軟件處理數(shù)據(jù)得到樣品消除DPPH和OH自由基的半數(shù)抑制率IC50值分別為14.09和78.43 μg·mL-1，弱于陽性對照Vc (8.11和67.95 μg·mL-1)。

3　結(jié)論

用乙醇提取干花豆總黃酮，在考察提取溫度、料液比、乙醇濃度和提取時間對總黃酮提取量影響的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，得到最佳提取工藝條件為：提取溫度78 ℃，料液比1∶30(g·mL-1)，乙醇濃度71%，提取時間187 min。此條件下干花豆總黃酮得率為10.53 mg·g-1。該提取工藝穩(wěn)定合理，準(zhǔn)確可靠，是提取干花豆總黃酮的可行方法。同時，抗氧化活性測定結(jié)果顯示，干花豆總黃酮對DPPH和OH自由基均有較好的清除能力。本研究為干花豆的進(jìn)一步開發(fā)及天然抗氧化劑的應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。

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Optimization of extracting total flavonoids fromFordiacaulifloraby response surface methodology

LIANG Zhi-Yuan1, GAN Xiu-Hai1, YANG Xiao-Sheng2*, WU Ying1, HUANG Yu1

( 1.SchoolofChemistryandLifeSciences,GuizhouNormalCollege, Guiyang 550018, China; 2.KeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences, Guiyang 550002, China )

Fordiacauliflorais the genusFordiain the family Leguminosae, which contains flavonoids, alkaloids, organic acids and so on, possesses various activities such as beneficial wisdom, anti-aging, anti-inflammatory. The current research ofF.caulifloramainly focuses on the study of chemical constituents and pharmacological activities, there is little report about the optimization of extraction process of flavonoids. In order to determine the best extraction technology of total flavonoids fromF.caulifloraand evaluate their antioxidant activity, the extraction temperature, solid-liquid ratio, ethanol concentration and extraction time as single factor were tested and then the extraction process of the total flavonoids fromF.cauliflorawas optimized by response surface designs based on single factor experiments. In addition， the antioxidant activity of flavonoids fromF.cauliflorawas measured by using 1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl radical (DPPH·) and hydroxyl radical (·OH) scavenging. The results showed that total flavonoids of optimum extraction conditions ofF.cauliflorawere as follows: extraction temperature 78 ℃, solid-to-liquid ratio of 1∶30(g·mL-1), the alcohol concentration for 71 %, extraction time 187 min. Under these conditions, an extraction rate of 10.53 mg·g-1for total flavonoids fromF.cauliflorawas obtained, compared with the predictive value of 10.61 mg·g-1， the relative error was 0.76% . The IC50values of scavenging DPPH and OH radical were 14.09 and 78.43 μg·mL-1, weaker than that of Vc(8.11 and 67.95 μg·mL-1). The extraction process was stable and reasonable, accurate and reliable, and it can be used to extract the total flavonoids fromF.cauliflora. The results will provide basis for the further development and utilization of flavonoids ofF.cauliflora.

Fordiacauliflora, flavone, response surface methodology, antioxidant activity

10.11931/guihaia.gxzw201502004

2015-02-03

2015-05-27

貴州省應(yīng)用化學(xué)特色重點學(xué)科 (黔教科研發(fā)[2012]442號)； 貴州省教育廳特色重點實驗室項目 (黔科合KY[2012]005號)[Supported by the characteristic key discipline of applied chemistry in Guizhou Province (2012-442); the Characteristic Key Laboratory Project of Education Department in Guizhou Province (2012-005)]。

梁志遠(yuǎn)(1959-)，女，福建南安人，教授，從事藥用植物成分研究，(E-mail) gzwh24000@sina.com。

楊小生，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向為天然藥物有機(jī)化學(xué)，(E-mail) yang_xiaosheng@yahoo.com。

Q946； R284.2

A

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